CN113484431A - 一种快速检测禾谷镰刀菌嘌呤核苷酸类物质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种快速检测禾谷镰刀菌嘌呤核苷酸类物质的方法。本方法通过制备标准溶液、将收集的样品进行处理，然后转移至进样瓶中采用高效液相‑四级杆质谱联用仪进行测定，WondaSil C18色谱柱，以甲酸‑甲醇溶液为流动相进行梯度洗脱。本发明有效避免假阳性结果，前处理简单、灵敏度高，为其他生物体中嘌呤核苷酸的检测技术提供参考。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，更具体的涉及一种快速检测禾谷镰刀菌嘌呤核苷酸类物质的方法。
背景技术
核苷酸是由核苷与磷酸缩合而成的一类磷酸酯，是组成核酸的基本单位。单核苷酸相互缩合形成RNA，脱氧单核苷酸相互缩合形成DNA。细胞中核苷酸以游离状态存在，可含有1个、2个或3个磷酸基团，分别称核苷一磷酸，如AMP、CMP、GMP、UMP、dAMP等；核苷二磷酸，如ADP、CDP、dADP等；核苷三磷酸，如ATP、dATP等。核苷酸在生物体内具有多种生物学功能，除了作为核酸的基本成分外，还分别在能量代谢、糖类代谢和蛋白质生物合成等生命过程中起着重要作用。例如三种嘌呤核苷酸在生物体能量代谢过程中相互转变的过程，为机体释放和存储能量。在真菌研究中，胞内游离的嘌呤核苷酸水平可直接反映生物体的能量代谢情况，体现真菌的生长繁殖能力。禾谷镰刀菌是引起的小麦赤霉病重要的病原菌，对该病原菌的能量代谢过程中的三种嘌呤核苷酸含量进行研究，有利于了解禾谷镰刀菌生长发育情况，为防控小麦赤霉病提供思路。
目前核苷酸的检测方法有高效液相色谱(HPLC)法、离子对色谱法、离子交换色谱与紫外检测串联的方法、毛细管电泳方法以及液相色谱质谱联用(HPLC-MS)等方法。高效液相色谱法是目前核苷酸类物质检测最为常用的方法，但该方法对分离度要求较高，对于基质复杂的样品易产生假阳性结果；离子交换色谱法易受到干扰，且离子色谱分析时间较长；毛细管电泳法受到进样量小、检测池光路短等限制，存在定量重现性差、灵敏度低等问题。
基于此，本发明利用高效液相色谱串联三重四级杆质谱在小分子定量的优势，建立了多反应监测(MRM)方法检测禾谷镰刀菌中三种核苷酸的含量。该方法可以有效避免假阳性结果，前处理简单、灵敏度高，为其他生物体中嘌呤核苷酸的检测技术提供参考。
发明内容
本发明提供了一种快速检测禾谷镰刀菌嘌呤核苷酸类物质的方法。该方法可以有效避免假阳性结果，前处理简单、灵敏度高，为其他生物体中嘌呤核苷酸的检测技术提供参考。
本发明提供了一种快速检测禾谷镰刀菌嘌呤核苷酸类物质的方法，包括以下步骤：
S1、利用核苷酸标准品制备标准溶液
S2、收集禾谷镰刀菌菌丝样品
S3、菌丝的处理
将S2制得的菌丝样品在液氮下进行研磨，然后将菌丝样品在三氯乙酸溶液中进行混合，之后经过离心、清洗、干燥、复溶，得到待测样品，备用；
S4、将S3制得的待测样品经过滤后采用高效液相-四级杆质谱联用仪进行测定；
S4中所述检测的色谱条件为：采用WondaSil C18色谱柱，以A-B为流动相进行梯度洗脱，其中，A相为0.1％的甲酸溶液，B相为甲醇；流速：0.5mL/min；
S4中所述检测的质谱条件为：电喷雾离子源负离子检测方式；多反应监测模式；离子源温度：500℃；离子源电压：-4200；气帘气体：15.00L/min；离子源气体：55.00L/min；加热辅助器：60L/min。
优选的，S1中，取核苷酸标准品10mg，用超纯水溶解并定容，配成1mg/mL的标准储备液，于4℃密封保存，再各取储备液1mL用初始流动相定容到10mL的容量瓶，得到100μg/mL的混标溶液，并逐级稀释得到50μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL、0.1μg/mL系列标准溶液。
优选的，所述核苷酸标准品为腺苷-磷酸、肌苷-磷酸、鸟苷-磷酸，且这三种氨基酸分别配制系列标准溶液。
优选的，S2中，将禾谷镰刀菌菌株活化于PDA培养皿上，然后取培养后的菌饼接种于YEPD液体培养基进行培养，得到菌丝，之后用无菌滤布过滤，再用无菌水冲洗干净，吸干水分，转移至离心管中，冷冻干燥后得到菌丝样品。
