CN102967595A - 一种化学发光传感器及采用该传感器检测葡萄糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种化学发光传感器及采用该传感器检测葡萄糖的方法,可应用于临床葡萄糖的检测。通过将葡萄糖氧化酶、化学发光试剂(鲁米诺)和催化剂同时固定,拓宽鲁米诺化学发光反应条件,使其从传统的碱性基质扩充至弱酸性的基质中,并保证化学发光传感器的灵敏度及使用寿命。并兼具操作简单,成本低,线性范围宽等特点。
Description
技术领域:
本发明涉及一种化学发光传感器及采用该传感器检测葡萄糖的方法。可应用于临床中葡萄糖的检测。
背景技术:
化学发光(chemiluminescence,CL)是指某些化学反应发射光的现象,通常为氧化还原反应。化学发光分析法因其不需要外来的激发光源,因此不存在背景干扰,使其具有很高的灵敏度,检出限可达10-21-10-12mol。并且该法线性范围宽(3-6个数量级),仪器设备简单、操作方便、廉价、易自动化,成为分析化学中一个十分活跃的研究热点。近年来,由于化学发光传感器在一定程度上能提高催化剂的稳定性和催化活性、并且其操作简便、仪器简单、环境友好、低耗等优点引起了人们的广泛关注。
葡萄糖的定量分析在临床医学、生物化学、食品科学等领域有极其重要的作用。目前的测定方法主要有分光光度计、电流测定法、高效液相色谱法及毛细管电泳法。但是,这些方法通常需要复杂的前处理过程,分析速度慢,并且仪器设备成本较高,不利于推广。与之相比,化学发光法具有检测速度快、选择性好、体积小、易操作,仪器简单等优点。化学发光法检测葡萄糖是利用葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢,过氧化氢在催化剂存在的条件下能够氧化鲁米诺产生发光,其发光强度与过氧化氢的浓度成正比例关系,基于此反应对葡萄糖浓度进行定量检测。
随着技术的发展,化学发光生物传感器逐渐地应用于葡萄糖的测定。Lan等人[Biosens.Bioelectron.,2008,24,934-938]将金纳米及辣根过氧化物酶固定在二氧化硅凝胶上,通过流动鲁米诺测定人血清中的葡萄糖。Li等人[Anal.Biochem.,2008,374,64-90]通过戊二醛将葡萄糖酶和辣根过氧化物酶固定在蛋壳上,并测定人血清中的葡萄糖。该方法虽有突出的优点,但仅能固定化学发光试剂或是催化剂,这样即浪费了资源,也造成了一定的环境危害[Anal.Chem.,2002,74,1269-1274;Anal.Chem.,2008,374,64-70]。
目前,同时将葡萄糖氧化酶,化学发光试剂(鲁米诺)和催化剂同时固定在一起还鲜有报道。并且存在着检测范围较小,响应时间较长、抗干扰能力较弱及寿命较短等问题。其主要原因是葡萄糖氧化酶的反应基质是弱酸性或中性条件,而鲁米诺的最佳化学发光反应的基质为碱性溶液[Anal.Chem.,2012,84(5):2410-2415]。由于二者的反应pH值不同,如果保证了葡萄糖氧化酶的活性就确保不了鲁米诺的使用,保证了鲁米诺的条件,酶的活性就大大地降低,因此无法将二者固定在同一根柱子上。拓宽鲁米诺的pH值的使用范围,提高传感器的检测范围和灵敏度是亟待解决的问题。
发明内容:
本发明的目的是提供一种化学发光传感器及采用该传感器检测葡萄糖的方法。通过将葡萄糖氧化酶、化学发光试剂(鲁米诺)和催化剂(镁铝碳酸根水滑石)同时固定,拓宽鲁米诺化学发光反应条件,使其从传统的碱性基质扩充至弱酸性的基质中,并保证化学发光传感器的灵敏度及使用寿命。并兼具操作简单,成本低,线性范围宽等特点。
