CN103439320A - 一种化学发光测定三聚氰胺的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于化学发光传感器领域，涉及利用目标诱导链释放技术，结合杂交链式反应和化学发光技术测定三聚氰胺（Me）的方法。当有目标物Me存在时，Me与功能化磁珠FMB1表面的双链DNA中的适体DNA1作用，释放出适体的互补序列DNA2。释放出来的互补序列DNA2与另一功能化的磁珠（FMB2）作用，在修饰HRP的发夹DNA（HRP-H1和HRP-H2）存在下进行链式杂交反应，使两种修饰的DNA生长成为一条长的双链DNA。通过磁性分离，再利用HRP对luminol-H2O2化学发光体系的催化作用产生化学发光，通过测定化学发光强度实现Me的测定。本方法具有高的选择性和检测灵敏度。
Description
技术领域
本发明属于分析化学和化学发光传感器领域，涉及利用目标诱导链释放技术，结合杂交链式反应和化学发光测定技术建立了一种测定三聚氰胺的方法。
背景技术
三聚氰胺（Melamine）（化学式：C3H6N6），俗称密胺、蛋白精，IUPAC命名为：1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，被用作化工原料。对身体有害，不可用于食品加工或食品添加物。
目前发展的三聚氰胺检测方法包括酶联免疫法（Choi J H, Kim Y T, Lee J H. Rapid quantification of melamine in milk using competitive 1,1'-oxalyldiimidazole chemiluminescent enzyme immunoassay. Analyst, 2010, 135:2445）、质谱法（Yang S P, Ding J H, Zheng J. Detection of melamine in milk products by surface desorption atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry. Analytical Chemistry, 2009, 81:2426）、表面增强拉曼光谱法（Hu H B, Wang Z H, Pan L. Ag-coated Fe3O4SiO2 three-ply composite microspheres: synthesis, characterization, and application in detecting melamine with their surface-enhanced Raman scattering. The Journal of Physical Chemistry C, 2010, 114:7738；Kim A, Barcelo S J, Williams R S, Li Z Y. Melamine sensing in milk products by using surface enhanced Raman scattering. Analytical Chemistry 2012, 84:9303）、纳米金颗粒比色法（Qi W J, Ling J, Huang C Z. Visual and light scattering spectrometric detections of melamine with polythymine-stabilized gold nanoparticles through specific triple hydrogen-bonding recognition. Chemical Communications, 2010, 46:4893；Ai K L, Liu Y L, Lu L H. Hydrogen-bonding recognition-induced color change of gold nanoparticles for visual detection of melamine in raw milk and infant formula. Journal of the American Chemical Society, 2009, 131:9496）和电化学方法（赵畅，余波，陈振兴，晋冠平，类分子印迹纳米多孔膜修饰电极制备三聚氰胺电化学传感器，食品科学，2012, 33214；Zhu H, Zhang S X, Li M X. Electrochemical sensor for melamine based on its copper complex. Chemical Communications, 2010, 46: 225）等。