CN109060996B - 玉米籽粒中叶酸的提取和定量方法 - Google Patents

玉米籽粒中叶酸的提取和定量方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及植物叶酸提取，具体涉及一种玉米籽粒中叶酸的提取和定量方法。包括如下步骤：取玉米籽粒冻干粉，加入新制的提取液，超声涡旋后，置于100℃温度下震荡10min，冰上迅速冷却；加入α‑淀粉酶，37℃下恒温震荡酶解；加入蛋白酶，37℃下恒温震荡酶解；离心，取上清液，即得；所述提取液的配方为：每100ml提取液中含有NaH2PO4 249‑349mg，Na2HPO4·2H2O 659‑759mg，L‑抗坏血酸1‑1.2g，2‑巯基乙醇0.4‑1.0ml，pH 6.8‑7.0。本发明同时准确定量了玉米籽粒中12种不同尾数、不同氧化态的叶酸，为叶酸代谢物的动态分析提供了技术支持。

Description

玉米籽粒中叶酸的提取和定量方法
技术领域
本发明涉及植物叶酸提取，具体涉及一种玉米籽粒中叶酸的提取和定量方法。
背景技术
叶酸是一类水溶性维生素(VB9)，包含叶酸、四氢叶酸及其相应的衍生物。作为一碳代谢的核心辅酶因子，叶酸在一碳循环以及DNA、氨基酸、蛋白等生命物质的合成中发挥着重要的作用。在动植物生长发育过程中，不同尾数、不同氧化形式的叶酸具有不同的生物活性，对动植物的生长发育至关重要。作物是人类和动物获取叶酸的主要来源，然而，作物中的叶酸含量较低，尤其是在谷物中的含量更低。因此，通过基因工程和育种技术来提高植物体内的叶酸水平成为了研究热点，如何获得作物中各种叶酸衍生物含量的可靠数据成为这一研究领域的关键。然而，由于天然样品中的叶酸含量低并且存在多种不稳定的衍生物，致使作物中各种叶酸的准确定量面临很大的挑战。
此前已报道过生菜、花椰菜、细菌中的5-甲基四氢叶酸(5-M-THF)及其多谷氨酸衍生物的定量。但针对作物中天然的多谷氨酸5-甲酰四氢叶酸的定量少有报道。Campos等[1]通过比较婴幼儿配方奶粉在双酶处理和三酶处理下的单谷氨酸5-甲酰四氢叶酸含量，利用差值表征其多谷氨酸盐的含量，但缺乏对不同尾数多谷氨酸5-甲酰四氢叶酸的具体定量。Haandel等[2]通过比较多谷氨酸蝶酰和4-氨基-10-甲基蝶酰六谷氨酸在LC-MS/MS中的响应因子，推测相应的多谷氨酸5-甲酰四氢叶酸的响应因子并进行定量，这一方法缺乏足够的准确性。
在各种生物体中，叶酸的代谢过程十分复杂，各种叶酸衍生物的含量和稳定性各不相同，准确检测叶酸及其衍生物的含量十分困难。与细菌基质相比，植物基质的组成更为复杂。不同的植物基质中，叶酸衍生物的组成和含量均不相同。在提取过程中，叶酸容易被植物组织中的淀粉包裹，因此，高淀粉作物(例如玉米、土豆、莲藕)中的叶酸比低淀粉蔬菜(例如菠菜、生菜)中的叶酸更难以提取。
玉米是我国重要的粮食作物，研究玉米籽粒中的叶酸代谢，对于以营养为导向的生物育种具有重要意义。然而，要准确定量玉米籽粒中的叶酸及其衍生物，提取方法是关键，因为叶酸提取的质量直接影响到总叶酸及各种叶酸衍生物的测定结果。迄今，对多谷氨酸5-甲酰-四氢叶酸(5-F-THF)的定量少有报道，因其面临如下多种挑战：(1)含量低于多谷氨酸5-M-THF，更低的含量带来更大的提取和检测难度；(2)叶酸的多谷氨酸形式在高温下不稳定，极易分解；(3)多谷氨酸叶酸易被内源性的γ-谷氨酸水解酶水解。此外，检测技术对叶酸的定量同样重要。微生物检测法是叶酸检测中使用最多的方法，并收入了美国官方分析化学家协会[3]和美国谷物化学师学会[4]制定的推荐标准。然而，微生物方法具有分辨率低、线性范围窄的缺点，并且不能区分不同形式的叶酸。
为了准确检测玉米籽粒中叶酸及其衍生物的含量，需要有针对性地建立一种稳定可靠的叶酸检测体系。
发明内容
为满足上述领域存在的需求，本发明提供一种能够同时准确定量玉米籽粒中12种不同尾数、不同氧化态叶酸的方法。
本发明请求保护的技术方案如下：
从玉米籽粒中提取叶酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取玉米籽粒冻干粉，加入新制的提取液，超声涡旋后，置于100℃温度下震荡10min，冰上迅速冷却；
(2)加入α-淀粉酶，37℃下恒温震荡酶解；
(3)加入蛋白酶，37℃下恒温震荡酶解；
(4)离心，取上清液，即得；
所述提取液的配方为：每100ml提取液含有NaH2PO4 249-349mg，Na2HPO4·2H2O659-759mg，L-抗坏血酸1-1.2g，2-巯基乙醇0.4-1.0ml，pH 6.8-7.0。
优选地，每毫克玉米籽粒冻干粉使用10-15μL的提取液，0.48-0.72个酶活力单位的α-淀粉酶，0.0021-0.0028个酶活力单位的蛋白酶。
优选地，每毫克玉米籽粒冻干粉加入13μL的提取液，0.48个酶活力单位的α-淀粉酶，0.0021个酶活力单位的蛋白酶。
优选地，每100ml提取液含有NaH2PO4 299.95mg，Na2HPO4·2H2O 709.8mg，L-抗坏血酸1g，2-巯基乙醇0.5ml，pH 7.0。
优选地，所述步骤(1)中，冰上迅速冷却5min；所述步骤(2)中，37℃下恒温震荡酶解30min；所述步骤(3)中，37℃下恒温震荡酶解60min。
