CN105954425B - 一种土壤、玉米及玉米植株中氯氟吡氧乙酸异辛酯及氯氟吡氧乙酸的hplc测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种土壤、玉米及玉米植株中氯氟吡氧乙酸异辛酯及氯氟吡氧乙酸的HPLC测定方法，属于HPLC（高效液相色谱）分析检测技术领域。本发明方法采用固相萃取净化技术进行样品前处理，降低了基质干扰，同时结合高灵敏度的HPLC（高效液相色谱）方法测定土壤、玉米、玉米植株三种不同基质中氯氟吡氧乙酸异辛酯及氯氟吡氧乙酸的含量。本发明检测线性范围为0.01～10ug/mL；检出限0.01ug/L，定量限0.05ug/L。平均回收率81.1～103.3%，平均相对标准偏差(RSD)为0.3％～2.3％，具有操作简便、快速、灵敏度高、重复性好、定性定量准确的优点。本发明的土壤、玉米及玉米植株中氯氟吡氧乙酸异辛酯及氯氟吡氧乙酸的HPLC测定方法简便、灵敏、选择性高，可为农产品安全监测和环境行为评价提供科学的技术手段。
Description
技术领域
本发明涉及一种氯氟吡氧乙酸异辛酯及氯氟吡氧乙酸的测定方法，更具体地涉及一种土壤、玉米及玉米植株中氯氟吡氧乙酸异辛酯及氯氟吡氧乙酸的HPLC（高效液相色谱）测定方法，属于HPLC（高效液相色谱）分析检测技术领域。
背景技术
氯氟吡氧乙酸异辛酯及其代谢物氯氟吡氧乙酸，是由美国陶氏益农公司(DowAgro Sciences Company)开发生产的有机杂环类选择性内吸传导型苗后除草剂，适用于防除小麦、大麦、玉米等禾本科作物田中各种阔叶杂草，施药后可以很快被植物吸收，使敏感植物出现典型激素类除草剂的反应，植株畸形、扭曲，最终枯死，对小麦、大麦、元麦、玉米田间及果园等多种一年生或多年生阔叶杂草有较好的防除效果，现已国产化。根据我国GB2673-2014氯氟吡氧乙酸异辛酯及其代谢物氯氟吡氧乙酸在玉米中的最大允许限量（MRL）值均为0.05 mg/kg。
氯氟吡氧乙酸虽然为氯氟吡氧乙酸异辛酯的代谢物，但是二者的性质差别较大，所以提取、分离，检测的方法都不同。目前氯氟吡氧乙酸异辛酯国内外报道的主要提取方法为QuEChERS方法，活性炭柱净化；检测方法为气相色谱法、气质联用、液质联用法。氯氟吡氧乙酸具有酸性，多采用酸碱中和法、QuEChERS方法；检测方法为气相色谱法、气质联用、液相色谱法、液质联用法。但是这些方法都不能同时测定不同基质中的氯氟吡氧乙酸异辛酯及其代谢物氯氟吡氧乙酸残留量，并且前处理繁琐，回收率差耗时长，不利于大批量样品的测试工作。
因此，一种简便、快速、灵敏度高、重复性好、定性定量准确，能够同时测定不同基质中的氯氟吡氧乙酸异辛酯及氯氟吡氧乙酸残留量的检测方法亟待开发出来。
发明内容
本发明的目的在于提供一种土壤、玉米及玉米植株中氯氟吡氧乙酸异辛酯及氯氟吡氧乙酸的HPLC（高效液相色谱）测定方法，前处理采用固相萃取净化技术，降低了基质干扰，同时结合高灵敏度的HPLC（高效液相色谱）方法测定土壤、玉米、玉米植株中氯氟吡氧乙酸异辛酯及氯氟吡氧乙酸残留量，方法简便、灵敏、选择性高，可为农产品安全监测和环境行为评价提供科学的技术手段。
本发明所采用的技术方案为：
一种土壤、玉米及玉米植株中氯氟吡氧乙酸异辛酯及氯氟吡氧乙酸的HPLC（高效液相色谱）测定方法，其特征是包括以下步骤：
(1) 氯氟吡氧乙酸异辛酯及氯氟吡氧乙酸的提取：
准确称制备好的待测样品（精确到0.01g）于离心管中，加入乙腈和无水硫酸钠，漩涡1min后超声提取，过滤；滤渣再用乙腈提取，过滤；合并滤液，加入氯化钠剧烈振荡后静置；将有机相转移到蒸发瓶中，在45℃下蒸发至近干，残渣用甲醇溶解，待净化；
(2) 氯氟吡氧乙酸异辛酯及氯氟吡氧乙酸的净化：
将步骤(1) 制备的样品依次用5mL、10mL、10mL二氯甲烷:甲醇（95:5）溶剂溶解，依次过GCB活性炭固相萃取柱净化后，收集滤液，旋转蒸发至近干后，加入2ml甲醇定容，过0.22µm有机滤膜，待色谱分析氯氟吡氧乙酸异辛酯含量；
