CN110628415B - 一种适配体包覆鲁米诺的中空多孔二氧化硅材料的制备及其应用 - Google Patents
一种适配体包覆鲁米诺的中空多孔二氧化硅材料的制备及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种适配体包覆鲁米诺的中空多孔二氧化硅材料的制备及其在化学发光分析中的应用技术。主要技术特征是：用三步法制得中空多孔二氧化硅，并用适配体将鲁米诺分子包覆在中空多孔二氧化硅的内部空腔中，得到对PSA有高特异性识别能力、可释放化学发光试剂分子鲁米诺的中空多孔二氧化硅材料；本发明同时提供了一种将适配体包覆鲁米诺分子的中空多孔二氧化硅材料应用于化学发光检测PSA的方法，该方法检测PSA表现出优异的选择性、稳定性和重现性，同时具有高的灵敏度，并且成功用于血清中PSA的检测，为该传感器进一步应用于临床PSA的检测和监控提供了理论支撑。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种适配体包覆鲁米诺的中空多孔二氧化硅材料的制备及其在化学发光分析中的应用技术，属于化学发光传感领域，具体涉及适配体包覆鲁米诺的中空多孔二氧化硅材料的制备及其在化学发光检测前列腺特异性抗原中的应用。
背景技术
纳米二氧化硅（SiO2）的粒径小、比表面积大、生物相容性好，且具有纳米材料的表面界面效应、小尺寸效应、量子尺寸效应等优点，使得SiO2可广泛应用于微电子、生物医药工程、复合材料、吸附材料等领域。中空多孔二氧化硅材料由于其有特定孔道结构、中空、密度小、比表面积大的特点，因而具有较好的渗透性、吸附性、筛分分子能力和光学性能。因此成为具有广泛应用前景的热点材料。目前合成中空多孔二氧化硅的方法很多，如表面沉积法、层层组装法、原子转移自由基聚合法、喷雾法、微乳液法等。在申请号为2014107036911的专利中公开了一种快速一步水热法制备中空多孔二氧化硅并进一步利用水合肼一步还原制得中空多孔二氧化硅/银纳米粒子的方法。在申请号为2015100603893的专利中公开了一种用于降解苯酚的微生物与纳米粒子复合体系的制备方法，将温度敏感聚合物引入到中空多孔二氧化硅纳米粒子空腔处，增加了纳米粒子的吸附量，同时可以在不同温度下实现苯酚在纳米粒子上的吸附与解吸附，为污水处理剂提供了更广泛地选择。
鲁米诺（Luminol）是一种化学荧光分子，在过氧化氢分子存在的条件下可以转变成激发态氨基邻苯二甲酸，后者发出较强的荧光。过氧化氢是许多生物氧化反应的产物，因此很容易通过引入鲁米诺将这些生物氧化反应与光检测联系起来。所以鲁米诺-过氧化氢化学发光体系被广泛应用于荧光、化学发光、电致化学发光等分析方法中。很多物质可以催化鲁米诺-过氧化氢的反应，如金属粒子（如金、银纳米粒子等），金属离子（如铁离子、铬离子等），金属氧化物（如二氧化铈），量子点（如碲化镉量子点），生物酶（如辣根过氧化物酶、过氧化氢酶等），模拟酶（如G四链体模拟酶）。
前列腺类疾病是男性群体中常见的一种疾病，其中前列腺癌对于患者生命健康的影响不言而喻，目前已将高居男性恶性肿瘤排行榜第6位。研究发现，在男性精浆中存在一种前列腺特异性抗原（PSA），PSA是精浆的主要成分，是一种能够特异性反映前列腺的物质，正常人的前列腺特异性抗原主要存在于前列腺中，在血清中含量极低，当前列腺大生癌变或者病变时，其血清中的前列腺特异性抗原有明显升高，因此，对血清中的前列腺特异性抗原水平进行检测，在前列腺癌的临床诊断中具有较高的应用价值。在传统的检测方法中，主要是以放射免疫法为主，但该方法需通过具有放射性的试剂进行检测，并且存放试剂的容器无法长时间保持试剂效果，另外，在测定过程中操作较为繁琐，测定时间较长，容易对检测结果造成一定影响。与传统方法相比，结合化学发光技术的检测方法表现出良好的重复性、测试样品所需时间较短等优点，尤其在临床诊断的特异性和灵敏度方面，均展示出较强的优势。因此，利用化学发光检测PSA具有极其重要的价值，可有效提升前列腺癌的早期诊断率，为前列腺癌的临床诊断提供可靠依据，具有广泛的应用前景。
