CN111562255A - 一种基于还原氧化石墨烯猝灭鲁米诺@金纳米粒子的化学发光传感器的制备方法 - Google Patents

一种基于还原氧化石墨烯猝灭鲁米诺@金纳米粒子的化学发光传感器的制备方法 Download PDF

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王雪莹
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韩蕊
代玉雪
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Abstract

本发明公开了一种基于还原氧化石墨烯猝灭鲁米诺@金纳米粒子的化学发光传感器的制备方法及应用技术，属于化学发光传感领域。主要技术特征是：首先制备还原氧化石墨烯/腺苷适配体和鲁米诺@金纳米粒子/互补链DNA，再通过碱基互补配对作用将两种材料复合，得到鲁米诺@金纳米粒子/互补链DNA‑腺苷适配体/还原氧化石墨烯；并将该材料用于化学发光检测腺苷中，实现对腺苷的检测，为该方法进一步应用于临床腺苷等生物标志物的检测提供了理论支撑。

Description

一种基于还原氧化石墨烯猝灭鲁米诺@金纳米粒子的化学发 光传感器的制备方法
技术领域
本发明涉及的是一种基于还原氧化石墨烯猝灭鲁米诺@金纳米粒子的化学发光传感器的制备方法及应用技术，属于化学发光传感领域，具体涉及鲁米诺@金纳米粒子/互补链DNA-腺苷适配体/还原氧化石墨烯的制备及其在化学发光检测腺苷中的应用。
背景技术
近年来，文明、科技、工业的进步虽然带来许多无可争辩的好处，但也使人们赖以生存的自然环境发生了一些不可逆转的变化，并已经开始威胁到人们的健康和生命。随着医疗水平的不断进步，越来越多的疾病检测方法被研究出来并且应用于临床的诊断中，而通过对人体内疾病相关生物分子的检测来判断疾病的发生和发展已经成为一种必要手段。人体内某些生物分子含量的变化与人体正常生命活动以及疾病的发生密切相关。因此，对于疾病相关生物分子含量的检测可以节省病人的治疗过程中没必要损耗的时间，为疾病的早期诊断及治疗提供理论依据，从而在医学及临床等领域具有十分重要的意义。目前疾病诊断技术主要是基于标记性检验技术发展起来的一些检测方法，包括酶联免疫吸附法、荧光免疫分析法、放射免疫检测法和化学发光免疫分析法等。然而，这些技术虽然具有许多优点，但是仍然存在着一些缺点和不足，如复杂、昂贵、耗时以及标记过程繁琐等。因此，有必要设计和开发一种检测疾病相关生物分子的简单快速、准确高效的方法。
生物传感器是理想的实现分子快速、灵敏以及低成本检测的工具，通常被描述为由分子识别元件（敏感元件）、转换器（信号转换部分）以及信号处理单元组成的三元系统。其中，分子识别元件在生物传感器十分重要，是生物传感器的基础和核心，可让分析物与其相互作用后产生可量化的信号，从而完成对生物物质的分析和检测。常见的分子识别元件有适配体、抗体和酶，它们对于特定的目标分子具有很好的选择性和特异性。转换器和敏感元件紧密相连，它可以在信号转变后将信号传递给处理单元进行分析。生物传感技术以其选择性好、灵敏度高、分析速度快等特点，自21世纪以来得到了丰富与蓬勃的发展，并在新兴高新技术产业中具有重要地位。近年来，科研者们一直致力于改进敏感元件、传感材料和接口设计，以满足不断提高的精度、成本、便携性和易用性标准。生物传感器在环境、食品检测、医药等领域展现出广阔的应用前景。