将步骤(1) 制备的样品用2mL质量分数为50%的甲醇水溶液活化过MAX固相萃取柱，当溶剂液面流至吸附填料表面时，立即加入样品浓缩液，将样品液全部转移至萃取柱后，再用3mL质量分数为2%的氨水溶液淋洗，弃去淋出液；先用3mL甲醇洗脱，再用8mL含2%甲酸的甲醇溶液洗脱，收集溜出液，氮气吹干后用甲醇定容至2mL，0.22µm滤膜过滤，待色谱分析氯氟吡氧乙酸含量。
(3) 氯氟吡氧乙酸异辛酯及氯氟吡氧乙酸标准工作溶液的配制：
将不含氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸的同种类基质空白样品按上述步骤(1)、(2)处理，得样品提取净化液，用空白提取净化液配制成至少5个浓度的氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸的系列混合标准工作液。
(4) 氯氟吡氧乙酸异辛酯及氯氟吡氧乙酸的的检测：
将步骤(3)中的各浓度梯度的标准工作溶液用HPLC（高效液相色谱）测定不同浓度的氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸标品的吸收曲线，以氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸标品的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸标品的标准曲线；在相同条件下将步骤(2)中净化后的样品液进行HPLC（高效液相色谱）测定，测得样品液中氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸的含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸残留量。
优选的，所述步骤(4)的色谱条件为：
流动相为0.1%乙酸（A）和乙腈（B）；梯度洗脱程序：0 min，30% B；0~17 min，30%~90% B，17~27 min，90% B，27~30min，90%~30%之后进行系统平衡。流速1.0 mL/min；柱温30℃，进样量20 uL。色谱柱：Agela Venusil MP C18 150A（250 mm×4.6 mm，5µm）。
优选的，包括以下步骤：
(1) 氯氟吡氧乙酸异辛酯及氯氟吡氧乙酸的提取：
准确称取10.0g 待测样品（精确到0.01g）于100mL 离心管中，加入20mL乙腈和10g无水硫酸钠，漩涡1min后超声提取30min，过滤；滤渣再用20mL乙腈提取30min，过滤；合并滤液，加入2g氯化钠，剧烈振荡后，静置；将有机相转移到蒸发瓶中，在45℃下蒸发至近干，残渣用2ml甲醇溶解，待净化。
(2) 氯氟吡氧乙酸异辛酯及氯氟吡氧乙酸的净化：
将步骤(1) 制备的样品依次用5mL、10mL、10mL二氯甲烷:甲醇（95:5）溶剂溶解，依次过GCB活性炭固相萃取柱净化后，收集滤液，旋转蒸发至近干后，加入2ml甲醇定容，过0.22µm有机滤膜，待色谱分析氯氟吡氧乙酸异辛酯含量；
将步骤(1)制备的样品用2mL质量分数为50%的甲醇水溶液活化过MAX固相萃取柱，当溶剂液面流至吸附填料表面时，立即加入样品浓缩液，将样品液全部转移至萃取柱后，再用3mL质量分数为2%的氨水溶液淋洗，弃去淋出液；先用3mL甲醇洗脱，再用8mL含2%甲酸的甲醇溶液洗脱，收集溜出液，氮气吹干后用甲醇定容至2mL，0.22µm滤膜过滤，待色谱分析氯氟吡氧乙酸含量。
(3) 氯氟吡氧乙酸异辛酯及氯氟吡氧乙酸标准工作溶液的配制：
准确称取氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸标准品0.01g(精确至0.001g)，用甲醇溶解并定容至10.0 mL，配成标准母液(1000.0 ug/mL) 氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸标准溶液。用甲醇依次稀释成10.0、1.0、0.5、0.2、0.1、0.01ug/mL的氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸系列标准工作溶液。
(4) 氯氟吡氧乙酸异辛酯及氯氟吡氧乙酸的的检测：