本发明旨在制备一种适配体包覆鲁米诺分子的中空多孔二氧化硅材料，鲁米诺作为化学发光试剂被适配体封装在中空多空二氧化硅的内部，适配体同时作为特异性识别材料，可以特异性识别目标检测物，因此得到的适配体包覆鲁米诺分子的中空多孔二氧化硅材料可以封装化学发光试剂分子、具有高的特异性识别能力；将该适配体包覆鲁米诺分子的中空多孔二氧化硅材料用于化学发光传感器的构建，实现对PSA的高灵敏、高选择性、准确快速检测，发明了一种检测PSA的新方法。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种适配体包覆鲁米诺分子的中空多孔二氧化硅材料的制备方法，主要是制备中空多孔二氧化硅，并用适配体将鲁米诺分子包覆在中空多孔二氧化硅的内部空腔中，得到对PSA有高特异性识别能力、可释放化学发光试剂分子鲁米诺的中空多孔二氧化硅材料。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
（1）中空多孔二氧化硅的制备：用三步法制得中空多孔二氧化硅。首先在弱碱下（PH = 8.0 ~ 9.0）分解正硅酸乙酯制得实心二氧化硅；然后在强碱下（PH = 12.5 ~ 13.0）蚀刻来获得多孔二氧化硅；最后将聚电解质聚二烯二甲基氯化铵涂覆在多孔二氧化硅的表层，离心收集后将其分散在100 mL 1.0 ~ 2.0 moL/L的氨溶液中并在60 ~ 80 ˚C下搅拌反应60 ~ 100 min, 经离心分离后，产物在 500 ~ 600 ˚C马弗炉中煅烧110 ~ 150 min，获得中空多孔二氧化硅；
（2）适配体包覆鲁米诺分子的中空多孔二氧化硅材料的制备：用PH = 7.0 ~ 7.4的PBS溶液配制100 mL 0.05 ~ 0.15 g/L的中空多孔二氧化硅分散液；将5 mL该分散液、50uL 0.01 ~ 0.1 mol/L的鲁米诺溶液同时置于离心管中，将该离心管在室温振荡2 ~ 4 h；随后再向该离心管中加入2.0 ~ 4.0 nmol适配体，将该离心管在室温振荡2 ~ 4 h；振荡完成后将该离心管离心分离以除去多余的适配体和未被包覆的鲁米诺分子，将离心后的产物用PBS定容到50 mL容量瓶中并置于4 ˚C冰箱中备用。
本发明的另一个目的是适配体包覆鲁米诺分子的中空多孔二氧化硅材料应用于化学发光检测PSA。将制备的适配体包覆鲁米诺分子的中空多孔二氧化硅置于PSA样品管中，当PSA存在时，PSA与其适配体特异性识别而结合，使得适配体从中空多孔二氧化硅的表面脱落下来，间接释放被包覆的鲁米诺分子，释放后的鲁米诺分子引发鲁米诺-双氧水的化学发光反应，并且在辣根过氧化物酶的作用下催化过氧化物酶催化该化学发光反应，以此实现对PSA的检测。该化学发光检测PSA的特征为：选择性好、灵敏度高、操作方便。在该化学发光化学传感器的构建中，对PSA刺激下鲁米诺的释放响应进行了研究，对化学发光条件进行了选择，进行了工作曲线的绘制，对该传感器的选择性、重现性、稳定性进行了研究，最后用于血清中PSA的检测。
本发明的优点及效果是：
（1）本发明制备了中空多孔二氧化硅，通过三步合成法合成，依次合成实心二氧化硅、多孔二氧化硅、中空多孔二氧化硅，条件可控性强、操作简单。制备的中空多孔二氧化硅具有中空多孔、孔径分布有序、比表面积大等优势，为鲁米诺分子的包覆提供了支撑；
（2）本发明制备了适配体包覆鲁米诺分子的中空多孔二氧化硅，该合成材料对PSA有高特异性识别能力、可释放化学发光试剂分子鲁米诺；