优选的，S2中，将-80℃保存的禾谷镰刀菌菌株活化于PDA培养皿上，于25℃培养3-5d；然后用直径1cm打孔器取菌饼，接种于50mL YEPD液体培养基，25℃下150rpm培养12h；所得菌丝用无菌滤布过滤，无菌水冲洗干净，再用吸水纸充分吸干水分，转移至50mL离心管，冷冻干燥过夜16h，得到禾谷镰刀菌菌丝样品。
优选的，S3中，将S2制得的菌丝样品放于灭菌研钵中，加入液氮充分研磨；准确称取菌丝样品2mg于2mL聚四氟乙烯塑料离心管中，加入200μL体积分数6％的三氯乙酸溶液进行震荡，然后于4℃以4000r/min转速离心15min，再将所得上层清液用5倍体积的无水乙醚清洗4次，去除其中的三氯乙酸，最后把含有提取物的水相冷冻干燥，在用200μL初始流动相复溶，得到待测样品。
优选的，S4中，将S3制得的待测样品经0.22μm的过滤膜进行过滤。
优选的，所述梯度洗脱的程序为：0～10min，4％B；10min～12min，4％B～60％B；12min～15min，60％B；15min～16min，60％B～4％B,16min～20min，4％B。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过优化液相条件和质谱条件建立了高效液相色谱－三重四级杆质谱检测细胞内三种嘌呤核苷酸的方法，为核苷酸类物质检测技术提供参考依据。以禾谷镰刀菌野生型和基因突变体是生长发育明显迟缓的菌株为例，进行核苷酸含量检测后，可发现基因突变型和野生型禾谷镰刀菌中游离的核苷酸含量存在明显差异，进而能够推论可能的能量代谢过程。高效液相色谱－三重四级杆质谱检测细胞内三种嘌呤核苷酸具有准确度高、简单、可避免假阳性等特点，可用于真菌类的和其他相似生物组织的游离嘌呤核苷酸检测，对研究生物的生长发育具有重要意义。
附图说明
图1为流动相为0.1％(v/v)甲酸水-甲醇时三种核苷酸标准品的离子流图；
图2为流动相为0.1％(v/v)甲酸水-乙腈时三种核苷酸标准品的离子流图；
图3为三种核苷酸的MRM离子流图；
图3中，其中a为GMP的MRM离子流图，b为IMP的MRM离子流图，c为AMP的MRM离子流图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本实施例中所用仪器信息如下：
AB Sciex公司生产的API2000三重四级杆液质质谱联用仪以及Analyst工作站，去离子水发生器为美国Millipore公司生产的Milli-Q去离子水发生器，冷冻干燥仪为ThermopowerDry PL3000冷冻干燥仪，离心机为德国Eppendorf 5425离心机，旋涡混合器为德国IKA公司生产的MS3旋涡混合器；
本实施例中所用药品信息如下：
3种核苷酸标准品：腺苷一磷酸(Adenosinmonophosphate，AMP)、肌苷一磷酸(Inosinemonophosphate，IMP)、鸟苷一磷酸(Guanosinemonophosphate，GMP)均购于Sigma公司。乙腈和甲醇购于美国赛默飞世尔科技公司，纯度为色谱纯；三氯乙酸、甲酸、乙醚均购于上海医药集团有限公司，纯度为分析纯。所有用水均为去离子净水器产生的超纯水(电阻18.2MΩ·cm)。本实验所用禾谷镰刀菌菌株(野生型和基因缺失突变体)在实验室-80℃冰箱冻存。
实施例1
(1)制备标准溶液：分别称取10g核苷酸标准品(核苷酸标准品分别为AMP、GMP、IMP)于10ml容量瓶中，用超纯水溶解并定容，配成1mg/mL的标准储备液，于4℃冰箱中密封保存，再各取储备液1mL用初始流动相定容到10mL的容量瓶，得到100μg/mL的混标溶液，并逐级稀释得到50μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL、0.1μg/mL系列标准溶液；
(2)样品的前处理方法
将-80℃保存的禾谷镰刀菌菌株活化于PDA培养皿上，于25℃培养3-5d；然后用直径1cm打孔器取菌饼，接种于50mL YEPD液体培养基，25℃150rpm培养12h；所得菌丝用无菌滤布过滤，无菌水冲洗干净，再用吸水纸充分吸干水分，转移至50mL离心管，放于冷冻干燥仪，干燥过夜16h，得到菌丝样品；