将步骤(3)中的各浓度梯度的标准工作溶液用HPLC（高效液相色谱）测定不同浓度的氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸标品的吸收曲线，以氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸标品的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸标品的标准曲线；在相同条件下将步骤(2)中净化后的样品液进行HPLC（高效液相色谱法）测定，测得样品液中氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸的含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸残留量。
本发明的有益效果：
(1)本发明前处理采用了固相萃取净化技术，降低了基质干扰，同时结合灵敏度的HPLC（高效液相色谱）技术建立了能够同时分析不同基质中氯氟吡氧乙酸异辛酯及氯氟吡氧乙酸的分析方法。
(2) 本发明过活性碳固相萃取柱和离子柱固相萃取柱进行净化，对样品进行处理，干扰背景最小，且回收率高，能够测定不同基质（土壤、玉米籽粒、玉米植株）中氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸残留量。
(3) 本发明采用HPLC（高效液相色谱）法定性定量测定测定不同基质（土壤、玉米籽粒、玉米植株）中氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸残留量，线性范围为0.01～10 ug/mL，平均回收率为81.1～103.3%，RSD为0.3%～2.3%。本发明检出限0.01ug/L，定量限0.05ug /L，灵敏度高、重复性好，为保障我国人民食品安全及对外出口贸易健康发展提供有力的技术支撑。
附图说明
附图1为氯氟吡氧乙酸异辛酯的最大吸收光谱；
附图2为氯氟吡氧乙酸的最大紫外光谱；
附图3为土壤基质中氯氟吡氧乙酸异辛酯和氯氟吡氧乙酸的液相色谱图（其中15.543是氯氟吡氧乙酸，25.420为氯氟吡氧乙酸异辛酯）；
附图4为玉米基质中氯氟吡氧乙酸异辛酯和氯氟吡氧乙酸的液相色谱图（其中13.685是氯氟吡氧乙酸，24.121为氯氟吡氧乙酸异辛酯）；
附图5为玉米植株中氯氟吡氧乙酸异辛酯和氯氟吡氧乙酸的液相色谱图（其中15.362是氯氟吡氧乙酸，25.341为氯氟吡氧乙酸异辛酯）。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例，实施例不应视作对本发明保护范围的限定。
实施例中使用的仪器：
日本岛津LC-20AT型高效液相色谱仪，配2487型紫外检测器, Waters C18固相萃取小柱（MAX）( 3cc,60mg )；T25BS2型高速分散匀浆机（德国IKA公司）;3K30型高速离心机（美国Sigma公司）；Laborota4000型旋转蒸发仪（德国Heidolph公司）；AE-240型电子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。Agela Venusil MP C18 150A 4.6×250mm。
实施例中使用药品及标准品：
氯氟吡氧乙酸异辛酯标准品：纯度97.8%，上海市农药研究所有限公司；氯氟吡氧乙酸标准品：纯度99%，百灵威科技有限公司。甲醇（色谱纯，德国Meck公司），乙腈（色谱纯，赛默飞世儿科技（中国）有限公司）；乙酸（色谱纯，美国Sigma公司），其他试剂为分析纯；实验用水为去离子水。
样品：普通玉米田土壤、玉米籽粒及玉米植株。
实施例1：土壤中氯氟吡氧乙酸异辛酯及氯氟吡氧乙酸的HPLC测定：
(1) 氯氟吡氧乙酸异辛酯及氯氟吡氧乙酸的提取：
准确称取土壤样品10.0g 样品（精确到0.01g）于100mL 离心管中，加入20mL乙腈和10g无水硫酸钠，漩涡1min后超声提取30min，过滤；滤渣再用20mL乙腈提取30min，过滤；合并滤液，加入2g氯化钠，剧烈振荡后，静置；将有机相转移到蒸发瓶中，在45℃下蒸发至近干，残渣用2ml甲醇溶解，待净化。