玉米籽粒中叶酸的定量方法，其特征在于，包括如下步骤：
标准曲线绘制：用提取液将待测叶酸的标准品溶液稀释为梯度浓度，向每个浓度的标准品溶液中加入内标，然后分别进行HPLC–MS/MS检测，建立标准品和内标的相对响应值与标准品和内标的相对浓度之间的标准曲线方程；
叶酸提取：使用任一所述的方法提取玉米籽粒中的叶酸，提取时在提取液中加入内标；
叶酸定量：对提取物进行HPLC–MS/MS检测，得到待测叶酸和内标的相对响应值；将待测叶酸和内标的相对响应值以及内标的浓度代入所述标准曲线方程中，计算得到待测叶酸的浓度。
优选地，所述待测叶酸包括5-M-THFGlu1、THF、5,10-CH＝THF、10-F-FA、5-M-THFGlu2、5-M-THFGlu3、5-M-THFGlu4、5-F-THFGlu1、5-F-THFGlu2、5-F-THFGlu3、5-F-THFGlu4、FA。
优选地，所述内标为甲氨蝶呤和13C 5-F-THFGlu1，其中，所述甲氨蝶呤作为5-M-THFGlu1、THF、5,10-CH＝THF、10-F-FA的内标，所述13C 5-F-THFGlu1作为5-M-THFGlu2、5-M-THFGlu3、5-M-THFGlu4、5-F-THFGlu1、5-F-THFGlu2、5-F-THFGlu3、5-F-THFGlu4、FA的内标。
优选地，所述甲氨蝶呤和13C 5-F-THFGlu1在体系中的终浓度均为25.0ng/mL。
优选地，所述HPLC–MS/MS检测包括以下步骤：
HPLC分析：在Agilent 1260HPLC系统中完成，色谱柱为安捷伦Poreshell 120SB-C18(2.1*75mm，2.7μm)，流速0.30mL/min，进样量15.0μL；进样器及柱温箱的温度分别设置为4℃和25℃；流动相A为0.1％(v/v)甲酸水溶液，流动相B为0.1％(v/v)甲酸乙腈溶液；流动相梯度变化如下，总时间为20min：
时间/分钟 流动相B(％)
0 5
2 9
9 9.6
9.2 20
13.2 20
14 5
MS/MS分析：采用配有ESI源的安捷伦6420三重四级杆串联质谱在正离子模式下进行MRM定量分析，具体参数如下：离子源干燥气温度320℃，干燥气流速11L/min，雾化器压力35psi，毛细管电压3500V(+)；系统设置、数据采集、数据分析均在安捷伦Masshunter系列软件中完成。
本发明提供的叶酸提取方法能够稳定、准确地提取玉米籽粒中多谷氨酸叶酸。由于植物组织的复杂性和叶酸种类的不稳定性，在不同的植物基质中，有效提取叶酸的参数会有所不同。在此，我们优化了玉米基质的提取液、水解酶失活和酶处理参数。其中，新鲜玉米籽粒中的水分已经通过冷冻干燥除去，尽可能减少了水分对含量测定的影响。磷酸盐缓冲液是保持多谷氨酸叶酸稳定的必要条件，提取液中各组分的配比以及提取液的用量保证了检测结果的准确性。内源性多谷氨酸水解酶的快速失活避免了多谷氨酸结构的水解。与常用的三酶处理法相比，二酶法确保了多谷氨酸叶酸在萃取过程中的稳定性，提高了叶酸提取效率。
本发明的叶酸提取方法，为保持多尾叶酸的稳定构建了良好的提取环境。其中，所使用的α-淀粉酶，系统名称为1,4-α-D-葡聚糖葡聚糖水解酶(1,4-α-D-Glucan-glucanohydrolase)，别名为液化型淀粉酶、液化酶、α-1，4-糊精酶。1个酶活力单位的α-淀粉酶表示在25℃，pH6.0的条件下1分钟内从淀粉中释放1毫克麦芽糖的酶量。所使用的蛋白酶包含至少三种酪蛋白溶解酶和一个氨基肽酶，三种酪蛋白溶解酶命名为灰色链霉菌蛋白酶A，灰色链霉菌蛋白酶B和灰色链霉菌胰蛋白酶。在pH值为7.5，温度为37℃时，一个酶活力单位每分钟水解酪蛋白产生1.0μmole(181μg)酪氨酸，酪氨酸数量通过Folin-Ciocalteu比色反应测定。
本发明的叶酸定量方法，采用本发明的叶酸提取方法，准确提取出玉米籽粒中多谷氨酸叶酸，然后基于本发明优化的HPLC-MS/MS分析方法，同时准确定量玉米籽粒中12种不同尾数、不同氧化态叶酸。这12种叶酸不仅包含了如四氢叶酸(THF)、10-甲酰-四氢叶酸(10-F-FA)、单谷氨酸5-甲基四氢叶酸(5-M-THFGlu1)、单谷氨酸5-甲酰四氢叶酸(5-F-THFGlu1)等常见的单尾叶酸，更包含了6种多谷氨酸叶酸，分别是二谷氨酸5-甲基四氢叶酸(5-M-THFGlu2)、三谷氨酸5-甲基四氢叶酸(5-M-THFGlu3)、四谷氨酸5-甲基四氢叶酸(5-M-THFGlu4)、二谷氨酸5-甲酰四氢叶酸(5-F-THFGlu2)、三谷氨酸5-甲酰四氢叶酸(5-F-THFGlu3)、四谷氨酸5-甲酰四氢叶酸(5-F-THFGlu4)，其中的多谷氨酸5-甲酰-四氢叶酸更是少有报道。
内标法通常用于降低基质效应对LC-MS/MS定量结果的影响。待测物的同位素标记物因其具备同样的物理与化学性质，是最佳的内标物选择。然而，并非所有的叶酸衍生物都有商业化的同位素标记物。在这项研究中，我们选择13C 5-F-THF和MTX分别作为两组待测物的内标物，尽可能校正基质效应对检测结果的影响。方法学验证结果表明，分析方法的检测限为2.29–49.2fmol，定量限为7.18–164fmol，回收率除5,10-CH＝THF(56.6％)以外均处于74.6％到114％之间。多数待测物的日内精密度小于5％，日间精密度小于15％，因此提取物需要及时进样分析。通过该方法，我们检测到了玉米籽粒在萌发过程中的各种多尾叶酸的含量变化。
