CN104122215B - 一种可再生光度探针的制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可再生光度探针的制备方法及在H2O2的紫外‑可见分光光度法检测中的应用，属于新型纳米功能材料和化学传感器技术领域。本发明利用贵金属纳米材料金@银核壳纳米棒作为人工模拟酶替代过氧化物酶，同时利用的强磁性纳米材料作为载体，从而制备了一种成本低、灵敏度高、检测快速、制备简单的可重复使用的可再生光度探针。
Description
技术领域
本发明涉及一种可再生光度探针的制备和应用。具体是采用具有协同催化作用的新型纳米复合材料制备的可用于检测双氧水的光度探针，并利用其强磁特性实现探针的重复利用，属于新型纳米功能材料与化学传感器技术领域。
背景技术
双氧水（H2O2）作为一种重要的无机化工产品，是工业领域重要的氧化剂、漂白剂、脱水剂和消毒剂。同时，它也是生物反应过程中的一种重要的中间物质，如H2O2是葡萄糖在O2存在下分解氧化的产物。众所周知，血液中的葡萄糖的检测是糖尿病的检测、治疗和控制的至关重要的环节。通常，我们通过检测H2O2来达到间接检测葡萄糖含量的目的。因此，H2O2广泛应用于化学、生物、环境保护等重多领域，对于H2O2的检测是生物传感器和分析化学研究中的重要内容，快速、灵敏地测定其含量，对化学研究及临床医药都意义重大。目前，检测H2O2的方法主要有电化学方法、荧光光度法、紫外-可见分光光度法、酶联免疫分析法等，其中尤以紫外可见分光光度法由于操作简单、成本较低，而被广泛应用在分析检测领域。这些方法虽然检测仪器不同，但检测原理中基本上都会使用过氧化氢酶与H2O2的催化反应来产生检测信号。
过氧化氢酶是过氧化物酶的一种，也是一种天然酶，它以血红素为辅基，参与生物体内生理代谢。它们能催化很多反应，是临床检验试剂中的常用酶。过氧化氢酶对H2O2具有高效的催化活性。但由于天然酶在应用中有许多缺点，如制备、纯化和贮存昂贵，而且容易抑制其活性，因此，研究开发人工模拟酶备受关注。
棒状的Au@Ag核壳纳米复合材料是一种新型贵金属纳米复合材料，由于其特殊的棒状结构，对H2O2有很好的催化特性，并且生物相容性好，可被应用到生物分析检测领域。另外，铁基磁性纳米材料——CoFe2O4/rGo，因其优异的物理和化学性能, 可使生化反应的时间大大缩短，使检测的通量得到明显的提高,同时使生物传感器检测的灵敏度显著提高，使纳米粒子在生物传感器领域的应用具有了更加广阔的前景。如果将Au@Ag和CoFe2O4/rGo共同作用，二者可产生协同催化作用，更大的增强了对H2O2的催化响应，提高了检测灵敏度，实现了模拟酶的作用，而相比天然酶又具有制备简单、贮存方便、不易失活等优点；同时，CoFe2O4/rGo具有很强的磁性，可以利用磁铁将复合材料吸附，实现材料的重复利用，更好的降低检测成本。因此，Au@Ag和CoFe2O4/rGo共同作用，可作为模拟酶应用于H2O2分析检测中。
本发明以CoFe2O4/rGo为载体吸附Au@Ag，作为模拟酶，催化H2O2与TMB显色系统，发明了一种可再生的光度探针，利用紫外-可见分光光度法实现了对H2O2的快速、灵敏检测。
发明内容
本发明的目的之一在于避免现有检测方法中使用天然酶而出现的贮存昂贵、制备复杂等缺点，制备一种人工模拟酶，与TMB共同作为光度探针，利用紫外-可见分光光度法，实现对H2O2的快速、灵敏检测；
本发明的目的之二在于利用制备的人工模拟酶的强磁特性，实现光度探针的可再生重复使用，更好的降低检测成本。
本发明采用的技术方案如下：
1. 一种可再生光度探针，其特征在于所述可再生光度探针包括：铁酸钴/石墨烯纳米复合材料（CoFe2O4/rGo）、金@银核壳纳米棒复合材料溶胶（Au@AgNRs）和3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine，TMB）、去离子水（H2O）；