化学发光适配体传感器是综合了化学发光法、适配体以及生物传感器的优势而逐渐发展起来的一种新型生物传感器，可以弥补其他生物分子检测方法本身具有的缺点，如依赖大型设备、试剂制备复杂、对环境敏感等，并且因为化学发光法本身具有线性范围宽、成本低廉、操作简单等优点，适配体的引入克服了化学发光法本身选择性差的问题，使得化学发光适配体传感器成为许多生物检测相关领域的研究热点，实现了对凝血酶、多巴胺、腺苷等生物分子的高灵敏、高选择性、准确快速检测。
本发明旨在制备一种基于还原氧化石墨烯猝灭鲁米诺@金纳米粒子的化学发光传感器。适配体作为识别元件、鲁米诺@金纳米粒子作为化学发光体，合成功能化的鲁米诺@金纳米粒子/互补链DNA-腺苷适配体/还原氧化石墨烯；并将该材料用于化学发光检测腺苷中，实现对腺苷的高灵敏、高选择性、准确快速检测，发明了一种检测腺苷等疾病标志物的新方法。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种基于还原氧化石墨烯猝灭鲁米诺@金纳米粒子的化学发光传感器，首先制备还原氧化石墨烯/腺苷适配体和鲁米诺@金纳米粒子/互补链DNA，再通过碱基互补配对作用将两种材料复合，得到鲁米诺@金纳米粒子/互补链DNA-腺苷适配体/还原氧化石墨烯，并将该功能化材料用于化学发光传感器的构建，实现对腺苷的高灵敏、高选择性、准确快速检测。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
（1）还原氧化石墨烯的制备：还原氧化石墨烯采用多巴胺还原氧化石墨烯的方法获得，称取0.05 ~ 0.1 g氧化石墨烯放入250 mL烧杯中，并向其中加入50 ~ 100 mL超纯水，超声2 ~ 4 h；接着向烧杯中加入0.2 ~ 0.4 g多巴胺，继续超声2 ~ 4 h；将烧杯转移至80 ~ 90ºC油浴锅中反应2 ~ 4 h；得到的产物用超纯水洗涤三次，最后在8000 r/min条件下离心分离，将分离后的沉淀放入50 ~ 60ºC真空干燥箱中烘干；
（2）还原氧化石墨烯/腺苷适配体的制备：称取0.01 ~ 0.05 g上述（1）中制备的还原氧化石墨烯，将其均匀分散于30 ~ 50 mL超纯水中；向该分散液中加入0.01 ~ 0.03 g 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺和0.01 ~ 0.03 g N-羟基琥珀酰亚胺；将0.01 ~0.02 μmol腺苷适配体加入上述分散液中，室温下孵化2 ~ 4 h；在8000 r/min条件下离心分离8 ~ 10 min，将分离后的沉淀放入50 ~ 60ºC真空干燥箱中烘干；
（3）鲁米诺@金纳米粒子的制备：移取2 ~ 4 mL 0.05 mol/L的氯金酸溶液于250 mL锥形瓶中，加入超纯水稀释至100 mL，加热至沸腾；在强烈搅拌下，迅速加入0.05 mol/L的鲁米诺标准储备溶液1 ~ 3 mL，继续加热直至溶液转为酒红色；停止加热后，使溶液冷却至室温，得到鲁米诺@金纳米粒溶液，将其置于4ºC冰箱中保存备用；
（4）鲁米诺@金纳米粒子/互补链DNA的制备：称取2 ~ 5 mL上述（3）中制备的鲁米诺@金纳米粒子溶液于10 mL离心管中，并向试管中加入0.02 ~ 0.05 μmol的互补链DNA，室温下孵化2 ~ 4 h；在8000 r/min条件下离心分离8 ~ 10 min，将分离后的沉淀重新溶解于25mL pH为7.0 ~ 7.4的磷酸盐缓冲液中；