本发明提供的一种化学发光传感器,采用由二氧化硅凝胶和壳聚糖组成的交联剂交联固定葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶和吸附了鲁米诺的镁铝碳酸根水滑石,将得到的混合物填充于石英管内,石英管两端填充玻璃棉,构成化学发光传感器;其中化学发光传感器具体制备方法如下:
A:将镁铝碳酸根水滑石([Mg1-xAlx(OH)2]x+(CO3)x/2·yH2O,0.17≤x≤0.34,y为结晶水的数量)浸入浓度为1×10-4-1×10-2mol/L鲁米诺水溶液中,混合,充分吸附,经过滤,常温干燥得到黄绿色的产物,产物中镁铝碳酸根水滑石与鲁米诺的质量比为(100-600):1;
B:将正硅酸乙酯、纯净水、浓度为0.1-0.5mol/L的盐酸混合,三者的体积比依次为(2-4):(0.5-1.5):(0.01-0.05),充分搅拌,得到澄清的二氧化硅凝胶溶液;然后加入质量浓度为0.5-3%的壳聚糖溶液、体积比(1-2):1的乙醇水溶液,二氧化硅凝胶、壳聚糖溶液及乙醇水溶液的体积比为(1-4):1:(1-2),混合,充分搅拌,得到壳聚糖二氧化硅复合凝胶;再加入质量比为(1-3):(1-2)的葡萄糖氧化酶与辣根过氧化物酶的混合酶和步骤A制备的吸附鲁米诺的镁铝碳酸根水滑石,充分搅拌,混合均匀,其中壳聚糖/二氧化硅复合凝胶、混合酶及吸附鲁米诺的水滑石的质量比为(3-7):(0.05-0.2):(0.05-0.3),将得到白色糊状物填充至石英管中。
本发明还提供了一种采用上述传感器检测葡萄糖的方法,将上述化学发光传感器与流动注射分析结合,实现葡萄糖的检测;化学发光流动检测体系由蠕动泵、六通阀、超微弱发光测量仪(BPCL)及管路构成,以纯净水为载液,将葡萄糖样品溶液注入到六通阀中,通过蠕动泵载入至传感器中,产生发光,由超微弱发光测量仪检测发光强度并采集数据。其中载液的流速优选为2.0mL/min。
注入传感器中的葡萄糖样品溶液在葡萄糖氧化酶的作用下生成过氧化氢,过氧化氢与吸附着鲁米诺的水滑石反应,产生发光,通过BPCL检测得到的发光强度,以此推算出样品中葡萄糖的含量。
本发明适用于测定葡萄糖浓度大于5×10-7mol/L的样品,如动物和人体的血样、尿样等。
本发明的效果:采用本发明制备的化学发光传感器,可有效拓宽鲁米诺化学发光反应条件,使其从传统的碱性基质扩充至弱酸性的基质中,同时保证化学发光传感器的灵敏度及使用寿命。该化学发光传感器操作简单,检测快速,有效降低了发光试剂和催化剂的浪费,使成本得到大大地降低,可广泛应用于环境、生物及免疫分析中。
附图说明:
图1:实施例2的葡萄糖溶液化学发光标准检测曲线
图2:实施例1的葡萄糖化学发光传感器的缓冲能力测试结果
图3:实施例1的葡萄糖化学发光传感器的稳定性测试结果
具体实施方式:
下面结合实施例对本发明做进一步描述。
实施例1
化学发光传感器的制备方法:
A:称取0.03mol的硝酸镁与0.015mol的硝酸铝,混合,加入60mL纯净水,配制成盐液;称取0.0075mol的碳酸钠与0.12mol的氢氧化钠,混合,加入60mL纯净水,配制成碱液。将上述两溶液逐滴滴入四口瓶中,搅拌,控制混合液pH值在9.0-10.5之间。滴加完毕后,将四口瓶置于60℃水浴中,晶化24h。产物离心,洗涤并干燥,得到镁铝碳酸根水滑石([Mg4Al2(OH)12]CO3·yH2O)。
B:取上述镁铝碳酸根水滑石0.1g加入5mL浓度为0.0002mol/L的鲁米诺溶液,吸附10min,过滤,常温干燥,得到黄绿色的产物。产物中镁铝碳酸根水滑石与鲁米诺的质量比为564:1。