所述CoFe2O4/rGo的制备步骤：将8~12 mg氧化石墨烯超声分散到25~35 ml无水乙醇中，依次加入0.5~1.5 ml 0.2 mol/mL的 Fe(NO3)3水溶液、0.25~0.75 ml of 0.2 mol/L Co(NO3)2水溶液和2.0~3.0 ml氨水，80℃下搅拌10~14h，然后转移至高压反应釜中，180℃下反应4~6h；冷却至室温后，离心分离，于50℃真空干燥箱中烘干，即得CoFe2O4/rGo；
所述Au@AgNRs的制备步骤：将20mL金纳米棒溶液和20mL 0.05~0.2
mol/L的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）溶液混合，在30~45℃下搅拌，并顺序加入3~6 mL 0.1 mol/L的 L-抗坏血酸（AA）溶液、0.5~1 mL 0.01 mol/L的AgNO3溶液和 3~6 mL 0.1 mol/L的氢氧化钠（NaOH）溶液，停止搅拌，静置1~3h，离心分离后，加入20mL H2O重新分散，制得Au@AgNRs；
所述可再生探针各部分组成比例为CoFe2O4/rGo：Au@AgNRs：TMB：H2O
=1~5mg：0.5~1mL：0.1~1mg：2mL；
所述可再生光度探针的再生步骤：将检测完毕后的可再生光度探针放于强磁铁上，2~4小时后，在管壁上的附着一层黑色吸附物，将上层液弃掉，用H2O洗涤管壁上的吸附物，最后按比例加入0.1~1mgTMB和2mLH2O，即实现光度探针的再生。
2. 本发明所述的一种可再生光度探针，用于H2O2的检测，步骤如下：
（1）将2mL已知浓度的H2O2标准溶液加入到6 mL、pH=7.0~8.0的乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，加入2mL可再生光度探针，放置3~4小时后，在520nm处检测吸光度；根据吸光度与H2O2标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；
（2）将待测样品溶液代替H2O2的标准溶液，按照（1）所述的工作曲线的绘制方法进行检测。
所述乙酸-乙酸钠缓冲溶液的浓度为0.1mol/L。
本发明的有益成果
（1）本发明所述的可再生光度探针制备简单，克服了天然酶的诸多缺点，利用紫外-可见分光光度法实现了对H2O2的快速、灵敏检测，并利用其强磁特性，实现光度探针的可再生重复使用，更好的降低检测成本，具有市场发展前景。
（2）本发明首次采用CoFe2O4/rGo和Au@AgNRs共同作用，制备人工模拟酶，利用二者的协同催化作用，显著提高了对H2O2的催化响应速度，具有重要的科学意义和应用价值。
具体实施方式
实施例 1 CoFe2O4/rGo的制备
将8 mg氧化石墨烯超声分散到25 ml无水乙醇中，依次加入0.5 ml 0.2 mol/mL的 Fe(NO3)3水溶液、0.25 ml of 0.2 mol/L Co(NO3)2水溶液和2.0 ml氨水，80℃下搅拌10h，然后转移至高压反应釜中，180℃下反应4h；冷却至室温后，离心分离，于50℃真空干燥箱中烘干，即得CoFe2O4/rGo。
实施例 2 CoFe2O4/rGo的制备
将10 mg氧化石墨烯超声分散到30 ml无水乙醇中，依次加入1 ml 0.2 mol/mL的 Fe(NO3)3水溶液、0.5 ml of 0.2 M Co(NO3)2水溶液和2.50 ml氨水，80℃下搅拌12h，然后转移至高压反应釜中，180℃下反应5h；冷却至室温后，离心分离，于50℃真空干燥箱中烘干，即得CoFe2O4/rGo。
实施例 3 CoFe2O4/rGo的制备
将12 mg氧化石墨烯超声分散到35 ml无水乙醇中，依次加入1.5 ml 0.2 mol/mL的 Fe(NO3)3水溶液、0.75 ml of 0.2 mol/L Co(NO3)2水溶液和3.0 ml氨水，80℃下搅拌14h，然后转移至高压反应釜中，180℃下反应6h；冷却至室温后，离心分离，于50℃真空干燥箱中烘干，即得CoFe2O4/rGo。
实施例 4 Au@AgNRs的制备
将20mL金纳米棒溶液和20mL