(2) 氯氟吡氧乙酸异辛酯及氯氟吡氧乙酸的净化：
将步骤(1) 制备的样品依次用5mL、10mL、10mL二氯甲烷:甲醇（95:5）溶剂溶解，依次过GCB活性炭固相萃取柱净化后，收集滤液，旋转蒸发至近干后，加入2ml甲醇定容，过0.22µm有机滤膜，待色谱分析氯氟吡氧乙酸异辛酯含量；
将步骤(1) 制备的样品用2mL质量分数为50%的甲醇水溶液活化过MAX固相萃取柱，当溶剂液面流至吸附填料表面时，立即加入样品浓缩液，将样品液全部转移至萃取柱后，再用3mL质量分数为2%的氨水溶液淋洗，弃去淋出液；先用3mL甲醇洗脱，再用8mL含2%甲酸的甲醇溶液洗脱，收集溜出液，氮气吹干后用甲醇定容至2mL，0.22µm滤膜过滤，待色谱分析氯氟吡氧乙酸含量。
(3) 氯氟吡氧乙酸异辛酯及氯氟吡氧乙酸标准工作溶液的配制：
准确称取氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸标准品0.01g(精确至0.001g)，用甲醇溶解并定容至10.0mL，配成标准母液(1000.0ug/mL) 氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸标准溶液。用甲醇依次稀释成10.0、1.0、0.5、0.2、0.1、0.01 ug/mL的氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸系列标准工作溶液。
(4) 氯氟吡氧乙酸异辛酯及氯氟吡氧乙酸的的检测：
将步骤(3)中的各浓度梯度的标准工作溶液用HPLC（高效液相色谱）测定不同浓度的氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸标品的吸收曲线，以氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸标品的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸标品的标准曲线；在相同条件下将步骤(2)中净化后的样品液进行HPLC（高效液相色谱法）测定，测得样品液中氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸的含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸残留量。
色谱条件为：流动相为0.1%乙酸（A）和乙腈（B）；梯度洗脱程序：0 min，30% B；0~17min，30%~90% B，17~27 min，90% B，27~30min，90%~30%之后进行系统平衡。流速1.0 mL/min；柱温30℃，进样量20 uL。色谱柱：Agela Venusil MP C18 150A（250 mm×4.6 mm，5µm）。
以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线。在0.01～0.5mg/kg 范围内，氯氟吡氧乙酸异辛酯、氯氟吡氧乙酸的质量浓度与其峰面积呈良好的线性关系，其回归方程分别为y=114177x-1286.3，y=161455x+4044.2，相关系数为r =0.9998，0.9998。
加标回收率和重复性：
在不含氯氟吡氧乙酸异辛酯、氯氟吡氧乙酸的土壤中加入0.01mg/kg、0.05mg/kg和0.1 mg/kg 3个浓度的添加水平，按上述处理步骤进行残留量测定。将测定浓度与农药理论添加浓度进行比较，得到农药添加回收率，每个添加水平平行测定5次，得其相对标准偏差，测定结果见表1、表2。
表1实施例1中氯氟吡氧乙酸异辛酯的回收率和重复性(n＝5)
由表1可以看出，在3个加标水平上，氯氟吡氧乙酸异辛酯的平均回收率为86.7％～103.3％，平均相对标准偏差(RSD)为0.3％～0.8％，说明本发明方法的回收率较高，重复性好。
表2实施例1中氯氟吡氧乙酸的回收率和重复性(n＝5)
由表2可以看出，在3个加标水平上，氯氟吡氧乙酸异辛酯的平均回收率为 84.0％～93.4％，平均相对标准偏差(RSD)为1.1％～1.6％，说明本发明方法的回收率较高，重复性好。