综上，本发明成功地提取了玉米籽粒中多谷氨酸5-甲酰四氢叶酸、多谷氨酸5-甲基四氢叶酸及其他常见叶酸并基于HPLC-MS/MS技术实现了这些叶酸的准确定量。所述定量方法能够用于准确分析玉米籽粒中不同尾数叶酸水平的动态变化，为叶酸代谢物的研究提供了一个新的视角，可以进一步应用于代谢通量的分析，帮助营养导向生物育种。此外，它还可能为日常食品的单、多谷氨酸叶酸生物利用率研究提供技术支持。
附图说明
图1.叶酸及其衍生物结构示意图；叶酸主要由蝶呤、对氨基苯甲酸和谷氨酸三个结构组成。右侧谷氨酸可连接多个谷氨酸形成长链。
图2.叶酸提取方法的优化；
A.分别以H2O和50mM PBS作为提取溶剂时，待测物10-F-FA，THF，FA，5，10-CH＝THF，5-M-THFGlu1-4和5-F-THFGlu1-4的回收率，n＝3。
B.进行不同时间的GGH灭活时，待测物10-F-FA，THF，FA，5，10-CH＝THF，5-M-THFGlu1-4和5-F-THFGlu1-4的回收率，n＝3。样品分别在100℃下加热0min、10min、20min、30min以灭活内源性GGH。10min*是从标准品溶液(用提取液稀释至浓度MQ)中提取待测物的回收率。
C.α-淀粉酶的用量优化。分别使用0、5、10、20、30μLα-淀粉酶(1200units/mL)处理样品后，加入15μL蛋白酶(7units/mL)处理，待测物10-F-FA，THF，FA，5，10-CH＝THF，5-M-THFGlu1-4和5-F-THFGlu1-4的回收率，n＝3。
D.蛋白酶的用量优化。使用20μLα-淀粉酶(1200units/mL)处理后，分别加入0、5、10、15、20μL蛋白酶(7units/mL)处理，待测物10-F-FA，THF，FA，5，10-CH＝THF，5-M-THFGlu1-4和5-F-THFGlu1-4的回收率，n＝3。
图3.α-淀粉酶和蛋白酶对叶酸提取的影响；
其中，不同颜色代表不同的酶处理，共四种处理：不加酶，只加20μLα-淀粉酶(1200units/mL)、只加15μL蛋白酶(7units/mL)、加入20μLα-淀粉酶(1200units/mL)和15μL蛋白酶(7units/mL)。A.实验设计流程图；B.四种处理中各种待测物的回收率。结果显示α-淀粉酶和蛋白酶共同处理时提取效果最佳。
图4.玉米籽粒(GEMS 31)萌发时胚中叶酸及其衍生物含量变化；
其中，柱状图展示了在籽粒萌发1-5天内5-M-THFGlu1，2，3，4，5-F-THFGlu1，2，3，4，5，10-CH＝THF，10-F-FA，FA和THF的浓度变化；DW表示干重。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明，需要理解的是，下述实施例仅作为解释和说明，不以任何方式限制本发明的保护范围。
材料和试剂
GEMS 31、CML 170：已知玉米品种，其玉米籽粒来源于河北省廊坊市实验基地。
甜玉米的玉米籽粒：购自北京市海淀区本地市场。
标准品：单谷氨酸5-甲基四氢叶酸(5-M-THFGlu1)、二谷氨酸5-甲基四氢叶酸(5-M-THFGlu2)、三谷氨酸5-甲基四氢叶酸(5-M-THFGlu3)、四谷氨酸5-甲基四氢叶酸(5-M-THFGlu4)、单谷氨酸5-甲酰四氢叶酸(5-F-THFGlu1)、单谷氨酸5-甲酰(13C)四氢叶酸(13C 5-F-THFGlu1)、二谷氨酸5-甲酰四氢叶酸(5-F-THFGlu2)、三谷氨酸5-甲酰四氢叶酸(5-F-THFGlu3)、四谷氨酸5-甲酰四氢叶酸(5-F-THFGlu4)、叶酸(FA)、四氢叶酸(THF)、10-甲酰叶酸(10-F-FA)、5，10-次甲基四氢叶酸(5，10-CH＝THF)以及甲氨蝶呤(MTX)均购自Schircks(瑞士约那市)。
磷酸二氢钠(NaH2PO4，≥99.0％)，磷酸氢二钠(Na2HPO4，≥99.0％)，以及L-抗坏血酸(C6H8O6，99％)均购自Sigma-Aldrich(美国密苏里州)。
2-巯基乙醇(生物技术级)和甲酸均购自Amresco(美国俄亥俄州)。
α-淀粉酶(来自米曲霉，～30units/mg，EC 232-588-1，产品编号：SIGMA-10065)和蛋白酶(Type XIV，来自灰色链霉菌，≥3.5units/mg，EC 232-909-5，产品编号：SIGMA-P5147)均购自Sigma-Aldrich公司并溶于超纯水中(α-淀粉酶，1200units/mL；蛋白酶，7units/mL)。
实验中所使用的超纯水均由Heal Force超纯水系统(中国上海)制得。
乙腈(LC-MS级)购自赛默飞世尔科技(比利时赫尔市)。
Agilent 1260HPLC系统及液相色谱分析柱(Poreshell 120SB-C18，2.7μm，100mm)购自安捷伦科技(美国加里佛利亚)。
加热和提取处理均在2mL样品管(艾本德，德国)和金属浴加热震荡器(奥盛，中国)中完成。
离心操作在3K15型号离心机上完成(Sigma，德国)。离心后上清液通过0.22μm尼龙滤膜(津腾，中国)过滤。