0.05 mol/L的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）溶液混合，在30℃下搅拌，并顺序加入3 mL 0.1 mol/L的 L-抗坏血酸（AA）溶液、0.5 mL 0.01 mol/L的AgNO3溶液和 3 mL 0.1 mol/L的氢氧化钠（NaOH）溶液，停止搅拌，静置1h，离心分离后，加入20mL H2O重新分散，制得Au@AgNRs。
实施例 5 Au@AgNRs的制备
将20mL金纳米棒溶液和20mL
0.1 mol/L的CTAB溶液混合，在35℃下搅拌，并顺序加入4 mL 0.1 mol/L的AA溶液、0.8 mL 0.01 mol/L的AgNO3溶液和 4 mL 0.1 mol/L的NaOH溶液，停止搅拌，静置2h，离心分离后，加入20mL H2O重新分散，制得Au@AgNRs。
实施例 6 Au@AgNRs的制备
将20mL金纳米棒溶液和20mL
0.2 mol/L的CTAB溶液混合，在45℃下搅拌，并顺序加入6 mL 0.1 mol/L的 AA溶液、1 mL 0.01 mol/L的AgNO3溶液和 6 mL 0.1 mol/L的NaOH溶液，停止搅拌，静置3h，离心分离后，加入20mL H2O重新分散，制得Au@AgNRs。
实施例 7 可再生光度探针的制备
将实施例1和实施例4制备的材料按比例CoFe2O4/rGo：Au@AgNRs：TMB：H2O
=1mg：0.5mL：0.1mg：2mL混合在一起，即制得可再生光度探针。
实施例 8 可再生光度探针的制备
将实施例2和实施例5制备的材料按比例CoFe2O4/rGo：Au@AgNRs：TMB：H2O
=3mg：0.8mL：0.5mg：2mL混合在一起，即制得可再生光度探针。
实施例 9 可再生光度探针的制备
将实施例3和实施例6制备的材料按比例CoFe2O4/rGo：Au@AgNRs：TMB：H2O
=5mg：1mL：1mg：2mL混合在一起，即制得可再生光度探针。
实施例 10 可再生光度探针的再生步骤
将实施例1-9制备的可再生光度探针应用于H2O2的检测，检测完毕后，将可再生光度探针放于强磁铁上，2小时后，在管壁上的附着一层黑色吸附物，将上层液弃掉，用H2O洗涤管壁上的吸附物，最后按比例加入0.1mgTMB和2mLH2O，即实现光度探针的再生。
实施例 11 可再生光度探针的再生步骤
将实施例1-9制备的可再生光度探针应用于H2O2的检测，检测完毕后，将可再生光度探针放于强磁铁上，3小时后，在管壁上的附着一层黑色吸附物，将上层液弃掉，用H2O洗涤管壁上的吸附物，最后按比例加入0.5mgTMB和2mLH2O，即实现光度探针的再生。
实施例 12 可再生光度探针的再生步骤
将实施例1-9制备的可再生光度探针应用于H2O2的检测，检测完毕后，将可再生光度探针放于强磁铁上， 4小时后，在管壁上的附着一层黑色吸附物，将上层液弃掉，用H2O洗涤管壁上的吸附物，最后按比例加入1mgTMB和2mLH2O，即实现光度探针的再生。
实施例 13 可再生光度探针应用于H2O2的检测步骤及技术指标
（1）将2mL已知浓度的H2O2标准溶液加入到6 mL、pH=7.0、浓度为0.1mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，加入2mL实施例1-9制备的可再生光度探针，放置3小时后，在520nm处检测吸光度；根据吸光度与H2O2标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线，检测技术指标为：线性范围为0.01~0.12 mmol/L，检出限为0.004mmol/L；
（2）将待测样品溶液代替H2O2的标准溶液，按照（1）所述的工作曲线的绘制方法进行检测。
实施例 14 可再生光度探针应用于H2O2的检测步骤
（1）将2mL已知浓度的H2O2标准溶液加入到6 mL、pH=7.5、浓度为0.1mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，加入2mL实施例1-9制备的可再生光度探针，放置3小时后，在520nm处检测吸光度；根据吸光度与H2O2标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线，检测技术指标为：线性范围为0.01~0.10 mmol/L，检出限为0.004mmol/L；