实施例2：玉米中氯氟吡氧乙酸异辛酯及氯氟吡氧乙酸的HPLC测定：
(1) 氯氟吡氧乙酸异辛酯及氯氟吡氧乙酸的提取：
准确称取玉米样品10.0g 样品（精确到0.01g）于100mL 离心管中，加入20mL乙腈和10g无水硫酸钠，漩涡1min后超声提取30min，过滤；滤渣再用20mL乙腈提取30min，过滤；合并滤液，加入2g氯化钠，剧烈振荡后，静置；将有机相转移到蒸发瓶中，在45℃下蒸发至近干，残渣用2ml甲醇溶解，待净化。
(2) 氯氟吡氧乙酸异辛酯及氯氟吡氧乙酸的净化：
将步骤(1) 制备的样品依次用5mL、10mL、10mL二氯甲烷:甲醇（95:5）溶剂溶解，依次过GCB活性炭固相萃取柱净化后，收集滤液，旋转蒸发至近干后，加入2ml甲醇定容，过0.22µm有机滤膜，待色谱分析氯氟吡氧乙酸异辛酯含量；
将步骤(1) 制备的样品用2mL质量分数为50%的甲醇水溶液活化过MAX固相萃取柱，当溶剂液面流至吸附填料表面时，立即加入样品浓缩液，将样品液全部转移至萃取柱后，再用3mL质量分数为2%的氨水溶液淋洗，弃去淋出液；先用3mL甲醇洗脱，再用8mL含2%甲酸的甲醇溶液洗脱，收集溜出液，氮气吹干后用甲醇定容至2mL，0.22µm滤膜过滤，待色谱分析氯氟吡氧乙酸含量。
(3) 氯氟吡氧乙酸异辛酯及氯氟吡氧乙酸标准工作溶液的配制：
准确称取氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸标准品0.01g(精确至0.001g)，用甲醇溶解并定容至10.0 mL，配成标准母液(1000.0ug/mL) 氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸标准溶液。用甲醇依次稀释成10.0、1.0、0.5、0.2、0.1、0.01 ug/mL的氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸系列标准工作溶液。
(4) 氯氟吡氧乙酸异辛酯及氯氟吡氧乙酸的的检测：
将步骤(3)中的各浓度梯度的标准工作溶液用HPLC（高效液相色谱）测定不同浓度的氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸标品的吸收曲线，以氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸标品的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸标品的标准曲线；在相同条件下将步骤(2)中净化后的样品液进行HPLC（高效液相色谱法）测定，测得样品液中氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸的含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸残留量。
色谱条件为：
流动相为0.1%乙酸（A）和乙腈（B）；梯度洗脱程序：0 min，30% B；0~17 min，30%~90% B，17~27 min，90% B，27~30min，90%~30%之后进行系统平衡。流速1.0 mL/min；柱温30℃，进样量20 uL。色谱柱：Agela Venusil MP C18 150A（250 mm×4.6 mm，5µm）。
以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线。在0.01～0.5mg/kg 范围内，氯氟吡氧乙酸异辛酯、氯氟吡氧乙酸的质量浓度与其峰面积呈良好的线性关系，其回归方程分别为y=114177x-1286.3，y=161455x+4044.2，相关系数为r =0.9998，0.9998。
加标回收率和重复性：
在不含氯氟吡氧乙酸异辛酯、氯氟吡氧乙酸的玉米中加入0.01mg/kg、0.05mg/kg和0.1 mg/kg 3个浓度的添加水平，按上述处理步骤进行残留量测定。将测定浓度与农药理论添加浓度进行比较，得到农药添加回收率，每个添加水平平行测定5次，得其相对标准偏差，测定结果见表3、表4。