这些方法各有其优点，能不同程度的满足对三聚氰胺的检测要求，但方法或者灵敏度不高、或者需要昂贵的仪器。所以必须发展一种灵敏度高，简单的新型检测方法。
发明内容
基于目标诱导链释放和杂交链式反应化学发光测定三聚氰胺的方法的研究：当有目标物Me存在时，目标物与功能化磁珠表面的双链DNA中的适体DNA1作用，从而释放出适体的互补序列DNA2；释放出来的互补序列DNA2与另一功能化的磁珠作用，在修饰HRP的发夹 DNA（HRP-H1和HRP-H2）存在下进行链式杂交反应，使两种发夹 DNA生长成为一条长的双链DNA。通过磁性分离，再利用HRP对luminol-H2O2化学发光体系的催化作用产生化学发光，通过测定化学发光强度实现对Me的测定。
本发明是通过以下措施来实现的：基于目标诱导链释放和杂交链式反应化学发光测定三聚氰胺的方法的研究，其特征是包括以下步骤：
(1) 制备出FMB1和FMB2；
(2) 制备HRP修饰的H1和H2；
(3) 利用基于目标诱导链释放和杂交链式反应和化学发光检测技术对Me进行定量分析；
(4) 利用所建立的方法，对样品进行检测。
本发明所述的功能化磁性金纳米粒子（FMB1）制备包括以下步骤：将1.0 ml的磁性金纳米粒子用2.0 ml的0.1 M磷酸缓冲液（pH 7.0）洗涤3次，然后加入200 μl 1.0×10-5 M的DNA1和1.0×10-5 M的DNA2混合物，在37°C下反应12小时。最后将所得的功能化磁性金纳米粒子（FMB1）用2.0 ml的0.1 M的磷酸缓冲液洗涤3次，然后分散在2.0 ml磷酸缓冲液中，保存在4°C下备用。
本发明所述的功能化磁性金纳米粒子（FMB2）制备包括以下步骤：将1.0 ml的磁性金纳米粒子用2.0 ml的0.1 M磷酸缓冲液（pH 7.0）洗涤3次，然后加入100 μl 1.0×10-5 M的H1，在37°C下反应12小时。最后将所得的功能化磁性金纳米粒子（FMB2）用2.0 ml的0.1 M的磷酸缓冲液洗涤3次，然后分散在2.0 ml磷酸缓冲液中，保存在4°C下备用。
本发明所述的HRP修饰的H1和H2制备包括以下步骤：在100 μl 1.0×10-5 M的H1或H2的（pH为7.4的磷酸缓冲溶液）加入10 mg NHS，20 mg EDC，在37 °C下搅拌1小时。然后加入100 μl HRP，在37 °C下搅拌过夜，得HRP-H1或HRP-H2复合物。
一种对Me的检测的方法，其特征是：取Me标准溶液或的样品溶液50 μL加入到200 μL的FMB1溶液，37°C反应40分钟，然后混合物在磁力架上分离。将上述上清液转移到装有FMB2溶液的试管中。然后加入含有 5.0×10-7 M HRP-H1和 5.0×10-7 M HRP-H2溶液200 μL。在 37 ℃反应 1 h后进行磁分离，除去上清液。将磁珠用 100 μL磷酸缓冲溶液（pH 7.0）清洗两遍后，分散于1.0 ml磷酸缓冲溶液（pH 7.0）中，然后进行化学发光检测。
本发明所述的样品制备包括以下步骤：称取10 g鲜奶，加入10 mL Cl3CCOOH 和50 mL CH3OH混合溶液中，超声15 min，在10000 r/min 转速下离心10 min后取上清液，用0.45 μm 的滤网膜过滤，对所得滤液进行分析测定，并进行加标回收实验。
具体实验原理如图1所示。
杂交链式反应反应时间对化学发光强度的影响如图2所示。
MG标准曲线如图3所示。
鲜奶样品中三聚氰胺的测定检测结果如表1所示。
本发明中的化学发光检测条件，具体特征如下：