（5）鲁米诺@金纳米粒子/互补链DNA-腺苷适配体/还原氧化石墨烯的制备：移取2 ~ 5mL 0.01 mol/L的上述（2）中制备的还原氧化石墨烯/腺苷适配体分散液于15 mL离心管中，并向试管中加入2 ~ 5 mL上述（4）中制备的鲁米诺@金纳米粒子/互补链DNA溶液，室温下孵化2 ~ 4 h；在8000 r/min条件下离心分离8 ~ 10 min，将分离后的沉淀重新分散到50 mLpH为7.0 ~ 7.4的磷酸盐缓冲液中；
（6）化学发光传感器的制备：在25 mL比色管中加入2 ~ 5 mL上述（5）中制备的鲁米诺@金纳米粒子/互补链DNA-腺苷适配体/还原氧化石墨烯分散液，当没有腺苷分子存在时，由于还原氧化石墨烯可以猝灭鲁米诺@金纳米粒子的化学发光，所以没有化学发光现象发生；移取1 ~ 2 mL腺苷待测液加入到该比色管中，腺苷分子和腺苷适配体因为特异性识别而结合在一起，使得鲁米诺@金纳米粒子脱离还原氧化石墨烯，所以还原氧化石墨烯对鲁米诺@金纳米粒子的猝灭作用消失，化学发光得到恢复，实现了对腺苷分子的定量检测。
步骤（1）中所述的氧化石墨烯为厚度小于5 nm的单层氧化石墨烯。
步骤（3）中所述的金纳米粒子采用柠檬酸钠还原氯金酸的方法制备得到，粒径小于10 nm。
通过改变适配体的种类，可以实现不同待测物分子的检测。
本发明的优点及效果是：
（1）本发明制备了一种以适配体作为识别元件、鲁米诺@金纳米粒子作为化学发光体的功能化复合材料 - 鲁米诺@金纳米粒子/互补链DNA-腺苷适配体/还原氧化石墨烯，该复合材料的合成通过碱基互补配对作用即可，条件操作均简单；
（2）本发明制备了一种基于还原氧化石墨烯猝灭鲁米诺@金纳米粒子的化学发光传感器，通过改变适配体的种类，可以实现不同待测物分子的检测；
（3）本发明制备了一种基于还原氧化石墨烯猝灭鲁米诺@金纳米粒子的化学发光传感器，该传感器检测腺苷表现出优异的选择性和高的灵敏度，为该传感器进一步应用于其他疾病标志物的检测提供了理论支撑。
附图说明
图1是还原氧化石墨烯猝灭鲁米诺@金纳米粒子的化学发光图谱。
具体实施方式
实施例1
（1）还原氧化石墨烯的制备：还原氧化石墨烯采用多巴胺还原氧化石墨烯的方法获得，称取0.05 g氧化石墨烯放入250 mL烧杯中，并向其中加入50 mL超纯水，超声2 h；接着向烧杯中加入0.2 g多巴胺，继续超声2 h；接着将烧杯转移至80ºC油浴锅中反应2 h；得到的还原氧化石墨烯用超纯水洗涤三次，最后在8000 r/min条件下离心分离，将分离后的沉淀放入50ºC真空干燥箱中烘干；
（2）还原氧化石墨烯/腺苷适配体的制备：称取0.01 g上述（1）中制备的还原氧化石墨烯均匀分散于30mL超纯水中；向该分散液中加入0.01 g 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺和0.01 g N-羟基琥珀酰亚胺；将0.01 μmol腺苷适配体加入上述溶液中，室温下孵化2h；在8000 r/min条件下离心分离8 min，将分离后的沉淀放入50ºC真空干燥箱中烘干；
（3）鲁米诺@金纳米粒子的制备：移取2 mL 0.05 mol/L的氯金酸溶液于250 mL锥形瓶中，加入超纯水稀释至100 mL，加热至沸腾；在强烈搅拌下，迅速加入0.05 mol/L的鲁米诺标准储备溶液1 mL，继续加热直至溶液转为酒红色；停止加热后，使溶液冷却至室温，得到鲁米诺@金纳米粒溶液，将其置于4ºC冰箱中保存备用；
（4）鲁米诺@金纳米粒子/互补链DNA的制备：称取2 mL上述（3）中制备的鲁米诺@金纳米粒子溶液于10 mL离心管中，并向试管中加入0.02 μmol互补链DNA，室温下孵化2 h；在8000r/min条件下离心分离8 min，将分离后的沉淀重新溶解于25 mL pH为7.0 ~ 7.4的磷酸盐缓冲液中；