最终提取液转移进2mL液相进样瓶(安捷伦科技，美国)等待进样。
本发明未特别说明的生物化学试剂和耗材均为本领域常规试剂和耗材，可按照本领域常规方法制得或商购获得；未特别说明的实验条件，均为本领域常规实验条件。
实施例1.玉米籽粒中的叶酸定量
1.制备标准品溶液
除5-F-THFGlu1和13C 5-F-THFGlu1以外，所有的标准品均溶于含有20mM甲酸铵、1％(w/v)L-抗坏血酸以及0.5％(v/v)2-巯基乙醇的甲醇/水(1:1，v/v)溶液中。5-F-THFGlu1和13C 5-F-THFGlu1溶于含有1％(w/v)L-抗坏血酸以及0.5％(v/v)2-巯基乙醇的水溶液中。所有标准品溶液的浓度均为100μg/mL，保存在-80℃下备用。使用时采用提取液进行稀释。
2.从玉米籽粒中提取叶酸的方法
玉米籽粒冻干粉：新鲜的玉米籽粒在液氮条件下用MM 400研磨仪(德国Retsch)研磨后在ALPHA 1-4LDPlus冻干机(德国Christ)中冻干，得到玉米籽粒冻干粉，装入15ml或50ml冻存管中，-80℃保存。
提取液：使用50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)配制含有1％(w/v)L-抗坏血酸以及0.5％(v/v)2-巯基乙醇的提取液。(提取液现用现配)
1％(w/v)L-抗坏血酸，指100ml提取液含有1g的L-抗坏血酸。
0.5％(v/v)2-巯基乙醇，指100mL提取液含有0.5mL 2-巯基乙醇。
50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)的配制方法：每100ml提取液含有NaH2PO4 299.95mg，Na2HPO4·2H2O 709.8mg。
内标溶液：使用提取液稀释标准品溶液获得含有650ng/mL甲氨蝶呤，650ng/mL13C5-F-THFGlu1的内标溶液。
叶酸提取步骤：
(1)取50mg玉米籽粒冻干粉，加入650μL新制的提取液和27.4μL(终溶液总体积的1/25)内标溶液。超声涡旋1min后，置于100℃下震荡10min并在冰上迅速冷却5min。
(2)冷却后加入20.0μLα-淀粉酶(1200units/mL)，37℃下恒温震荡30min。
(3)随后加入15.0μL蛋白酶(7units/mL)，37℃下恒温震荡1h。
(4)酶解后离心(20min，10000rpm)，取上层清液过滤(0.22μm滤膜)后移入2mL液相进样瓶等待进样分析。
3.拟空白基质的准备
分别将CML 170、GEMS 31以及市场购买的甜玉米的玉米籽粒按照步骤2中的叶酸提取方法进行处理，不加入内标溶液，获得了CML 170拟空白基质、GEMS 31拟空白基质、甜玉米拟空白基质。将这三种拟空白基质等比例混合，得到混合拟空白基质。这四种基质将用于后续的方法学验证。
4.LC-MS/MS检测方法
HPLC参数
液相色谱部分在Agilent 1260HPLC系统中完成。色谱柱为安捷伦Poreshell120SB-C18(2.1*75mm，2.7μm)，流速0.30mL/min，进样量15.0μL。进样器及柱温箱的温度分别设置为4℃和25℃。流动相A为0.1％(v/v)甲酸水溶液，流动相B为0.1％(v/v)甲酸乙腈溶液。流动相梯度变化如下(总时间20min)：
时间/分钟 流动相B(％)
0 5
2 9
9 9.6
9.2 20
13.2 20
14 5
由于目标待测物主要在流动相B比例由9％过渡到9.6％时流出，因此，通过将这一过渡阶段设置为7min以实现化合物的分离。之后，用20％的流动相B冲洗4分钟以保证没有叶酸残留。在进行大规模分析时，色谱柱每隔24小时会使用90％流动相B冲洗一小时。
QQQ参数
质谱部分采用配有ESI源的安捷伦6420三重四级杆串联质谱在正离子模式下进行MRM定量分析，具体参数如下：离子源干燥气温度320℃，干燥气流速11L/min，雾化器压力35psi，毛细管电压3500V(+)。系统设置、数据采集、数据分析均在安捷伦Masshunter系列软件中完成。通过分析标准品溶液，确定了各待测物母子离子对及相应碰撞能量，得到了相关MRM参数(表1)。
5.方法学验证
基质效应
针对三个不同浓度等级分别计算基质效应因子(MF)与内标归一化基质效应因子(IS normalised MF)。每种待测物的浓度设置如表2所示，三个浓度等级分别为HQ(约工作浓度范围的81％)、MQ(约工作浓度范围的40％)、LQ(最低工作浓度的3倍)。计算公式如下，公式(1)中A、B、C分别为基质加标样品、拟空白基质样品、纯溶剂加标样品中的待测物积分峰面积，公式(2)中MFanalyte和MFIS分别为待测物和相应内标物的基质效应因子。
Figure BDA0001792152580000081
Figure BDA0001792152580000082
其中，基质加标样品是指向拟空白基质中加入标准品所得到的样品；纯溶剂加标样品是指向空白提取液加入等量标准品所得到的样品。