(1) 检测杂交链式反应反应时间。优选的，实验结果如图2所示。随着反应时间增加，化学发光强度逐渐增大。但在反应进行到60 min之后化学发光强度的增加幅度减缓。所以，实验选择 60 min 作为最佳的杂交链式反应反应时间。
分析性能如下：
本发明在最佳条件下，考察了Me浓度与化学发光强度的关系。如图3所示，结果表明随着Me浓度增大，化学发光强度越大，并且化学发光强度与Me浓度在1 nM ~5000 nM范围内成非线性关系：y = 547143.47*exp(x/4223147) - 4286.23*exp(-x/669.24) - 542818.62，R2= 0.9986（y：化学发光强度；x：Me浓度，单位：nM； n = 7）。化学发光强度与Me浓度在1 nM ~100 nM范围成内线性关系：y = 6.9027x + 29.317，R2 = 0.9987，检测限为 0.3 nM。对50 nM的Me进行7次平行测定的RSD为3.8%。
检测体系对Me的选择性。实验结果表明，当Me的浓度为10-7 mol/L时，误差在5%的范围内1000倍的K+、Na+、Mg2+、Ca2+、Fe3+、NH4 +、Ba2+、Zn2+、Cl-、NO3 -、SO4 2-、PO4 3-、CO3 2-、C2O4 -、葡萄糖、色氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、维生素B2和维生素C；500倍的Fe2+、抗坏血酸、腺嘌呤、鸟嘌呤, 尿酸、ATP、甲硫氨酸、半胱氨酸；100 倍的Cd2+、Sn2+和Pb2+均不干扰该方法对Me的响应。表明方法具有高的选择性。
杂交链式反应的链增长是通过H1和H2序列进行交替连接而成的，因此两种序列对于杂交链式反应体系来说缺一不可。为了进一步研究反应中杂交链式反应的生长效率，在对比实验中只加入 HRP-H2，保证一个目标物Me对应一个HRP，根据HRP-luminol-H2O2化学发光强度，对目标物进行定量。根据线性范围的下线确定杂交链式反应的放大倍数。随着Me浓度的增大，化学发光强度越大，并且化学发光强度与Me浓度在70 nM ~1000 nM 范围内呈线性关系：y = 0.8891x - 38.652，R2 = 0.9994，检测限为 45 nM。如以线性范围的下限为对象对灵敏度进行比较，则杂交链式反应灵敏度为非杂交链式反应的70倍。
通过检测液态奶中三聚氰胺的含量来检验方法的可靠性。并利用加标回收法对该方法进行了考察，结果列于表1。回收率在98.0% ~ 100.3%之间，表明此方法在复杂基底中测定Me具有良好的准确度。
附图说明
图1为本发明的具体实验原理图。
图2为杂交链式反应反应时间对化学发光强度的影响。
图3为 MG浓度的标准曲线图。
具体实施方式
下面的实例将具体说明本发明的操作方法，但不能作为对本发明的限定。
实例：基于目标诱导链释放和杂交链式反应化学发光测定三聚氰胺的方法
1. 实验部分
1.1 仪器与试剂
1-（3-二甲氨基醛）-3-乙基二亚胺盐酸盐（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）购自天津市巴斯夫化工有限公司。鲁米诺（luminol）购自上海阿拉丁试剂公司。HRP（辣根过氧化物酶）购自上海顺适生物技术有限公司。
所用人工合成DNA序列由北京赛百盛生物工程有限公司购得，序列如下：
DNA1的部分序列为：5′-TTT TTT TTT TTT CCA AAA GGG-(CH2)6-SH-3′
DNA2的部分序列为：5′-TGG AAA AAA AAA AAA-3′
H1的部分序列为：5′-NH2-(CH2)6-GCG AGG TTT TTT TTT TTT CCA GCG CCG CAC AGA TGG AAA AAA AAA AAA-3′
H2的部分序列为: 5′-TGG AAA AAA AAA AAA AGG GTA GCG CCG TTT TTT TTT TTT CCA ATT AGA-(CH2)6-NH2-3′
IFFM-E型流动注射化学发光分析仪（西安瑞迈分析仪器有限公司）；MPI-E型电化学发光分析系统（西安瑞迈分析仪器有限公司）；THZ-82A气浴恒温振荡器（全坛市医疗仪器厂）。