（5）鲁米诺@金纳米粒子/互补链DNA-腺苷适配体/还原氧化石墨烯的制备：移取2 mL0.01 mol/L上述（2）中制备的还原氧化石墨烯/腺苷适配体分散液于15 mL离心管中，并向试管中加入2 mL上述（4）中制备的鲁米诺@金纳米粒子/互补链DNA溶液，室温下孵化2 h；在8000 r/min条件下离心分离8 min，将分离后的沉淀重新分散于50 mL pH为7.0的磷酸盐缓冲液中；
（6）化学发光传感器的制备：在25 mL比色管中加入2 mL上述（5）中制备的鲁米诺@金纳米粒子/互补链DNA-腺苷适配体/还原氧化石墨烯分散液，当没有腺苷分子存在时，由于还原氧化石墨烯可以猝灭鲁米诺@金纳米粒子的化学发光现象，所以没有化学发光现象发生；移取1 mL的腺苷待测液加入到该比色管中，腺苷分子和腺苷适配体因为特异性识别而结合在一起，使得鲁米诺@金纳米粒子脱离还原氧化石墨烯，所以还原氧化石墨烯对鲁米诺@金纳米粒子的猝灭作用消失，化学发光得到恢复，实现对腺苷分子的定量检测。
实施例2
（1）还原氧化石墨烯的制备：还原氧化石墨烯采用多巴胺还原氧化石墨烯的方法获得，称取0.08 g氧化石墨烯放入250 mL烧杯中，并向其中加入80 mL超纯水，超声2 h；接着向烧杯中加入0.3 g多巴胺，继续超声2 h；接着将烧杯转移至85ºC油浴锅中反应2 h；得到的还原氧化石墨烯用超纯水洗涤三次，最后在8000 r/min条件下离心分离，将分离后的沉淀放入50ºC真空干燥箱中烘干；
（2）还原氧化石墨烯/腺苷适配体的制备：称取0.02 g上述（1）中制备的还原氧化石墨烯均匀分散于40 mL超纯水中；向该分散液中加入0.02 g 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺和0.02 g N-羟基琥珀酰亚胺；将0.01 μmol腺苷适配体加入上述溶液中，室温下孵化2 h；在8000 r/min条件下离心分离8 min，将分离后的沉淀放入50ºC真空干燥箱中烘干；
（3）鲁米诺@金纳米粒子的制备：移取2 mL 0.05 mol/L的氯金酸溶液于250 mL锥形瓶中，加入超纯水稀释至100 mL，加热至沸腾；在强烈搅拌下，迅速加入0.05 mol/L的鲁米诺标准储备溶液2 mL，继续加热直至溶液转为酒红色；停止加热后，使溶液冷却至室温，得到鲁米诺@金纳米粒溶液，将其置于4ºC冰箱中保存备用；
（4）鲁米诺@金纳米粒子/互补链DNA的制备：称取4 mL上述（3）中制备的鲁米诺@金纳米粒子溶液于10 mL离心管中，并向试管中加入0.02 μmol互补链DNA，室温下孵化2 h；在8000r/min条件下离心分离8 min，将分离后的沉淀重新溶解于25 mL pH为7.2的磷酸盐缓冲液中；
（5）鲁米诺@金纳米粒子/互补链DNA-腺苷适配体/还原氧化石墨烯的制备：移取4 mL0.01 mol/L上述（2）中制备的还原氧化石墨烯/腺苷适配体分散液于15 mL离心管中，并向试管中加入3 mL上述（4）中制备的鲁米诺@金纳米粒子/互补链DNA溶液，室温下孵化2 h；在8000 r/min条件下离心分离8 min，将分离后的沉淀重新分散于50 mL pH为7.2的磷酸盐缓冲液中；
