CN111999406A - 一种测定婴幼儿奶粉中链格孢霉毒素残留的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种测定婴幼儿奶粉中链格孢霉毒素残留的方法，属于食品安全检测技术领域。所述方法包括下列步骤：(1)样品制备；(2)固相萃取；(3)液相色谱检测。本发明提供的方法应用于实际样品的检测，结果显示，该方法操作简便、灵敏度强，重现性好，准确性高，完全可以满足日常对于链格孢霉毒素的检测要求。
Description
技术领域
本发明涉及一种测定婴幼儿奶粉中链格孢霉毒素残留的方法，属于食品安全检测技术领域。
背景技术
欧盟食品安全局(European Food Safety Authority,EFSA)最新膳食暴露风险评估报告表明，低幼龄童对链格孢霉毒素的膳食暴露量最大，考虑到婴幼儿奶粉因其配料植物油易受到链格孢霉毒素污染，以及在婴幼儿膳食中的重要贡献，而成为重点关注的食品。
目前已鉴明的链格孢霉毒素约有70余种，从结构上区分主要可分为5类：第一类为二苯并吡喃酮类及其衍生物，主要包括链格孢酚(Alternariol，AOH)、交链格孢酚单甲醚(Alternariol mono-methyl ether，AME)和交链孢烯(Altenuene，ALT)；第二类为四氨基酸衍生物类，代表毒素为细交链格孢菌酮酸(Tenuazonic acid，TeA)及异细交链孢菌酮酸(iso-tenuazonic acid，iso-TeA)；第三类为二萘嵌苯醌类，包括ATX-I、ATX-II、ATX-III等一类衍生物；第四类为丙三羧酸酯类化合物，即AAL毒素，又可分为AAL-TA和AAL-TB两大类；第五类为包括腾毒素(Tentoxin，Ten)在内的其它结构类型。
链格孢霉毒素是一类重要的真菌毒素，但其限量标准目前仍未出台，导致该毒素检测技术发展较为缓慢。目前链格孢霉毒素的前处理方法通常采用QuEChERs法，但是对于奶粉基质，因其成分复杂，QuEChERs法在奶粉基质检测链格孢霉毒素的回收率效果不佳，并不适用于在奶粉基质中链格孢霉毒素的检测。因此，亟需寻找一种适用于在奶粉基质中链格孢霉毒素的检测方法。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种婴幼儿奶粉中7种链格孢霉毒素的液相色谱-串联质谱检测方法。
本发明披露了一种提取奶粉中链格孢霉毒素的前处理方法，所述方法包括以下步骤：
(1)提取：将奶粉放置于容器中，加入提取剂进行提取，取上清液后，氮吹；
(2)固相萃取：将步骤(1)氮吹后得到的溶液进行固相萃取，过膜；
所述步骤(1)中提取剂包含乙腈，所述提取剂中乙腈的体积百分数为70％～90％(v/v)；所述步骤(2)固相萃取后无需进行浓缩步骤。
在本发明一种实施方式中，所述链格孢霉毒素包括腾毒素(Ten)、交链孢烯(ALT)、交链格孢酚单甲醚(AME)、链格孢酚(AOH)、细交链格孢菌酮酸(TeA)、细格菌素(ATS)和/或链格孢菌毒素I(ATX-I)。
在本发明一种实施方式中，所述提取剂中还包括甲酸，甲酸的体积浓度为1-5％。
在本发明一种实施方式中，所述提取分为三次提取，三次提取剂均为乙腈水溶液，乙腈的体积百分数为70％～90％。
在本发明一种实施方式中，所述提取分为三次提取，三次提取剂中前两次为乙腈水溶液，乙腈的体积百分数为70％～90％；第三次提取剂为乙腈甲醇水溶液，乙腈、甲醇和水的体积比为(40-50)：(10-30)：(20-50)。
优选地，前两次提取液甲酸-乙腈-水溶液中甲酸的体积浓度为2％，乙腈的体积浓度为84％；第三次提取液甲酸-乙腈-甲醇-水溶液中甲酸的体积浓度为2％，乙腈的体积浓度为45％，甲醇的体积浓度为10％。
在本发明一种实施方式中，所述固相萃取条件为：固相萃取柱为HLB小柱，洗脱液为甲醇和乙腈。
在本发明一种实施方式中，所述洗脱液的体积为5-10mL。
本发明披露了一种测定奶粉中链格孢霉毒素含量的方法，所述方法是应用上述预处理方法对奶粉中的链格孢霉毒素进行提取，再采用液相色谱串联质谱法对链格孢霉毒素进行定量检测。
在本发明一种实施方式中，所述色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18液相色谱柱(50mm×2.1mm，1.7μm)。
在本发明一种实施方式中，所述洗脱条件为柱温40℃；流动相A为0.1％甲酸溶液，流动相B为乙腈；梯度洗脱程序：0～5.0min，90％～5％A；5.0～7.0min，5％A；7.0～7.5min，5％～90％A；7.5～10.0min，90％A；0～5.0min，10％～95％B；5.0～7.0min，95％B；7.0～7.5min，95％～10％B；7.5～10.0min，10％B。此处百分比均为体积比。进样量为5μL；流速为0.40mL/min。。