结果如表2所示，我们分别计算了12种叶酸待测物和2种内标物的基质效应因子(MF)。根据MF，12种叶酸待测物可以分为2组。A组包括5-M-THFGlu1、THF、5，10CH＝THF、10-F-FA，其MF为50％左右。B组包括其他8个，其MF为100％左右。同时，MTX和13C5-F-THF这两种内标物的MF分别在50％和100％左右。因此，我们使用了MTX和13C5-F-THF分别作为A组和B组内标物，以尽可能地校正基质效应对检测结果的影响。经过内标归一化后，在3个不同浓度水平(LQ，MQ，HQ)下待测物基质效应因子除5,10-CH＝THF和THF外，均接近100％且具有较低的RSD(表2)。
线性和灵敏度
校准曲线是由标准品溶液通过一系列稀释后分析绘制的。这里，我们选取了1.00，2.00，5.00，10.0，20.0，50.0，100，200，500ng/mL和1.00μg/mL共计十个浓度点绘制标准曲线。不同待测物的测定工作范围不同，相应使用的浓度点也不同，具体参见表1。不同浓度水平的标准品溶液均加入总体积1/25的内标溶液(13C 5-F-THF，650ng/mL；MTX，650ng/mL)以保证内标物最终浓度均为25.0ng/mL。
定量方法的应用范围受灵敏度水平的限制，特别是对低含量代谢物的测定。更高的灵敏度能够降低检测的检出限(LOD)和定量限(LOQ)。LOD是信噪比为3时待测物的量，LOQ是信噪比为10且含有至少八个数据点时待测物的量。12种待测叶酸的LOD范围是2.29～49.2fmol，LOQ范围是7.18～164fmol。
利用线性回归建立浓度曲线(回归原点：不强制，权重：无)。校准曲线的评价标准是相关系数(R2)大于等于0.994。表1显示了待测物浓度曲线参数。
回收率和精度
回收率和精密度分别描述了分析过程的提取效率和测定结果的重复性。
根据美国FDA的生物检测指导意见，回收率应该是一致的，精确的和可重复的。回收率根据公式(3)进行计算，其中S1、S2和S3分别代表了加标样品、拟空白基质样品以及相应的纯溶剂加标样品的积分峰面积。实验考察了在四种基质(CML 170、GEMS 31、甜玉米、三个品种的等比例混合)中，三个浓度等级(HQ，MQ，LQ)的待测物的回收率(n＝5，即每组样品设5份重复)。
Figure BDA0001792152580000091
其中，加标样品是指将标准品溶液与提取液一起加入玉米籽粒冻干粉中，按照步骤2中的叶酸提取方法制备的样品。纯溶剂加标样品是指向空白提取液加入等量标准品所得到的样品。
结果如表2所示，在四种基质中，三个不同浓度等级(LQ，MQ，HQ，n＝5)的待测物的回收率为74.6％到114％，除了5,10-CH＝THF(56.6％)。根据之前的结果，5,10-CH＝THF的内标归一化MF是34.2％，远远低于其他待测物，表明基质效应对其检测影响较大。因此，5,10-CH＝THF的回收率仅为56.6％是可能的。此外，5,10-CH＝THF不同浓度间回收率的RSD值为2.94％，且日间日内精密度低于10％(表2)。这意味着测定结果是一致的、精确的、可重现的，因此是可靠的。
根据美国FDA的生物检测指导意见，分析方法的精密度描述了反复测量来自同一份均匀生物基质的等量样本时，其个体测量值的离散程度。我们同时考察了四种基质中，三个浓度等级(HQ，MQ，LQ)的待测物检测的日间精密度(3天，n＝5，4种基质)和日内精密度(n＝5，4种基质)，以相对标准偏差来表示。
结果如表2所示，大多数待测物的日内精密度和日间精密度低于15.0％，符合FDA指导标准。只有5-F-THFGlu4的精密度(日内，20％；日间，22.7％)超过指导标准。
实施例2.叶酸提取方法的优化
1.提取溶剂优化
作为整个系统体系的主溶剂，提取液一般选用磷酸盐缓冲溶液(PBS)作为溶剂。同时，加入巯基乙醇和抗坏血酸作为抗氧化剂。但是，由于磷酸盐不挥发，大量使用会影响质谱离子化效率并减少质谱使用寿命。因此，我们比较了水和PBS两种提取溶剂，以评估使用磷酸盐缓冲液的必要性。
以GEMS 31品种的玉米籽粒为样品，按照如下方法进行实验。
从玉米籽粒中提取叶酸：提取时，将10-F-FA，THF，FA，5，10-CH＝THF，5-M-THFGlu1-4和5-F-THFGlu1-4标准品随提取液加入玉米籽粒冻干粉中(各标准品的终浓度为表2中相应的MQ)，同时加入总体积1/25的内标溶液(13C 5-F-THF，650ng/mL；MTX，650ng/mL)，使内标物的终浓度均为25.0ng/mL。设置2种处理：(1)以水为溶剂配制提取液(含0.5％[v/v]巯基乙醇和1％[w/v]抗坏血酸)；(2)以50mM PBS为溶剂配制提取液(pH 7.0，含0.5％[v/v]巯基乙醇和1％[w/v]抗坏血酸)。除此以外，叶酸提取方法同实施例1。每种处理设3个重复。
LC-MS/MS检测：对10-F-FA，THF，FA，5，10-CH＝THF，5-M-THFGlu1-4和5-F-THFGlu1-4进行检测，计算每种待测物的回收率，方法同实施例1，数据用平均值±标准偏差表示。