（6）化学发光传感器的制备：在25 mL比色管中加入4 mL上述（5）中制备的鲁米诺@金纳米粒子/互补链DNA-腺苷适配体/还原氧化石墨烯分散液，当没有腺苷分子存在时，由于还原氧化石墨烯可以猝灭鲁米诺@金纳米粒子的化学发光现象，所以没有化学发光现象发生；移取1.5 mL的腺苷待测液加入到该比色管中，腺苷分子和腺苷适配体因为特异性识别而结合在一起，使得鲁米诺@金纳米粒子脱离还原氧化石墨烯，所以还原氧化石墨烯对鲁米诺@金纳米粒子的猝灭作用消失，化学发光得到恢复，实现对腺苷分子的定量检测。
实施例3
（1）还原氧化石墨烯的制备：还原氧化石墨烯采用多巴胺还原氧化石墨烯的方法获得，称取0.1 g氧化石墨烯放入250 mL烧杯中，并向其中加入100 mL超纯水，超声4 h；接着向烧杯中加入0.4 g多巴胺，继续超声4 h；接着将烧杯转移至90ºC油浴锅中反应4 h；得到的还原氧化石墨烯用超纯水洗涤三次，最后在8000 r/min条件下离心分离，将分离后的沉淀放入60ºC真空干燥箱中烘干；
（2）还原氧化石墨烯/腺苷适配体的制备：称取0.05 g上述（1）中制备的还原氧化石墨烯均匀分散于50 mL超纯水中；向该分散液中加入0.03 g 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺和0.03 g N-羟基琥珀酰亚胺；将0.02 μmol腺苷适配体加入上述溶液中，室温下孵化4 h；在8000 r/min条件下离心分离10 min，将分离后的沉淀放入60ºC真空干燥箱中烘干；
（3）鲁米诺@金纳米粒子的制备：移取4 mL 0.05 mol/L的氯金酸溶液于250 mL锥形瓶中，加入超纯水稀释至100 mL，加热至沸腾；在强烈搅拌下，迅速加入0.05 mol/L的鲁米诺标准储备溶液3 mL，继续加热直至溶液转为酒红色；停止加热后，使溶液冷却至室温，得到鲁米诺@金纳米粒溶液，将其置于4ºC冰箱中保存备用；
（4）鲁米诺@金纳米粒子/互补链DNA的制备：称取5 mL上述（3）中制备的鲁米诺@金纳米粒子溶液于10 mL离心管中，并向试管中加入0.05 μmol互补链DNA，室温下孵化4 h；在8000r/min条件下离心分离10 min，将分离后的沉淀重新溶解于25 mL pH为7.4的磷酸盐缓冲液中；
（5）鲁米诺@金纳米粒子/互补链DNA-腺苷适配体/还原氧化石墨烯的制备：移取5 mL0.01 mol/L上述（2）中制备的还原氧化石墨烯/腺苷适配体分散液于15 mL离心管中，并向试管中加入5 mL上述（4）中制备的鲁米诺@金纳米粒子/互补链DNA溶液，室温下孵化4 h；在8000 r/min条件下离心分离10 min，将分离后的沉淀重新分散于50 mL pH为7.4的磷酸盐缓冲液中；
（6）化学发光传感器的制备：在25 mL比色管中加入5.0 mL上述（5）中制备的鲁米诺@金纳米粒子/互补链DNA-腺苷适配体/还原氧化石墨烯分散液，当没有腺苷分子存在时，由于还原氧化石墨烯可以猝灭鲁米诺@金纳米粒子的化学发光现象，所以没有化学发光现象发生；移取2 mL的腺苷待测液加入到该比色管中，腺苷分子和腺苷适配体因为特异性识别而结合在一起，使得鲁米诺@金纳米粒子脱离还原氧化石墨烯，所以还原氧化石墨烯对鲁米诺@金纳米粒子的猝灭作用消失，化学发光得到恢复，实现对腺苷分子的定量检测。

Claims (4)

1.一种基于还原氧化石墨烯猝灭鲁米诺@金纳米粒子的化学发光传感器的制备方法，其特征在于，该方法具有以下工艺步骤：
（1）还原氧化石墨烯的制备：还原氧化石墨烯采用多巴胺还原氧化石墨烯的方法获得，称取0.05 ~ 0.1 g氧化石墨烯放入250 mL烧杯中，并向其中加入50 ~ 100 mL超纯水，超声2 ~ 4 h；接着向烧杯中加入0.2 ~ 0.4 g多巴胺，继续超声2 ~ 4 h；将烧杯转移至80 ~ 90ºC油浴锅中反应2 ~ 4 h；得到的产物用超纯水洗涤三次，最后在8000 r/min条件下离心分离，将分离后的沉淀放入50 ~ 60ºC真空干燥箱中烘干；