1.2实验步骤
1.2.1 FMB1的制备
将1.0 ml的磁性金纳米粒子用2.0 ml的0.1 M磷酸缓冲液（pH 7.0）洗涤3次，然后加入200 μl 1.0×10-5 M的DNA1和1.0×10-5 M的DNA2混合物，在37°C下反应12小时。最后将所得的功能化磁性金纳米粒子（FMB1）用2.0 ml的0.1 M的磷酸缓冲液洗涤3次，然后分散在2.0 ml磷酸缓冲液中，保存在4°C下备用。
1.2.2 FMB2的制备
将1.0 ml的磁性金纳米粒子用2.0 ml的0.1 M磷酸缓冲液（pH 7.0）洗涤3次，然后加入100 μl 1.0×10-5 M的H1，在37°C下反应12小时。最后将所得的功能化磁性金纳米粒子（FMB2）用2.0 ml的0.1 M的磷酸缓冲液洗涤3次，然后分散在2.0 ml磷酸缓冲液中，保存在4°C下备用。
1.2.3 HRP修饰的H1和H2的制备
在100 μl 1.0×10-5 M的H1或H2的（pH为7.4的磷酸缓冲溶液）加入10 mg NHS， 20 mg EDC，在37 °C下搅拌1小时。然后加入100 μl HRP，在37 °C下搅拌过夜，得HRP-H1和HRP-H2复合物。
1.2.4 Me检测
取含Me的标准溶液50 μL加入到200 μL的FMB1溶液，37°C反应40分钟，然后混合物在磁力架上分离。将上述上清液转移到装有FMB2溶液的试管中。然后加入含有 5.0×10-7 M HRP-H1和 5.0×10-7 M HRP-H2溶液200 μL。在 37 ℃反应 1 h后进行磁分离，除去上清液。将磁珠用 100 μL磷酸缓冲溶液（pH 7.0）清洗两遍后，分散于1.0 ml磷酸缓冲溶液（pH 7.0）中，然后进行化学发光检测。
1.2.5样品的制备
称取10 g鲜奶，加入10 mL Cl3CCOOH 和50 mL CH3OH混合溶液中，超声15 min，在10000 r/min 转速下离心10 min后取上清液，使用0.45 μm 的滤网膜过滤，对所得滤液进行分析测定，并进行加标回收实验
1.3结果与讨论
如图2所示，随着反应时间增加，化学发光强度逐渐增大。但在反应进行到60 min之后化学发光强度的增加幅度减缓。实验选择 60 min 作为最佳的杂交链式反应反应时间。[0053] 考察了食品中常含有的离子、氨基酸、维生素等成分对该方法测定Me的选择性。实验结果表明，当Me的浓度为10-7 mol/L时，误差在5%的范围内1000倍的K+、Na+、Mg2+、Ca2+、Fe3+、NH4 +、Ba2+、Zn2+、Cl-、NO3 -、SO4 2-、PO4 3-、CO3 2-、C2O4 -、葡萄糖、色氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、维生素B2和维生素C；500倍的Fe2+、抗坏血酸、腺嘌呤、鸟嘌呤, 尿酸、ATP、甲硫氨酸、半胱氨酸；100 倍的Cd2+、Sn2+和Pb2+均不干扰该方法对Me的响应。表明方法具有高的选择性，本方法具有应用到真实样品检测的可行性。
考察了Me浓度与化学发光强度的关系。如图3所示，结果表明随着Me浓度增大，化学发光强度越大，并且化学发光强度与Me浓度在1 nM ~5000 nM范围内成非线性关系：y = 547143.47*exp(x/4223147) - 4286.23*exp(-x/669.24) - 542818.62，R2 = 0.9986。化学发光强度与Me浓度在1 nM ~100 nM范围成内线性关系：y = 6.9027x + 29.317，R2 = 0.9987，检测限为 0.3 nM。对50 nM的Me进行7次平行测定的RSD为3.8%。
杂交链式反应的链增长是通过H1和H2序列进行交替连接而成的，因此两种序列对于杂交链式反应体系来说缺一不可。为了进一步研究反应中杂交链式反应的生长效率，在对比实验中只加入 HRP-H2，保证一个目标物Me对应一个HRP，根据HRP-luminol-H2O2化学发光强度，对目标物进行定量。根据线性范围的下线确定杂交链式反应的放大倍数。随着Me浓度的增大，化学发光强度越大，并且化学发光强度与Me浓度在70 nM ~1000 nM 范围内呈线性关系：y = 0.8891x - 38.652，R2 = 0.9994，检测限为 45 nM。如以线性范围的下限为对象对灵敏度进行比较，则杂交链式反应灵敏度为非杂交链式反应的70倍。