结果如图2A所示，在重复性和回收率方面，PBS的提取效果较好。两种提取液的重复性都在10.0％以下(相对标准偏差)。其中，5-F-THFGlu3的回收率(水53.4％，PBS79.0％)，5-F-THFGlu4的回收率(水11.9％，PBS87.3％)，5-M-THFGlu3的回收率(水45.3％，PBS90.4％)和5-M-THFGlu4的回收率(水54.4％，PBS80.5％)，以水为提取溶剂时回收率明显更低；5-F-THFGlu2的回收率(水272％，PBS81.7％)，5-M-THFGlu1的回收率(水177.9％，PBS87.1％)，5-M-THFGlu2的回收率(水162.4％，PBS87.4％)，以水为提取溶剂时回收率高得多。我们推测是由于纯水加速了多谷氨酸结构水解，导致多谷氨酸叶酸回收率降低，单谷氨酸和二谷氨酸回收率升高。
所以，50mM PBS(pH7.0，含0.5％[v/v]巯基乙醇和1％[w/v]抗坏血酸)被选为提取溶剂，因为它在提取过程中能够更好地稳定多谷氨酸叶酸。然而，在质谱分析中，必须避免非挥发性磷酸盐污染。因此，在进样后的0.6分钟内将会使用高水相冲洗系统，并将流动相导入废液桶中。
2.γ-谷氨酰水解酶(GGH)的灭活
在提取过程中保持多谷氨酸叶酸稳定的难点在于植物组织中内源性GGH的灭活。酶的灭活方法很多，包括加热、酸化和碱处理。在酸化和碱处理中，会将组分添加到反应溶液中。此外，酸化或碱处理在灭活酶的同时会改变提取液的pH值，进而破坏提取液中叶酸的稳定性。相比之下，加热不会增加额外的组分，而且相对简单和高效。在这里，催化降解叶酸及其衍生物的内源酶采用加热法进行灭活。然而，在这项研究中，目标叶酸种类在高温下不稳定。因此，在叶酸及其衍生物发生显著降解之前，采用快速加热灭活GGH。
以GEMS 31品种的玉米籽粒为样品，按照如下方法进行实验。
从玉米籽粒中提取叶酸：提取时，将10-F-FA，THF，FA，5，10-CH＝THF，5-M-THFGlu1-4和5-F-THFGlu1-4标准品随提取液加入玉米籽粒冻干粉中(各标准品的终浓度为表2中相应的MQ)，同时加入总体积1/25的内标溶液(13C 5-F-THF，650ng/mL；MTX，650ng/mL)，使内标物的终浓度均为25.0ng/mL。设置4种处理：(1)100℃下震荡0min；(2)100℃下震荡10min；(3)100℃下震荡20min；(4)100℃下震荡30min。除此以外，叶酸提取方法同实施例1。每种处理设3个重复。
LC-MS/MS检测：对10-F-FA，THF，FA，5，10-CH＝THF，5-M-THFGlu1-4和5-F-THFGlu1-4进行检测，计算每种待测物的回收率，方法同实施例1，数据用平均值±标准偏差表示。
结果如图2B所示，在没有灭活操作的情况下，5-MTHFGlu3，5-MTHFGlu4，5-FTHFGlu3，5-FTHFGlu4回收率几乎为零。比较20min、30min的结果，由于加热时间延长，除了FA所有检测到的叶酸的回收率明显减少，包括多谷氨酸叶酸和相应的单谷氨酸形式。因此，加热20min更佳。而对于10min和20min的数据结果而言，除FA(20min的回收率为85.4％，10min的回收率为70.3％)外，这段时间的延长并没有导致回收率的明显变化。我们还比较了叶酸种类的总回收率，总回收率在加热10min内达到峰值，并随后减少。所以，10min是最适合的加热时间。
3.二酶法优化
GGH灭活后，从样品中继续提取多谷氨酸叶酸。传统的三酶处理(α-淀粉酶、蛋白酶和大鼠血清)包括了多谷氨酸尾的水解，而多谷氨酸叶酸正是本研究的目标化合物。因此，本研究将三酶法变为二酶法，即只使用α-淀粉酶和蛋白酶。我们考察了α-淀粉酶(1200units/mL)和蛋白酶(7units/mL)在萃取过程中的作用，以确定每种酶处理的必要性。
以GEMS 31品种的玉米籽粒为样品，按照如下方法进行实验。
从玉米籽粒中提取叶酸：提取时，将10-F-FA，THF，FA，5，10-CH＝THF，5-M-THFGlu1-4和5-F-THFGlu1-4标准品随提取液加入玉米籽粒冻干粉中(各标准品的终浓度为表2中相应的MQ)，同时加入总体积1/25的内标溶液(13C 5-F-THF，650ng/mL；MTX，650ng/mL)，使内标物的终浓度均为25.0ng/mL。设置4种处理：(1)不使用α-淀粉酶和蛋白酶处理；只使用α-淀粉酶处理；(2)只使用蛋白酶处理；(3)使用α-淀粉酶和蛋白酶处理。除此以外，叶酸提取方法同实施例1。每种处理设3个重复。
LC-MS/MS检测：对10-F-FA，THF，FA，5，10-CH＝THF，5-M-THFGlu1-4和5-F-THFGlu1-4进行检测，计算每种待测物的回收率，方法同实施例1，数据用平均值±标准偏差表示。
结果如图3B所示，多谷氨酸叶酸经过α-淀粉酶和蛋白酶处理后回收率较好(5-M-THFGlu2，92.2％；5-M-THFGlu3，100.9％；5-M-THFGlu4，85.4％；5-F-THFGlu2，90.1％；5-F-THFGlu3，87.0％和5-F-THFGlu4，70.9％)。无论是单独的α-淀粉酶或者单独的蛋白酶处理，回收率均不高。仅使用α-淀粉酶处理时，回收率为71.1％(5-M-THFGlu2)，43.5％(5-M-THFGlu3)，45.3％(5-M-THFGlu4)，65.6％(5-F-THFGlu2)，57.2％(5-F-THFGlu3)和46.1％(5-F-THFGlu4)。仅使用蛋白酶处理时，回收率为48.8％(5-M-THFGlu3)，56.8％(5-M-THFGlu4)，62.0％(5-F-THFGlu2)，55.2％(5-F-THFGlu3)和52.5％(5-F-THFGlu4)。由于玉米籽粒富含淀粉，悬浮液在加热10分钟后黏度较大，增大了样品的离心过滤的难度。但在α-淀粉酶水解后，悬浮液黏度降低，易于过滤。因此，α-淀粉酶和蛋白酶对高效提取叶酸都是必需的。