C:将2.2mL正硅酸乙酯,0.7mL水,50μL浓度为0.1mol/L盐酸混合,搅拌至澄清溶液;再加入2mL质量浓度为2%壳聚糖溶液,2mL体积比为1:1的乙醇水溶液搅拌2小时。在此混合溶液中加入30μL浓度5.4mg/mL葡萄糖氧化酶及30μL浓度为10.8mg/mL辣根过氧化物酶,0.05g吸附鲁米诺的镁铝碳酸根水滑石,搅拌,直至混合均匀,得到白色糊状混合物。将此白色混合物填充至石英管中,石英管两端填充玻璃棉,得到化学发光传感器。
葡萄糖的检测方法:
将步骤C的化学发光传感器与流动注射分析结合,实现葡萄糖的检测;检测系统由蠕动泵、六通阀、超微弱发光测量仪(BPCL)及管路形成完整的化学发光流动检测体系。以纯净水为载液,开启蠕动泵及BPCL,用纯净水洗涤管路30min,流速设置为1mL/min。保证BPCL的稳定运行。
调节蠕动泵流速为2.0mL/min,将稀释1000倍的葡萄糖注射液(质量浓度为5%的葡萄糖注射液)通过六通阀注入化学发光传感器,产生发光,由BPCL中检测发光并采集数据。通过产生的光强度推算出葡萄糖注射液的浓度为0.292mol/L。
实施例2
化学发光传感器的制备方法:
A:称取0.045mol的硝酸镁与0.015mol的硝酸铝,混合,加入60mL纯净水,配制成盐液;称取0.0075mol的碳酸钠与0.12mol的氢氧化钠,混合,加入60mL纯净水,配制成碱液。将上述两溶液逐滴滴入四口瓶中,搅拌,控制混合液pH值在9.0-10.5之间。滴加完毕后,将四口瓶置于60℃水浴中,晶化24h。产物离心,洗涤并干燥,得到镁铝碳酸根水滑石([Mg6Al2(OH)12]CO3·yH2O)。
B:取上述镁铝碳酸根水滑石0.1g加入15mL浓度为0.0002mol/L的鲁米诺溶液,吸附10min,过滤,常温干燥,得到黄绿色的产物。产物中镁铝碳酸根水滑石与鲁米诺的质量比为188:1。
C:将2.2mL正硅酸乙酯,1mL水,50μL浓度为0.1mol/L盐酸混合,搅拌至澄清溶液;再加入1mL质量浓度为2%壳聚糖溶液,2mL体积比为2:1的乙醇水溶液搅拌2小时。在此混合溶液中加入30μL浓度5.4mg/mL葡萄糖氧化酶及60μL浓度为10.8mg/mL辣根过氧化物酶,0.1g吸附鲁米诺的镁铝碳酸根水滑石,搅拌,直至混合均匀,得到白色糊状混合物。将此白色混合物填充至石英管中,石英管两端填充玻璃棉,得到化学发光传感器。
葡萄糖的检测方法:
采用实施例1的化学发光流动检测体系,调节蠕动泵流速为2.0mL/min,将稀释100倍的正常成人的血浆样品(葡萄糖浓度80-120mg/dL)通过六通阀注入体系中,与化学发光传感器反应产生发光,由BPCL中检测发光并采集数据。通过产生的光强度推算出血浆样品中葡萄糖的浓度为6.5×10-3mol/L。
实施例3
化学发光传感器的制备方法:
A:称取0.06mol的硝酸镁与0.015mol的硝酸铝,混合,加入60mL纯净水,配制成盐液;称取0.0075mol的碳酸钠与0.12mol的氢氧化钠,混合,加入60mL纯净水,配制成碱液。将上述两溶液逐滴滴入四口瓶中,搅拌,控制混合液pH值在9.0-10.5之间。滴加完毕后,将四口瓶置于60℃水浴中,晶化24h。产物离心,洗涤并干燥,得到镁铝碳酸根水滑石([Mg8Al2(OH)12]CO3·yH2O)。
B:取上述镁铝碳酸根水滑石0.2g加入25mL浓度为0.0002mol/L的鲁米诺溶液,吸附10min,过滤,常温干燥,得到黄绿色的产物。产物中镁铝碳酸根水滑石与鲁米诺的质量比为113:1。
C:将3mL正硅酸乙酯,1.2mL水,60μL浓度为0.1mol/L盐酸混合,搅拌至澄清溶液;再加入2mL质量浓度为2%的壳聚糖溶液,3mL体积比为1:1的乙醇水溶液搅拌2小时。在此混合溶液中加入90μL浓度5.4mg/mL葡萄糖氧化酶及60μL浓度为10.8mg/mL辣根过氧化物酶,0.2g吸附鲁米诺的镁铝碳酸根水滑石,搅拌,直至混合均匀,得到白色糊状混合物。将此白色混合物填充至石英管中,石英管两端填充玻璃棉,得到化学发光传感器。