通过检测液态奶中三聚氰胺的含量来检验方法的可靠性。并利用加标回收法对该方法进行了考察，结果列于表1。回收率在98.0% ~ 100.3%之间，表明此方法在复杂基底中测定Me具有良好的准确度。
表1 鲜奶样品中三聚氰胺的测定结果。
| 编号 | 含量 a, b | 加入量 | 测得量 | 回收率 (%) |
| 1 | NDc | 10.00 | 10.03 | 100.3 |
| 2 | ND | 5.00 | 5.01 | 100.2 |
| 3 | ND | 5.00 | 4.90 | 98.0 |
a7次测量结果
b 单位：nM
c ND：未检出。
Claims (3)
1.一种化学发光测定三聚氰胺的方法，其特征是包括以下步骤：
FMB1的制备：将磁性金纳米粒子用磷酸缓冲液洗涤后，加入200 μl 1.0×10-5 M的DNA1和1.0×10-5 M的DNA2混合物，在37°C下反应12小时；将所得的功能化磁性金纳米粒子（FMB1）用磷酸盐缓冲液洗涤，然后分散在磷酸盐缓冲液中，保存在4°C下备用；
FMB2的制备：将磁性金纳米粒子用磷酸缓冲液洗涤后，100 μl 1.0×10-5 M的H1，在37°C下反应12小时；将所得的功能化磁性金纳米粒子（FMB2）用磷酸盐缓冲液洗涤，然后分散在磷酸盐缓冲液中，保存在4°C下备用；
制备HRP（辣根过氧化物酶）修饰的H1：在100 μl 1.0×10-5 M的H1加入10 mg NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）， 20 mg EDC（1-（3-二甲氨基醛）-3-乙基二亚胺盐酸盐），在37 °C下搅拌1小时，然后加入100 μl HRP，在37 °C下搅拌过夜，即得；
制备HRP修饰的H2：在100 μl 1.0×10-5 M的H2加入10 mg NHS， 20 mg EDC，在37 °C下搅拌1小时，然后加入100 μl HRP，在37 °C下搅拌过夜，即得；
1.5 Me（三聚氰胺）的检测：取含Me的标准溶液50 μL加入到200 μL的FMB1溶液，37°C反应40分钟，然后混合物在磁力架上分离，将上清液转移到FMB2溶液中；然后加入含有 5.0×10-7 M HRP-H1和 5.0×10-7 M HRP-H2溶液200 μL，在 37 ℃反应 1 h后进行磁分离，除去上清液，将磁珠用 100 μL磷酸缓冲溶液清洗两遍后，分散于1.0 ml磷酸缓冲溶液中，然后进行化学发光检测。
2.权利要求1所述的DNA序列为：
2.1 DNA1的部分序列为：5′-TTT TTT TTT TTT CCA AAA GGG-(CH2)6-SH-3；
2.2 DNA2的部分序列为：5′-TGG AAA AAA AAA AAA-3′；
2.3 H1的部分序列为：5′-NH2-(CH2)-GCG AGG TTT TTT TTT TTT CCA GCG CCG CAC AGA TGG AAA AAA AAA AAA-3′；
2.4 H2的部分序列为: 5′-TGG AAA AAA AAA AAA AGG GTA GCG CCG TTT TTT TTT TTT CCA ATT AGA-(CH2)6-NH2-3′。
3.根据权利要求1所述的化学发光测定三聚氰胺的应用。
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Inventor after: Zhang Youyuan Inventor before: Hun Xu |
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Granted publication date: 20150617 Termination date: 20180904 |