随后，我们分别针对这两种酶的数量进行优化。
α-淀粉酶的用量优化
以GEMS 31品种的玉米籽粒为样品，按照如下方法进行实验。
从玉米籽粒中提取叶酸：提取时，将10-F-FA，THF，FA，5，10-CH＝THF，5-M-THFGlu1-4和5-F-THFGlu1-4标准品随提取液加入玉米籽粒冻干粉中(各标准品的终浓度为表2中相应的MQ)，同时加入总体积1/25的内标溶液(13C 5-F-THF，650ng/mL；MTX，650ng/mL)，使内标物的终浓度均为25.0ng/mL。设置5种处理，分别添加0μL、5μL、10μL、20μL、30μLα-淀粉酶(1200units/mL)，比较α-淀粉酶用量对叶酸提取效果的影响。除此以外，叶酸提取方法同实施例1。每种处理设3个重复。
LC-MS/MS检测：对10-F-FA，THF，FA，5，10-CH＝THF，5-M-THFGlu1-4和5-F-THFGlu1-4进行检测，计算每种待测物的回收率，方法同实施例1，数据用平均值±标准偏差表示。
将α-淀粉酶添加到反应混合物中，主要用于水解淀粉和其他多糖的样品基质。如图2C所示，α-淀粉酶浓度越高，回收率越大。在加入20、30μLα-淀粉酶的样品中，叶酸提取效率最高，各待测物的回收率在5种处理中最接近100％。因此，综合考虑叶酸提取成本和回收率，选择加入20μLα-淀粉酶溶液完成提取过程。
蛋白酶的用量优化
以GEMS 31品种的玉米籽粒为样品，按照如下方法进行实验。
从玉米籽粒中提取叶酸：提取时，将10-F-FA，THF，FA，5，10-CH＝THF，5-M-THFGlu1-4和5-F-THFGlu1-4标准品随提取液加入玉米籽粒冻干粉中(各标准品的终浓度为表2中相应的MQ)，同时加入总体积1/25的内标溶液(13C 5-F-THF，650ng/mL；MTX，650ng/mL)，使内标物的终浓度均为25.0ng/mL。设置5种处理，分别添加0μL、5μL、10μL、15μL、20μL蛋白酶溶液(7units/mL)，比较蛋白酶用量对叶酸提取效果的影响。除此以外，叶酸提取方法同实施例1。每种处理设3个重复。
LC-MS/MS检测：对10-F-FA，THF，FA，5，10-CH＝THF，5-M-THFGlu1-4和5-F-THFGlu1-4进行检测，计算每种待测物的回收率，方法同实施例1，数据用平均值±标准偏差表示。
α-淀粉酶处理后，将蛋白酶添加到样品中，释放出部分蛋白结合的叶酸。如图2D所示，除了5-MTHFGlu4和FA外，各待测物的回收率均在加入15μL或20μL蛋白酶溶液后达到最高值。由于各待测物的回收率总值在15μL时达到峰值，因此，选择加入15μL蛋白酶溶液完成样品提取。
4.酶溶液中的内源性叶酸以及提取效率
因为α-淀粉酶及蛋白酶均来源于细菌，所以为了避免酶溶液中内源性叶酸对检测结果带来影响，我们准备了空白样品来测试酶溶液中是否有叶酸。结果表明，在六份重复样品中均未发现叶酸，这说明酶溶液中不含有内源性叶酸。
此外，我们还研究了叶酸在纯提取溶液中的回收率，有助于我们了解除样品基质外，由提取操作带来的叶酸损失。结果如图2B所示，10min*是按照实施例1中的叶酸提取方法从标准品溶液(用提取液稀释至浓度MQ)中提取待测物的回收率。这12种叶酸的回收率从72.9％到103％不等，与基质中的回收率相差不大，这表明提取过程没有损失太多叶酸。
实施例3.玉米发芽过程中的单、多谷氨酸叶酸含量测定
我们比较了玉米胚(GEMS 31)在发芽过程中的单、多谷氨酸叶酸的含量变化。胚胎材料分别在萌发的1–5天收集，按照实施例1记载的方法提取玉米胚中的叶酸并进行LC-MS/MS检测。
结果如图4所示，5-M-THFGlu1-4，5-F-THFGlu1-4，5,10-CH＝THF，10-F-FA，FA和THF在所有的样品中均有检测到。前2天内，叶酸的含量整体较低，此时玉米籽粒主要处于吸水阶段。在吸水阶段结束后，5-M-THF和5-F-THF的总含量增加，相应的单、多谷氨酸叶酸分布也发生了变化。5-M-THFGlu4的比例在前4天始终保持在大约60％。从第4天到第5天，5-M-THFGlu4的水平下降了10％(p<0.05)。同时，5-M-THFGlu1和5-M-THFGlu3的水平自第2天开始慢慢增高，并在第4天到第5天时突然增加近5％(5-M-THFGlu1，p<0.01；5-M-THFGlu2，p<0.01)。
至于5-F-THFGlu1-4，5-F-THFGlu1和5-F-THFGlu2的比例在5天内显示了相反的变化。当5-F-THFGlu1占比升高，5-F-THFGlu2占比减少，几乎等量减少(第1天到第2天，第4天到第5天)。当5-F-THFGlu1降低，5-F-THFGlu2增加(第3天到第4天)。当5-F-THFGlu1占比保持不变时，5-F-THFGlu2占比同样不变(第2天到第3天)。5,10-CH＝THF和10-F-FA的变化呈现相同的趋势，但数量级不同。这些数据表明不同的叶酸种类及其衍生物的含量变化在发芽过程中具有一定规律。