葡萄糖的检测方法:
采用实施例1的化学发光流动检测体系,调节蠕动泵流速为2.0mL/min,将稀释100倍的正常成人的血清样品(葡萄糖浓度80-120mg/dL)通过六通阀注入体系中,与化学发光传感器反应产生发光,由BPCL中检测发光并采集数据。通过产生的光强度推算出血浆样品中葡萄糖的浓度为8.1×10-3mol/L。
本发明化学发光传感器的性能检测:
化学发光传感器稳定性测试:采用实施例1的化学发光流动检测体系,连续注射浓度为5×10-6mol/L葡萄糖溶液至化学发光流动检测体系中,结果见图3。由图3可以看出,注射5×10-6mol/L葡萄糖溶液得到的化学发光信号的相对标准偏差为2.8%。说明本发明制备的化学发光传感器足以保证实际样品的长时间检测。
化学发光传感器缓冲能力测试:采用实施例1的化学发光流动检测体系,用盐酸或氢氧化钠调节纯净水的pH值,配制不同pH值(2.0-12.0)的载液,将其注入化学发光流动检测体系中,5min后,测量流出液的pH值,结果如图2所示。在pH值4.0-10.0之间,流出液的pH值基本保持稳定,证明该化学发光传感器在pH值4.0-10.0之间具有缓冲能力,可应用于弱酸或中性样品的检测,拓宽了鲁米诺化学发光反应pH值的范围。
Claims (5)
1.一种化学发光传感器,采用由二氧化硅凝胶和壳聚糖组成的交联剂交联固定葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶和吸附了鲁米诺的镁铝碳酸根水滑石,将得到的混合物填充于石英管内,石英管两端填充玻璃棉,构成化学发光传感器。
2.权利要求1所述的化学发光传感器,其特征在于:具体制备方法如下:
A:将镁铝碳酸根水滑石浸入鲁米诺水溶液中,混合,充分吸附,经过滤,常温干燥得到黄绿色的产物,水滑石和鲁米诺的质量比为(100-600):1;
B:将正硅酸乙酯、纯净水、浓度为0.1-0.5mol/L的盐酸混合,三者的体积比依次为(2-4):(0.5-1.5):(0.01-0.05),充分搅拌,得到澄清的二氧化硅凝胶溶液;然后加入壳聚糖溶液、乙醇水溶液,二氧化硅凝胶、壳聚糖溶液及乙醇水溶液的体积比为(1-4):1:(1-2),混合,充分搅拌,得到壳聚糖二氧化硅复合凝胶;再加入质量比为(1-3):(1-2)的葡萄糖氧化酶与辣根过氧化物酶的混合酶和步骤A制备的吸附鲁米诺的镁铝碳酸根水滑石,充分搅拌,混合均匀,其中壳聚糖二氧化硅复合凝胶、混合酶及吸附鲁米诺的水滑石的质量比为(3-7):(0.05-0.2):(0.05-0.3),将得到的白色糊状物填充至石英管中,两端填充玻璃棉。
3.根据权利要求1所述的化学发光传感器,其特征在于:步骤A中鲁米诺水溶液的浓度为1×10-4~1×10-2mol/L,步骤B中的壳聚糖溶液的质量浓度为0.5-3%,乙醇水溶液中乙醇与水的体积比为(1-2):1。
4.采用权利要求1至3任何一种化学发光传感器用于检测葡萄糖的方法,将化学发光传感器与流动注射分析结合,实现葡萄糖的检测;化学发光流动检测体系由蠕动泵、六通阀、超微弱发光测量仪及管路构成,以纯净水为载液,将葡萄糖样品溶液注入到六通阀中,通过蠕动泵载入至传感器中,产生发光,由超微弱发光测量仪检测发光强度并采集数据,测得葡萄糖的含量。
5.根据权利要求4化学发光传感器检测葡萄糖的方法,其特征是:载液的流速优选为2.0mL/min。
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