将制得的菌丝样品放于灭菌研钵中，加入液氮充分研磨。准确称取菌丝样品2mg于2mL聚四氟乙烯塑料离心管中，加入200μL体积分数6％的三氯乙酸溶液充分涡旋震荡，然后于4℃以4000r/min转速离心15min，再将所得上层清液用5倍体积的无水乙醚清洗4次，去除其中的三氯乙酸，最后把含有提取物的水相冷冻干燥，在用200μL初始流动相复溶，得到待测样品，备用；
(3)仪器参数
色谱条件为：采用WondaSil C18(150mm×4.6mm，5μm)色谱柱，以A-B为流动相进行梯度洗脱，其中，A相为0.1％的甲酸溶液，B相为甲醇；流速：0.5mL/min；
梯度洗脱程序：0～10min，4％B；10min～12min，4％B～60％B；12min～15min，60％B；15min～16min，60％B～4％B,16min～20min,4％B。
质谱条件为：电喷雾离子源负离子检测方式(－ESI)；多反应监测(MRM)模式；离子源温度：500℃；离子源电压(IS)：-4200；气帘气体(CUR)：15.00L/min；离子源气体(GS1)：55.00L/min；加热辅助器(GS2)：60L/min。
校准方法：质量轴自动调谐PPG校正；其他参数见表1。
表1核苷酸在MRM模式下检测的质谱参数
(4)流动相条件
核苷酸属于极性比较大的小分子物质，又具有相似的特征结构，为了得到较好的分离效果选择了4％的B先等度再梯度的洗脱程序。但由于有机相浓度低会导致进入质谱时形成喷雾效果不好影响带电、离子化效率，导致响应值低，因此尝试流动相中加入有机酸来促进待测物的带电，因此，本实施例使用了0.1％甲酸水-甲醇、0.1％甲酸水-乙腈作为流动相，结果发现0.1％甲酸水-甲醇做流动相时响应值最佳，三种核苷酸标准品的离子流图见图1和图2。
(5)质谱条件
核苷酸是由磷酸分子、碱基和五碳糖的骨架构成。从结构上来看，含有磷酸基团的分子易在负离子模式下被检测到，但由于碱基中含有氨基亦可使用正离子模式。本实施例通过比较发现负离子模式响应值高于正离子模式，因此以三种核苷酸标准品中响应值相对低的IMP为对象进行化合物条件的选择，其中离子源温度为500℃、离子源电压(IS)-4200、气帘气体(CUR)15.00L/min、离子源气体(GS1)55.00L/min、加热辅助器(GS2)60L/min为最佳的检测条件，另外，还选取了其他条件并以响应值相对低的IMP为对象进行检测，其他条件的结果见表2。气帘气体和离子源气体的量对响应值影响很大，选择最适宜条件参数和离子对，明显提高了被测物质的响应值，由于是同时检测三种物质，化合物优化部分仅能以响应值最低的IMP的最佳参数来设置，一定程度上降低了另外两种核苷酸AMP和GMP的响应值。确定了化合物条件以及色谱部分的流动相条件后对三种核苷酸的混合标准品进行MRM分析，结果见图3。
表2 IMP化合物模块的优化
实施例2线性关系、检出限和定量限
取实施例1中配制的标准溶液，通过优化好的检测参数为方法进行检测，得到各组分的特征离子对离子流峰面积(Y)为纵坐标、对应的质量浓度(X，μg/mL)为横坐标的校正曲线，结果见表3。三种核苷酸在各自的浓度范围内线性关系良好，相关系数(r)均为0.99以上。
以信噪比S/N大于3计算检出下限、信噪比S/N大于10计算定量下限(LOQ)，可见该方法具有较低的检出限和定量限，该质谱的MRM检测方法用特征离子对定性可以避免复杂基质造成的假阳性，灵敏准确地检测样品中的游离核苷酸。
表3三种核苷酸的线性方程、相关系数(r)、线性范围、检出限(LOD)和定量限(LOQ)
实施例3回收率和精密度
选研磨好的禾谷镰刀菌野生型菌丝样品1(测得核苷酸含量为AMP 2.71μg/mL、GMP4.21μg/mL、IMP 1.65μg/mL)6份，称重后分别加入50μg/mL混合标准溶液20μL和4μL各三份，经实施例1描述的前处理后定容到200μL，即得到加标浓度分别为5μg/mL和1μg/mL的加标样品，经液质联用分析检测计算加标回收率(见表4)，可见回收率在84-118％之间。取经过前处理的菌丝样品1重复进样3次，以峰面积计算精密度，相对标准偏差(RSD)介于2.27％～4.75％之间，表示精密度良好。回收率实验结果和精密度的考察可以证明该核苷酸检测方法的可行性。
表4三种核苷酸的加标回收率