（2）将待测样品溶液代替H2O2的标准溶液，按照（1）所述的工作曲线的绘制方法进行检测。
实施例 15 可再生光度探针应用于H2O2的检测步骤
（1）将2mL已知浓度的H2O2标准溶液加入到6 mL、pH=8.0、浓度为0.1mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，加入2mL实施例1-9制备的可再生光度探针，放置4小时后，在520nm处检测吸光度；根据吸光度与H2O2标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线，检测技术指标为：线性范围为0.01~0.10 mmol/L，检出限为0.004mmol/L；
（2）将待测样品溶液代替H2O2的标准溶液，按照（1）所述的工作曲线的绘制方法进行检测。
实施例 16 可再生光度探针应用于人体血清中H2O2的检测步骤
准确移取人体血清样品，加入一定质量浓度的H2O2标准溶液，以未加入H2O2的人体血清为空白，进行加标回收实验，按照实施例13-15的步骤进行检测，测定人体血清样品中H2O2的回收率，检测结果的相对标准偏差（RSD）为3.8%（n=5），回收率为95%，表明本发明可用于人体血清样品中H2O2的检测。
Claims (2)
1.一种可再生光度探针，其特征在于所述可再生光度探针包括：铁酸钴/石墨烯纳米复合材料CoFe2O4/rGo、金@银核壳纳米棒复合材料溶胶Au@AgNRs和3,3’,5,5’-四甲基联苯胺TMB、去离子水H2O；
所述CoFe2O4/rGo的制备步骤：将10 mg氧化石墨烯超声分散到30 ml无水乙醇中，依次加入1 ml 0.2 mol/mL的硝酸铁Fe(NO3)3水溶液、0.5 ml of 0.2 mol/mL的硝酸钴Co(NO3)2水溶液和2.50 ml氨水，80℃下搅拌12h，然后转移至高压反应釜中，180℃下反应5h；冷却至室温后，离心分离，于50℃真空干燥箱中烘干，制得CoFe2O4/rGo；
所述Au@AgNRs的制备步骤：将20mL金纳米棒溶液和20mL 0.05~0.2 mol/L的十六烷基三甲基溴化铵CTAB溶液混合，在30~45℃下搅拌，并顺序加入3~6 mL
0.1 mol/L的 L-抗坏血酸AA溶液、0.5~1 mL
0.01 mol/L的AgNO3溶液和 3~6 mL
0.1 mol/L的氢氧化钠NaOH溶液，停止搅拌，静置1~3h，离心分离后，加入20mL H2O重新分散，制得Au@AgNRs；
所述可再生光度探针各部分组成比例为CoFe2O4/rGo：Au@AgNRs：TMB：H2O =1~5mg：0.5~1mL：0.1~1mg：2mL；
所述可再生光度探针的再生步骤：将检测完毕后的可再生光度探针放于强磁铁上，2~4小时后，在管壁上的附着一层黑色吸附物，将上层液弃掉，用H2O洗涤管壁上的吸附物，最后按比例加入0.1~1mgTMB和2mLH2O，即实现可再生光度探针的再生。
2.一种如权利要求1所述的一种可再生光度探针在H2O2检测中的应用，步骤如下：
1）将2mL已知浓度的H2O2标准溶液加入到6 mL、pH=7.0~8.0的乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，加入2mL可再生光度探针，放置3~4小时后，在520nm处检测吸光度；根据吸光度与H2O2标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；
2）将待测样品溶液代替H2O2的标准溶液，按照1）所述的工作曲线的绘制方法进行检测；
所述乙酸-乙酸钠缓冲溶液的浓度为0.1mol/L。
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