（3）本发明制备的适配体包覆鲁米诺分子的中空多孔二氧化硅用于化学发光检测PSA中，该化学发光传感器检测PSA表现出优异的选择性、稳定性和重现性，同时具有高的灵敏度、准确度和精密度，并且成功用于血清中PSA的检测，为该传感器进一步应用于临床PSA的检测和监控提供了理论支撑。
具体实施方式
实施例1
（1）中空多孔二氧化硅的制备：用三步法制得中空多孔二氧化硅。首先在弱碱下（PH = 8.0）分解正硅酸乙酯制得实心二氧化硅；然后在强碱下（PH = 12.5）蚀刻来获得多孔二氧化硅；最后将聚电解质聚二烯二甲基氯化铵涂覆在多孔二氧化硅的表层，离心收集后将其分散在100 mL 1.0 moL/L的氨溶液中并在65 ˚C下搅拌反应80 min, 经离心分离后，产物在 500 ˚C马弗炉中煅烧120 min，获得中空多孔二氧化硅；
（2）适配体包覆鲁米诺分子的中空多孔二氧化硅材料的制备：用PH = 7.0的PBS溶液（0.2 moL/L）配制100 mL 0.10 g/L的中空多孔二氧化硅分散液；将5 mL该分散液、50 uL0.01 mol/L的鲁米诺溶液同时置于离心管中，将该离心管在室温振荡3 h；随后再向该离心管中加入2.0 nmol适配体，将该离心管在室温振荡2 h；振荡完成后将该离心管离心分离以除去多余的适配体和未被包覆的鲁米诺分子，将离心后的产物用PBS定容到50 mL容量瓶中并置于4 ˚C冰箱中备用。
实施例2
（1）中空多孔二氧化硅的制备：用三步法制得中空多孔二氧化硅。首先在弱碱下（PH = 8.5）分解正硅酸乙酯制得实心二氧化硅；然后在强碱下（PH = 12.8）蚀刻来获得多孔二氧化硅；最后将聚电解质聚二烯二甲基氯化铵涂覆在多孔二氧化硅的表层，离心收集后将其分散在100 mL 1.5 moL/L的氨溶液中并在70 ˚C下搅拌反应80 min, 经离心分离后，产物在 500 ˚C马弗炉中煅烧140 min，获得中空多孔二氧化硅；
（2）适配体包覆鲁米诺分子的中空多孔二氧化硅材料的制备：用PH = 7.2的PBS溶液（0.2 moL/L）配制100 mL 0.15 g/L的中空多孔二氧化硅分散液；将5 mL该分散液、50 uL0.05 mol/L的鲁米诺溶液同时置于离心管中，将该离心管在室温振荡3 h；随后再向该离心管中加入3.0 nmol适配体，将该离心管在室温振荡4 h；振荡完成后将该离心管离心分离以除去多余的适配体和未被包覆的鲁米诺分子，将离心后的产物用PBS定容到50 mL容量瓶中并置于4 ˚C冰箱中备用。
实施例3
（1）中空多孔二氧化硅的制备：用三步法制得中空多孔二氧化硅。首先在弱碱下（PH = 9.0）分解正硅酸乙酯制得实心二氧化硅；然后在强碱下（PH = 13.0）蚀刻来获得多孔二氧化硅；最后将聚电解质聚二烯二甲基氯化铵涂覆在多孔二氧化硅的表层，离心收集后将其分散在100 mL 2.0 moL/L的氨溶液中并在80 ˚C下搅拌反应60 min, 经离心分离后，产物在 600 ˚C马弗炉中煅烧110 min，获得中空多孔二氧化硅；
（2）适配体包覆鲁米诺分子的中空多孔二氧化硅材料的制备：用PH = 7.4的PBS溶液（0.2 moL/L）配制100 mL 0.15 g/L的中空多孔二氧化硅分散液；将5 mL该分散液、50 uL0.1 mol/L的鲁米诺溶液同时置于离心管中，将该离心管在室温振荡4 h；随后再向该离心管中加入4.0 nmol适配体，将该离心管在室温振荡4 h；振荡完成后将该离心管离心分离以除去多余的适配体和未被包覆的鲁米诺分子，将离心后的产物用PBS定容到50 mL容量瓶中并置于4 ˚C冰箱中备用。
实施例4
适配体包覆鲁米诺分子的中空多孔二氧化硅材料应用于化学发光检测PSA的方法，具体的检测过程如下：