（2）还原氧化石墨烯/腺苷适配体的制备：称取0.01 ~ 0.05 g上述（1）中制备的还原氧化石墨烯，将其均匀分散于30 ~ 50 mL超纯水中；向该分散液中加入0.01 ~ 0.03 g 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺和0.01 ~ 0.03 g N-羟基琥珀酰亚胺；将0.01 ~0.02 μmol腺苷适配体加入上述分散液中，室温下孵化2 ~ 4 h；在8000 r/min条件下离心分离8 ~ 10 min，将分离后的沉淀放入50 ~ 60ºC真空干燥箱中烘干；
（3）鲁米诺@金纳米粒子的制备：移取2 ~ 4 mL 0.05 mol/L的氯金酸溶液于250 mL锥形瓶中，加入超纯水稀释至100 mL，加热至沸腾；在强烈搅拌下，迅速加入0.05 mol/L的鲁米诺标准储备溶液1 ~ 3 mL，继续加热直至溶液转为酒红色；停止加热后，使溶液冷却至室温，得到鲁米诺@金纳米粒溶液，将其置于4ºC冰箱中保存备用；
（4）鲁米诺@金纳米粒子/互补链DNA的制备：称取2 ~ 5 mL上述（3）中制备的鲁米诺@金纳米粒子溶液于10 mL离心管中，并向试管中加入0.02 ~ 0.05 μmol的互补链DNA，室温下孵化2 ~ 4 h；在8000 r/min条件下离心分离8 ~ 10 min，将分离后的沉淀重新溶解于25mL pH为7.0 ~ 7.4的磷酸盐缓冲液中；
（5）鲁米诺@金纳米粒子/互补链DNA-腺苷适配体/还原氧化石墨烯的制备：移取2 ~ 5mL 0.01 mol/L的上述（2）中制备的还原氧化石墨烯/腺苷适配体分散液于15 mL离心管中，并向试管中加入2 ~ 5 mL上述（4）中制备的鲁米诺@金纳米粒子/互补链DNA溶液，室温下孵化2 ~ 4 h；在8000 r/min条件下离心分离8 ~ 10 min，将分离后的沉淀重新分散到50 mLpH为7.0 ~ 7.4的磷酸盐缓冲液中；
（6）化学发光传感器的制备：在25 mL比色管中加入2 ~ 5 mL上述（5）中制备的鲁米诺@金纳米粒子/互补链DNA-腺苷适配体/还原氧化石墨烯分散液，当没有腺苷分子存在时，由于还原氧化石墨烯可以猝灭鲁米诺@金纳米粒子的化学发光，所以没有化学发光现象发生；移取1 ~ 2 mL腺苷待测液加入到该比色管中，腺苷分子和腺苷适配体因为特异性识别而结合在一起，使得鲁米诺@金纳米粒子脱离还原氧化石墨烯，所以还原氧化石墨烯对鲁米诺@金纳米粒子的猝灭作用消失，化学发光得到恢复，实现了对腺苷分子的定量检测。
2.根据权利要求1所述的一种基于还原氧化石墨烯猝灭鲁米诺@金纳米粒子的化学发光传感器的制备方法，其特征是：步骤（1）中所述的氧化石墨烯为厚度小于5 nm的单层氧化石墨烯。
3.根据权利要求1所述的一种基于还原氧化石墨烯猝灭鲁米诺@金纳米粒子的化学发光传感器的制备方法，其特征是：步骤（3）中所述的金纳米粒子采用柠檬酸钠还原氯金酸的方法制备得到，粒径小于10 nm。
4.根据权利要求1所述的一种基于还原氧化石墨烯猝灭鲁米诺@金纳米粒子的化学发光传感器的制备方法，其特征是：通过改变适配体的种类，可以实现不同待测物分子的检测。
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