实施例4禾谷镰刀菌中游离嘌呤核苷酸的检测
取禾谷镰刀菌菌丝经实施例1的前处理方法，采用三重四级杆质谱MRM方法定量检测分析，所得结果见表5。可见样品中鸟嘌呤核苷酸GMP含量最高，次黄嘌呤核苷酸IMP含量最低，这与生物体中的实际核苷酸含量是相符的。禾谷镰刀菌突变体的三种核苷酸含量不同于野生型，AMP有所升高，GMP含量没有显著变化，IMP含量降低，这说明生长发育迟缓的突变体所缺失的基因对菌丝体的能量代谢和发育繁殖是有影响的。这说明在高能需求时，为适应机体能量的需要，2个ADP通过肌激酶的作用生成1个ATP和1个AMP，继续提供能量。结果使细胞内AMP的浓度急剧增加，为维持细胞的正常功能，AMP在脱氨酶的作用下脱氨生成IMP。表明基因缺失突变体中能量代谢的AMP代谢受到抑制，AMP含量高对机体产生一定的毒害，使得菌的生长变缓慢，但对GMP没有影响。
表5禾谷镰刀菌中三种核苷酸的含量
本发明建立了高效液相色谱－三重四级杆质谱多反应监测模式(MRM模式)检测禾谷镰刀菌中游离的AMP、IMP、GMP三种嘌呤核苷酸方法。使用三氯乙酸作为提取溶剂进行前处理，甲醇-0.1％(v/v)甲酸水作为流动相梯度洗脱分离，质谱采用负离子模式，根据特征离子选定离子对建立MRM的方法，优化质谱参数提升灵敏度。该方法的检测限可达到0.03μg/mL，三种核苷酸在0.1～100.0μg/mL浓度范围内线性关系良好，相关系数均大于0.99，回收率可达到84％～118％。此方法准确、灵敏且前处理简单，可以作为真菌和类似生物组织中三种核苷酸检测筛选和定量分析的方法。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (8)
1.一种快速检测禾谷镰刀菌嘌呤核苷酸类物质的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、利用核苷酸标准品制备标准溶液
S2、收集禾谷镰刀菌菌丝样品
S3、菌丝的处理
将S2制得的菌丝样品在液氮下进行研磨，然后将菌丝样品在三氯乙酸溶液中进行混合，之后经过离心、清洗、干燥、复溶，得到待测样品，备用；
S4、将S3制得的待测样品经过滤后采用高效液相-四级杆质谱联用仪进行测定；
S4中所述检测的色谱条件为：采用WondaSil C18色谱柱，以A-B为流动相进行梯度洗脱，其中，A相为0.1％的甲酸溶液，B相为甲醇；流速：0.5mL/min；
S4中所述检测的质谱条件为：电喷雾离子源负离子检测方式；多反应监测模式；离子源温度：500℃；离子源电压：-4200；气帘气体：15.00L/min；离子源气体：55.00L/min；加热辅助器：60L/min。
2.根据权利要求1所述的一种快速检测禾谷镰刀菌嘌呤核苷酸类物质的方法，其特征在于，S1中，取核苷酸标准品10mg，用超纯水溶解并定容，配成1mg/mL的标准储备液，于4℃密封保存，再各取储备液1mL用初始流动相定容到10mL的容量瓶，得到100μg/mL的混标溶液，并逐级稀释得到50μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL、0.1μg/mL系列标准溶液。
3.根据权利要求2所述的一种快速检测禾谷镰刀菌嘌呤核苷酸类物质的方法，其特征在于，所述核苷酸标准品为腺苷-磷酸、肌苷-磷酸、鸟苷-磷酸，且这三种氨基酸分别配制系列标准溶液。
4.根据权利要求1所述的一种快速检测禾谷镰刀菌嘌呤核苷酸类物质的方法，其特征在于，S2中，将禾谷镰刀菌菌株活化于PDA培养皿上，然后取培养后的菌饼接种于YEPD液体培养基进行培养，得到菌丝，之后用无菌滤布过滤，再用无菌水冲洗干净，吸干水分，转移至离心管中，冷冻干燥后得到菌丝样品。
5.根据权利要求4述的一种快速检测禾谷镰刀菌嘌呤核苷酸类物质的方法，其特征在于，S2中，将-80℃保存的禾谷镰刀菌菌株活化于PDA培养皿上，于25℃培养3-5d；然后用直径1cm打孔器取菌饼，接种于50mL YEPD液体培养基，25℃下150rpm培养12h；所得菌丝用无菌滤布过滤，无菌水冲洗干净，再用吸水纸充分吸干水分，转移至50mL离心管，冷冻干燥过夜16h，得到禾谷镰刀菌菌丝样品。