启动主泵和副泵，进样阀处于进样位置，氢氧化钠、过氧化氢、辣根过氧化物酶溶液及样品管合并流动311 s，产生化学发光I，即为一定浓度PSA所对应的化学发光强度；其中样品管中放置有一定质量的适配体包覆鲁米诺分子的中空多孔二氧化硅材料，当PSA存在时，PSA会与适配体包覆鲁米诺分子的中空多孔二氧化硅材料表面的适配体特异性识别而结合在一起，形成适配体@PSA，同时被包覆在中空多孔二氧化硅材料内部的鲁米诺分子得到释放，释放后的鲁米诺分子与过氧化氢、氢氧化钠一起，在辣根过氧化物酶的催化作用下发生反应，产生强的化学发光信号。
适配体包覆鲁米诺分子的中空多孔二氧化硅材料应用于化学发光检测PSA，得到最佳实验条件为：30 r/min的主泵泵速，30 r/min的副泵泵速，0.02 mol/L的氢氧化钠溶液，0.10 mol/L的过氧化氢溶液和8.0 × 10-3 mol/L的辣根过氧化物酶溶液；工作曲线的线性方程为I = 1478.89 + 199.94 lgc PSA（R = 0.9960），线性范围为0.001 ~ 100 ng/mL，检出限为3.2 × 10-4 ng/mL；同时该化学发光传感器表现出优异的选择性、稳定性和重现性表；进行血清样品中PSA的检测时回收率为99.3% ~ 102.3%，相对标准偏差小于3.82%，说明该测定方法具有较高的准确度和精密度。
Claims (2)
1.一种适配体包覆鲁米诺分子的中空多孔二氧化硅材料的制备方法，其特征是，在于该方法具有以下工艺步骤：
（1）中空多孔二氧化硅的制备：用三步法制得中空多孔二氧化硅，首先在弱碱下，即pH= 8.0 ~ 9.0，分解正硅酸乙酯制得实心二氧化硅；然后在强碱下，即pH = 12.5 ~ 13.0，蚀刻来获得多孔二氧化硅；最后将聚电解质聚二烯二甲基氯化铵涂覆在多孔二氧化硅的表层，离心收集后将其分散在100 mL 1.0 ~ 2.0 moL/L的氨溶液中并在60 ~ 80 ˚C下搅拌反应60 ~ 100 min, 经离心分离后，产物在 500 ~ 600 ˚C马弗炉中煅烧110 ~ 150 min，获得中空多孔二氧化硅；
（2）适配体包覆鲁米诺分子的中空多孔二氧化硅材料的制备：用PH = 7.0 ~ 7.4的PBS溶液配制100 mL 0.05 ~ 0.15 g/L的中空多孔二氧化硅分散液；将5 mL该分散液、50 uL0.01 ~ 0.1 mol/L的鲁米诺溶液同时置于离心管中，将该离心管在室温振荡2 ~ 4 h；随后再向该离心管中加入2.0 ~ 4.0 nmolPSA适配体，将该离心管在室温振荡2 ~ 4 h；振荡完成后将该离心管离心分离以除去多余的适配体和未被包覆的鲁米诺分子，将离心后的产物用PBS定容到50 mL容量瓶中并置于4 ˚C冰箱中备用。
2.根据权利要求1所述的制备方法得到的适配体包覆鲁米诺分子的中空多孔二氧化硅材料用于制备化学发光检测PSA的试剂的用途，其特征是采用化学发光法检测，该化学发光检测PSA的过程如下：
启动主泵和副泵，氢氧化钠、过氧化氢、辣根过氧化物酶溶液及样品液分别从四支进样管流入溶液混合池，经混合池后合并流动进入检测池，产生化学发光I，即为一定浓度PSA所对应的化学发光强度；其中样品管中放置有一定质量的适配体包覆鲁米诺分子的中空多孔二氧化硅材料，当PSA存在时，PSA会与适配体包覆鲁米诺分子的中空多孔二氧化硅材料表面的适配体特异性识别而结合在一起，形成适配体@PSA，同时被包覆在中空多孔二氧化硅材料内部的鲁米诺分子得到释放，释放后的鲁米诺分子与过氧化氢、氢氧化钠一起，在辣根过氧化物酶的催化作用下发生反应，产生强的化学发光信号。
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