表3实施例2中氯氟吡氧乙酸异辛酯的回收率和重复性(n＝5)
由表3可以看出，在3个加标水平上，氯氟吡氧乙酸异辛酯的平均回收率为88.0％～97.6％，平均相对标准偏差(RSD)为1.6％～2.3％，说明本发明方法的回收率较高，重复性好。
表4实施例2中氯氟吡氧乙酸的回收率和重复性(n＝5)
由表4可以看出，在3个加标水平上，氯氟吡氧乙酸异辛酯的平均回收率为81.1％～95.8％，平均相对标准偏差(RSD)为0.6％～0.8％，说明本发明方法的回收率较高，重复性好。
实施例3：玉米植株中氯氟吡氧乙酸异辛酯及氯氟吡氧乙酸的HPLC测定：
(1) 氯氟吡氧乙酸异辛酯及氯氟吡氧乙酸的提取：
准确称取玉米植株样品10.0g 样品（精确到0.01g）于100mL 离心管中，加入20mL乙腈和10g无水硫酸钠，漩涡1min后超声提取30min，过滤；滤渣再用20mL乙腈提取30min，过滤；合并滤液，加入2g氯化钠，剧烈振荡后，静置；将有机相转移到蒸发瓶中，在45℃下蒸发至近干，残渣用2ml甲醇溶解，待净化。
(2) 氯氟吡氧乙酸异辛酯及氯氟吡氧乙酸的净化：
将步骤(1) 制备的样品依次用5mL、10mL、10mL二氯甲烷:甲醇（95:5）溶剂溶解，依次过GCB活性炭固相萃取柱净化后，收集滤液，旋转蒸发至近干后，加入2ml甲醇定容，过0.22µm有机滤膜，待色谱分析氯氟吡氧乙酸异辛酯含量；
将步骤(1) 制备的样品用2mL质量分数为50%的甲醇水溶液活化过MAX固相萃取柱，当溶剂液面流至吸附填料表面时，立即加入样品浓缩液，将样品液全部转移至萃取柱后，再用3mL质量分数为2%的氨水溶液淋洗，弃去淋出液；先用3mL甲醇洗脱，再用8mL含2%甲酸的甲醇溶液洗脱，收集溜出液，氮气吹干后用甲醇定容至2mL，0.22µm滤膜过滤，待色谱分析氯氟吡氧乙酸含量。
(3) 氯氟吡氧乙酸异辛酯及氯氟吡氧乙酸标准工作溶液的配制：
准确称取氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸标准品0.01g(精确至0.001g)，用甲醇溶解并定容至10.0 mL，配成标准母液(1000.0ug/mL) 氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸标准溶液。用甲醇依次稀释成10.0、1.0、0.5、0.2、0.1、0.01 ug/mL的氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸系列标准工作溶液。
(4) 氯氟吡氧乙酸异辛酯及氯氟吡氧乙酸的的检测：
将步骤(3)中的各浓度梯度的标准工作溶液用HPLC（高效液相色谱）测定不同浓度的氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸标品的吸收曲线，以氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸标品的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸标品的标准曲线；在相同条件下将步骤(2)中净化后的样品液进行HPLC（高效液相色谱法）测定，测得样品液中氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸的含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸残留量。
色谱条件为：流动相为0.1%乙酸（A）和乙腈（B）；梯度洗脱程序：0 min，30% B；0~17min，30%~90% B，17~27 min，90% B，27~30min，90%~30%之后进行系统平衡。流速1.0 mL/min；柱温30℃，进样量20 uL。色谱柱：Agela Venusil MP C18 150A（250 mm×4.6 mm，5µm）。