6.根据权利要求1所述的一种快速检测禾谷镰刀菌嘌呤核苷酸类物质的方法，其特征在于，S3中，将S2制得的菌丝样品放于灭菌研钵中，加入液氮充分研磨；准确称取菌丝样品2mg于2mL聚四氟乙烯塑料离心管中，加入200μL体积分数6％的三氯乙酸溶液进行震荡，然后于4℃以4000r/min转速离心15min，再将所得上层清液用5倍体积的无水乙醚清洗4次，去除其中的三氯乙酸，最后把含有提取物的水相冷冻干燥，在用200μL初始流动相复溶，得到待测样品。
7.根据权利要求6所述的一种快速检测禾谷镰刀菌嘌呤核苷酸类物质的方法，其特征在于，S4中，将S3制得的待测样品经0.22μm的过滤膜进行过滤。
8.根据权利要求1所述的一种快速检测禾谷镰刀菌嘌呤核苷酸类物质的方法，其特征在于，所述梯度洗脱的程序为：0～10min，4％B；10min～12min，4％B～60％B；12min～15min，60％B；15min～16min，60％B～4％B,16min～20min，4％B。
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| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113484431A (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102331472A (zh) * | 2011-09-22 | 2012-01-25 | 明一（福建）婴幼儿营养品有限公司 | 婴幼儿配方奶粉中核苷酸含量测定新方法 |
| CN106226414A (zh) * | 2016-07-08 | 2016-12-14 | 黑龙江东方学院 | 利用hplc法测定婴幼儿配方奶粉中核苷酸的方法 |
| CN111638293A (zh) * | 2019-08-30 | 2020-09-08 | 华南农业大学 | 一种同时测定动物组织中氨基酸和核苷酸的lc-ms/ms的检测方法 |
-
2021
- 2021-06-15 CN CN202110663041.9A patent/CN113484431A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102331472A (zh) * | 2011-09-22 | 2012-01-25 | 明一（福建）婴幼儿营养品有限公司 | 婴幼儿配方奶粉中核苷酸含量测定新方法 |
| CN106226414A (zh) * | 2016-07-08 | 2016-12-14 | 黑龙江东方学院 | 利用hplc法测定婴幼儿配方奶粉中核苷酸的方法 |
| CN111638293A (zh) * | 2019-08-30 | 2020-09-08 | 华南农业大学 | 一种同时测定动物组织中氨基酸和核苷酸的lc-ms/ms的检测方法 |
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| MANLI SUN ET AL.: "Stage-specific regulation of purine metabolism during infectious growth and sexual reproduction in Fusarium graminearum", 《NEW PHYTOLOGIST》 * |
| 俞莎等: "UPLC-MS/MS法测定婴幼儿配方乳粉中五种核苷酸的研究", 《营养学报》 * |
| 孙姗姗等: "三重四级杆串联质谱法测定乳粉类产品中5种核苷酸的含量", 《食品安全质量检测学报》 * |
| 李涛等: "RP-HPLC同时测定婴幼儿食品中5种核苷酸的研究", 《食品工业》 * |
| 苑向杰等: "婴幼儿配方奶粉中核苷酸含量测定", 《中国乳业》 * |
| 蔡小明等: "高效液相色谱法测定饲料中五种核苷酸的含量", 《饲料工业》 * |
| 郑红等: "高效液相色谱法同时测定婴幼儿配方乳粉中5种游离核苷酸", 《分析试验室》 * |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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