对单、多谷氨酸叶酸含量的具体分析可以更好地了解叶酸在玉米生长发育中的内在作用。该方法在玉米萌发中的应用，显示了叶酸种类相对比例的变化。这一方法同样适用于在植物发育过程中的任一生理进程或点的叶酸动力学的研究。
参考文献
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表1. 12个叶酸种类的MS/MS参数，灵敏度和线性
Figure BDA0001792152580000151
*CE，碰撞能量；
**x，待测物和内标的相对浓度；y，待测物和内标的相对响应值；
***13C 5-F-THF和MTX为内标。
表2. 12个叶酸种类的内标归一化基质效应因子、回收率和精密度
Figure BDA0001792152580000161
*MF是内标归一化基质效应因子，以平均值±标准偏差表示；
**回收率以平均值±标准偏差表示。

Claims (7)

1.玉米籽粒中叶酸的定量方法，其特征在于，包括如下步骤：
标准曲线绘制：用提取液将待测叶酸的标准品溶液稀释为梯度浓度，向每个浓度的标准品溶液中加入内标，然后分别进行HPLC–MS/MS检测，建立标准品和内标的相对响应值与标准品和内标的相对浓度之间的标准曲线方程；所述待测叶酸为5-M-THFGlu1、THF、5,10-CH=THF、10-F-FA、5-M-THFGlu2、5-M-THFGlu3、5-M-THFGlu4、5-F-THFGlu1、5-F-THFGlu2、5-F-THFGlu3、5-F-THFGlu4、FA；
叶酸提取：包括如下步骤：
（1）取玉米籽粒冻干粉，加入新制的提取液，超声涡旋后，置于100℃温度下震荡10min，冰上迅速冷却；
（2）加入α-淀粉酶，37℃下恒温震荡酶解30 min；
（3）加入蛋白酶，37℃下恒温震荡酶解60 min；
（4）离心，取上清液，即得；
所述提取液的配方为：每100 ml提取液中含有NaH2PO4 249-349 mg，Na2HPO4·2H2O659-759 mg，L-抗坏血酸1-1.2 g，2-巯基乙醇0.4-1.0 ml，pH 6.8-7.0；
每毫克玉米籽粒冻干粉使用10-15 μL的提取液，0.48-0.72个酶活力单位的α-淀粉酶，0.0021-0.0028个酶活力单位的蛋白酶；提取时在提取液中加入内标；
叶酸定量：对提取物进行HPLC–MS/MS检测，得到待测叶酸和内标的相对响应值；将待测叶酸和内标的相对响应值以及内标的浓度代入所述标准曲线方程中，计算得到待测叶酸的浓度；其中HPLC采用C18色谱柱，流动相A为0.1%（v/v）甲酸水溶液，流动相B为0.1%（v/v）甲酸乙腈溶液；流动相梯度变化如下：
时间/分钟 流动相B（%） 0 5 2 9 9 9.6 9.2 20 13.2 20 14 5
。
2.根据权利要求1所述的定量方法，其特征在于，每毫克玉米籽粒冻干粉加入13μL的提取液，0.48个酶活力单位的α-淀粉酶，0.0021个酶活力单位的蛋白酶。
3.根据权利要求1所述的定量方法，其特征在于，每100 ml提取液中含有NaH2PO4299.95 mg，Na2HPO4·2H2O 709.8 mg，L-抗坏血酸1 g，2-巯基乙醇0.5 ml，pH 7.0。
4.根据权利要求1所述的定量方法，其特征在于，所述叶酸提取的步骤（1）中，所述冰上迅速冷却的时间为5 min。
5.根据权利要求1所述的定量方法，其特征在于，所述内标为甲氨蝶呤和13C 5-F-THFGlu1，其中，所述甲氨蝶呤作为5-M-THFGlu1、THF、5,10-CH=THF、10-F-FA的内标，所述13C5-F-THFGlu1作为5-M-THFGlu2、5-M-THFGlu3、5-M-THFGlu4、5-F-THFGlu1、5-F-THFGlu2、5-F-THFGlu3、5-F-THFGlu4、FA的内标。
6.根据权利要求5所述的定量方法，其特征在于，所述甲氨蝶呤和13C 5-F-THFGlu1在体系中的终浓度均为25.0 ng/mL。
7.根据权利要求1-6任一所述的定量方法，其特征在于，所述HPLC–MS/MS检测包括以下步骤：
HPLC分析：在Agilent 1260 HPLC系统中完成，色谱柱为安捷伦Poreshell 120 SB-C182.1*75 mm，2.7 μm，流速0.30 mL/min，进样量15.0 μL；进样器及柱温箱的温度分别设置为4℃和25℃；流动相A为0.1%（v/v）甲酸水溶液，流动相B为0.1%（v/v）甲酸乙腈溶液；流动相梯度变化如下，总时间为20 min：
时间/分钟 流动相B（%） 0 5 2 9 9 9.6 9.2 20 13.2 20 14 5
MS/MS分析：采用配有ESI源的安捷伦6420三重四级杆串联质谱在正离子模式下进行MRM定量分析，具体参数如下：离子源干燥气温度320℃，干燥气流速11 L/min，雾化器压力35 psi，毛细管电压3500 V+；系统设置、数据采集、数据分析均在安捷伦Masshunter系列软件中完成。
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