以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线。在0.01～0.5mg/kg 范围内，氯氟吡氧乙酸异辛酯、氯氟吡氧乙酸的质量浓度与其峰面积呈良好的线性关系，其回归方程分别为y=114177x-1286.3，y=161455x+4044.2，相关系数为r =0.9998，0.9998。
加标回收率和重复性：
在不含氯氟吡氧乙酸异辛酯、氯氟吡氧乙酸的玉米植株中加入0.01mg/kg、0.05mg/kg和0.1 mg/kg 3个浓度的添加水平，按上述处理步骤进行残留量测定。将测定浓度与农药理论添加浓度进行比较，得到农药添加回收率，每个添加水平平行测定6次，得其相对标准偏差，测定结果见表5、表6。
表5实施例3中氯氟吡氧乙酸异辛酯的回收率和重复性(n＝5)
由表5可以看出，在3个加标水平上，氯氟吡氧乙酸异辛酯的平均回收率为96.5％～99.7％，平均相对标准偏差(RSD)为0.7％～1.4％，说明本发明方法的回收率较高，重复性好。
表6实施例3中氯氟吡氧乙酸的回收率和重复性(n＝5)
由表6可以看出，在3个加标水平上，氯氟吡氧乙酸异辛酯的平均回收率为95.9％～97.4％，平均相对标准偏差(RSD)为0.4％～2.2％，说明本发明方法的回收率较高，重复性好。
检出限：将不同浓度的氯氟吡氧乙酸异辛酯及其代谢物氯氟吡氧乙酸基质标准工作溶液注入仪器，以定量离子色谱峰3倍信噪比所对应的最低浓度为检出限(LOD)，的检出限均为0.01 ug/mL (S/N≥3)；以10倍信噪比所对应的最低浓度为定量检出限(LOQ)，定量检出限均为0.05µg/mL(S/N≥10)。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (4)
1.一种土壤、玉米及玉米植株中氯氟吡氧乙酸异辛酯及氯氟吡氧乙酸的HPLC测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
1) 氯氟吡氧乙酸异辛酯及氯氟吡氧乙酸的提取：准确称取制备好的待测样品精确到0.01g，于离心管中，加入乙腈和无水硫酸钠，漩涡1min后超声提取，过滤；滤渣再用乙腈提取，过滤；合并滤液，加入氯化钠剧烈振荡后静置；将有机相转移到蒸发瓶中，在45℃下蒸发至近干，残渣用甲醇溶解，待净化；
2) 氯氟吡氧乙酸异辛酯及氯氟吡氧乙酸的净化：将步骤1) 制备的样品依次用5mL、10mL、10mL二氯甲烷:甲醇=95:5溶剂溶解，依次过GCB活性炭固相萃取柱净化后，收集滤液，旋转蒸发至近干后，加入2ml甲醇定容，过0.22µm有机滤膜，待色谱分析氯氟吡氧乙酸异辛酯含量；将步骤1) 制备的样品用2mL质量分数为50%的甲醇水溶液活化过MAX固相萃取柱，当溶剂液面流至吸附填料表面时，立即加入样品浓缩液，将样品液全部转移至萃取柱后，再用3mL质量分数为2%的氨水溶液淋洗，弃去淋出液；先用3mL甲醇洗脱，再用8mL含2%甲酸的甲醇溶液洗脱，收集溜出液，氮气吹干后用甲醇定容至2mL，0.22µm滤膜过滤，待色谱分析氯氟吡氧乙酸含量；
3) 氯氟吡氧乙酸异辛酯及氯氟吡氧乙酸标准工作溶液的配制：将不含氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸的同种类基质空白样品按上述步骤1)、2)处理，得样品提取净化液，用空白提取净化液配制成至少5个浓度的氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸的系列混合标准工作液；
4) 氯氟吡氧乙酸异辛酯及氯氟吡氧乙酸的检测：将步骤3)中的各浓度梯度的标准工作溶液用HPLC测定不同浓度的氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸标品的吸收曲线，以氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸标品的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸标品的标准曲线；在相同条件下将步骤2)中净化后的样品液进行HPLC测定，测得样品液中氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸的含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸残留量；