本发明还披露了一种所述预处理方法和检测方法在奶粉和米粉安全检测方面的应用。
本发明的有益效果：
1.采用本发明方法回收率可达108％，且适用范围广，能实现多种链格孢霉毒素回收率均达到82％。
2.本发明在40℃常压下进行萃取，避免了目标分析物在高温高压下可能发生分解，有利于提高回收率和准确性。
3.本发明提供的方法应用于实际样品的检测，结果显示，该方法操作简便、检出限低至0.29μg/kg，灵敏度强，重现性好，准确性高，完全可以满足日常对于交链孢霉毒素的检测要求。
附图说明
图1为不同提取剂及其配比对链格孢霉毒素回收率的影响。
图2是7种链格孢霉毒素总离子流图，其中，1为2.38min，ALT；2为2.64min，TeA；3为2.72min，AOH；4为2.88min，Ten；5为3.55min，AME；6为3.66min，ATX-I；7为4.42min，ATS。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。
实施例1：一种提取奶粉中链格孢霉毒素的前处理方法
一种提取奶粉中链格孢霉毒素的前处理方法，所述方法包括以下步骤：
(1)提取：分别称取奶粉1g(精确到0.01g)于50mL尖底具塞离心管内，加入15mL乙腈：水＝84:16(v:v)，加入0.3mL甲酸，水平摇匀30min，在9500r/min下离心5min，取上清液，沉淀重复提取。第3次提取加入15mL乙腈：甲醇：水＝45:10:45(v：v：v)，加入0.3mL甲酸，水平摇匀30min，9500r/min下离心5min，多次提取的上清液混合于40℃氮吹，之后重悬于12mL水(PH＝5.5)中。
(2)固相萃取：使用HLB固相萃取小柱(200mg，6mL)萃取，依次用6mL甲醇和6mL水(PH＝5.5)活化，随后将全部提取液过柱，用12mL水淋洗小柱，最后用10mL甲醇进行洗脱，振荡混匀，取1mL过0.22μm有机滤膜，待测。
实施例2：
将第三次萃取的溶液换为乙腈：甲醇：水＝50:25:25(v：v：v)溶液，其余操作和步骤与实施例1相同，即依次用15mL乙腈：水＝84:16(v:v)、15mL乙腈：水＝84:16(v:v)和15mL乙腈：甲醇：水＝50:25:25(v：v：v)进行水浴振荡萃取。结果如图1所示，各链格孢霉毒素的回收率为66.3％～90.8％。
实施例3：
将前两次萃取的溶液换为纯乙腈溶液，其余操作和步骤与实施例1相同，即依次用15mL乙腈、15mL乙腈和15mL乙腈：甲醇：水＝45:10:45(v：v：v)进行水浴振荡萃取。结果如图1所示，各链格孢霉毒素的回收率为51.9％～95.4％。
实施例4：
将前两次萃取的溶液换为乙腈：水＝1:1(v:v)溶液，其余操作和步骤与实施例1相同，即依次用15mL乙腈：水＝1:1(v:v)、15mL乙腈：水＝1:1(v:v)和15mL乙腈：甲醇：水＝45:10:45(v：v：v)进行水浴振荡萃取。结果如图1所示，各链格孢霉毒素的回收率为29.6％～78.5％。
实施例5：
将第三次萃取的溶液换为乙腈：水＝84:16(v:v)溶液，其余操作和步骤与实施例1相同，即三次萃取溶液均用乙腈：水＝84:16(v:v)溶液进行水浴振荡萃取。结果如图1所示，各链格孢霉毒素的回收率为60.2％～88.7％。
由图1可知，实施例1分别采用15mL乙腈：水＝84:16(v:v)、15mL乙腈：水＝84:16(v:v)和15mL乙腈：甲醇：水＝45:10:45(v：v：v)进行提取，各链格孢霉毒素的回收率为80.8％～96.4％。实施例1-5的对照结果说明了提取剂中乙腈的体积百分数较为重要，过低或过高都会影响链格孢霉毒素的回收率。
实施例6：
一种测定奶粉中链格孢霉毒素含量的方法，所述方法包括下列步骤：
1)标准样品溶液制备：
标准储备液：分别准确称取腾毒素、交链孢烯、交链格孢酚单甲醚、链格孢酚、细交链格孢菌酮酸、细格菌素以及ATX-I0.001g溶于10mL乙腈中，配制成100μg/mL的标准混合液，取100μg/mL的标准混合液100μL用乙腈溶解并定容至10mL，得到1μg/mL的标准储备液，密封后置于-20℃保存。
标准工作液：用乙腈与水(v：v＝1：1)将标准储备液逐级配制成0.5、1、2、5、10、20、50、100、200ng/mL的6种链格孢霉毒素的混合标准溶液。
2)液相色谱串联质谱法检测
采用液相色谱串联质谱法对上述标准工作液和实施例1得到的待测液中的链格孢霉毒素进行检测。
1、液相色谱的检测条件
流动相A：水(含0.1％甲酸)；
流行相B：乙腈；
流动相梯度洗脱条件见表1；
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18液相色谱柱(50mm×2.1mm，1.7μm)；
柱温：40℃；
进样量：5μL。
表1流动相梯度洗脱条件
2.质谱参考条件
离子源：电喷雾离子源；