所述步骤4)中色谱条件为：流动相为A 0.1%乙酸和B乙腈；梯度洗脱程序：0 min，30%B；0~17 min，30%~90% B，17~27 min，90% B，27~30min，90%~30%之后进行系统平衡；流速1.0mL/min；柱温30℃，进样量20 uL；色谱柱：Agela Venusil MP C18 150A，250 mm×4.6 mm，5µm。
2.根据权利要求1所述的一种土壤、玉米及玉米植株中氯氟吡氧乙酸异辛酯及氯氟吡氧乙酸的HPLC测定方法，其特征在于，所述步骤4)中氯氟吡氧乙酸异辛酯的回归方程为y=114177x-1286.3，相关系数为r =0.9998。
3.根据权利要求1所述的一种土壤、玉米及玉米植株中氯氟吡氧乙酸异辛酯及氯氟吡氧乙酸的HPLC测定方法，其特征在于，所述步骤4)中氯氟吡氧乙酸的回归方程为y=161455x+4044.2，相关系数为r =0.9998。
4.根据权利要求1～3任一所述的一种土壤、玉米及玉米植株中氯氟吡氧乙酸异辛酯及氯氟吡氧乙酸的HPLC测定方法，其特征在于包括以下步骤 ：
1) 氯氟吡氧乙酸异辛酯及氯氟吡氧乙酸的提取：准确称取10.0g 待测样品精确到0.01g，于100mL 离心管中，加入20mL乙腈和10g无水硫酸钠，漩涡1min后超声提取30min，过滤；滤渣再用20mL乙腈提取30min，过滤；合并滤液，加入2g氯化钠，剧烈振荡后，静置；将有机相转移到蒸发瓶中，在45℃下蒸发至近干，残渣用2ml甲醇溶解，待净化；
2) 氯氟吡氧乙酸异辛酯及氯氟吡氧乙酸的净化：将步骤1) 制备的样品依次用5mL、10mL、10mL二氯甲烷:甲醇=95:5溶剂溶解，依次过GCB活性炭固相萃取柱净化后，收集滤液，旋转蒸发至近干后，加入2ml甲醇定容，过0.22µm有机滤膜，待色谱分析氯氟吡氧乙酸异辛酯含量；将步骤1) 制备的样品用2mL质量分数为50%的甲醇水溶液活化过MAX固相萃取柱，当溶剂液面流至吸附填料表面时，立即加入样品浓缩液，将样品液全部转移至萃取柱后，再用3mL质量分数为2%的氨水溶液淋洗，弃去淋出液；先用3mL甲醇洗脱，再用8mL含2%甲酸的甲醇溶液洗脱，收集溜出液，氮气吹干后用甲醇定容至2mL，0.22µm滤膜过滤，待色谱分析氯氟吡氧乙酸含量；
3) 氯氟吡氧乙酸异辛酯及氯氟吡氧乙酸标准工作溶液的配制：准确称取氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸标准品0.01g，精确至0.001g，用甲醇溶解并定容至10.0 mL，配成标准母液1000.0ug/mL氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸标准溶液；用甲醇依次稀释成10.0、1.0、0.5、0.2、0.1、0.01 ug/mL的氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸系列标准工作溶液；
4) 氯氟吡氧乙酸异辛酯及氯氟吡氧乙酸的检测：将步骤3)中的各浓度梯度的标准工作溶液用HPLC测定不同浓度的氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸标品的吸收曲线，以氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸标品的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸标品的标准曲线；在相同条件下将步骤2)中净化后的样品液进行HPLC测定，测得样品液中氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸的含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中氯氟吡氧乙酸异辛酯或氯氟吡氧乙酸残留量。
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