离子化方式：正负离子切换扫描；
监测方式：多反应监测，MRM参数见表2；
离子源条件：毛细管电压：1.08kV；锥孔电压：25V；射频透镜1(RF lens 1)和射频透镜2(RF lens 2)的电压均为15.0V；离子源温度：150℃；脱溶剂温度：600℃；脱溶剂气流量：1000L/h；锥孔反吹气：150L/h。
表2MRM参数
注：*为定量离子
以空白基质提取液配置梯度标准溶液，以峰面积为纵坐标，待测物的浓度为横坐标进行线性回归，结果如表3所示，7种链格孢霉毒素的相关系数均大于0.99，浓度范围内线性关系良好。方法的检测低限以定量、定性离子的信噪比≥3确定。
表3线性关系和检出限
实施例7：方法的准确性和重复性
在空白奶粉样品中添加3个浓度水平的链格孢霉毒素混合标准溶液，每个添加水平5个平行样品，计算回收率和精密度，结果如下表所示。
表4方法回收率和精密度
对比例1：QuEChERs法
将固相萃取步骤去掉，仅进行三次提取液萃取链格孢霉毒素，相当于优化过的QuEChERs法进行前处理，具体步骤如下：
分别称取奶粉1g(精确到0.01g)于50mL尖底具塞离心管内，加入15mL乙腈：水＝84:16(v:v)，加入0.3mL甲酸，水平摇匀30min，在9500r/min下离心5min，取上清液，沉淀重复提取。第3次提取加入15mL乙腈：甲醇：水＝45:10:45(v：v：v)，加入0.3mL甲酸，水平摇匀30min，9500r/min下离心5min，多次提取的上清液混合于40℃氮吹，之后复溶于1mL甲醇中。过0.22μm有机滤膜，上机测定。
结果表明QuEChERs法提取的链格孢霉毒素的回收率仅为58.6％～84.9％，低于固相萃取提取链格孢霉毒素的回收率。说明QuEChERs法萃取奶粉中链格孢霉毒素效果不及固相萃取方法。
对比例2：
参照实施例1的方法进行处理，区别在于，洗脱后增加一步氮吹浓缩步骤，即将步骤(2)所得到的10mL洗脱液于40℃下进行氮吹吹干，1mL甲醇复溶，涡旋混匀，上机测定。结果发现AOH、AME的回收率过低，仅为28.7％和42.5％。说明浓缩之后的回收率比未浓缩的回收率效果不好。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种提取奶粉中链格孢霉毒素的前处理方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)提取：将奶粉放置于容器中，加入提取剂进行提取，取上清液后，氮吹；
(2)固相萃取：将步骤(1)氮吹后得到的溶液进行固相萃取，过膜；
所述步骤(1)中提取剂包含乙腈，所述提取剂中乙腈的体积百分数为70％～90％；
所述步骤(2)固相萃取后无需进行浓缩步骤。
2.根据权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，所述链格孢霉毒素包括腾毒素、交链孢烯、交链格孢酚单甲醚、链格孢酚、细交链格孢菌酮酸、细格菌素和/或ATX-I。
3.根据权利要求1或2所述的前处理方法，其特征在于，所述提取剂中还包括甲酸，甲酸的体积浓度为1-5％。
4.根据权利要求1-3任一项所述的前处理方法，其特征在于，所述提取分为三次提取，三次提取剂均为乙腈水溶液，乙腈的体积百分数为70％～90％。
5.根据权利要求1-3任一项所述的前处理方法，其特征在于，所述提取分为三次提取，三次提取剂中前两次为乙腈水溶液，乙腈的体积百分数为70％～90％；第三次提取剂为乙腈甲醇水溶液，乙腈、甲醇和水的体积比为(40-50)：(10-30)：(20-50)。
6.根据权利要求1-5任一项所述的前处理方法，其特征在于，所述固相萃取条件为：固相萃取柱为HLB小柱，洗脱液为甲醇和乙腈。
7.根据权利要求1-6任一项所述的前处理方法，其特征在于，所述洗脱液的体积为5-10mL。
8.一种测定奶粉中链格孢霉毒素含量的方法，其特征在于，所述方法是应用权利要求1-7任一项所述的预处理方法对奶粉中的链格孢霉毒素进行提取，再采用液相色谱串联质谱法对链格孢霉毒素进行定量检测。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18液相色谱柱；所述洗脱条件为柱温40℃；流动相A为0.1％甲酸溶液，流动相B为乙腈；梯度洗脱程序：0～5.0min，90％～5％A；5.0～7.0min，5％A；7.0～7.5min，5％～90％A；7.5～10.0min，90％A；0～5.0min，10％～95％B；5.0～7.0min，95％B；7.0～7.5min，95％～10％B；7.5～10.0min，10％B。
10.权利要求1-7任一项所述的预处理方法，或权利要求8或9所述的检测方法在奶粉和米粉安全检测方面的应用。
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