CN109633029A - 一种谷子籽粒叶酸提取方法及叶酸含量的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种谷子籽粒叶酸提取方法及谷子籽粒中叶酸含量的测定方法，属于杂粮品质分析技术领域，提供了一种利用”三酶法”提取谷子籽粒叶酸，建立高效液相色谱法测定其叶酸含量，对谷子叶酸品质性状进行评价，所采用的技术方案为a、选择谷子品种‘大白谷’，该品种为山西省主栽品种，生产性状较好；b、利用三酶法对谷子品种进行前处理，并通过高相液相色谱进行检测，本发明对丰富谷子种质资源，提高育种质量，推进谷子品质育种工作具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种谷子籽粒叶酸提取方法及叶酸含量的测定方法，属于杂粮品质分析技术领域。
背景技术
谷子（学名：Setaria italica）是一种重要的小杂粮作物，有“小杂粮之首”的美誉。谷子脱壳后即为“小米”，是深受北方地区人们喜爱的食品，其籽粒富含多种对人体有益的蛋白质，脂肪及维生素。随着人们在日常饮食营养摄入多样性的需求下，谷子作为功能性食品受到人们和科学家的关注。
叶酸（Folic acid）又称蝶酰谷氨酸，是由蝶呤、对氨基苯甲酸和谷氨酸残基组成的一种重要的水溶性B族维生素（B9）。叶酸在人类营养和健康方面具有重要的作用：①叶酸可以调节胚胎神经细胞发育防止新生婴儿患先天性神经管缺陷症；②作为精神病人的辅助治疗剂从而缓解精神分裂症；③治疗慢性萎缩性胃炎以及防治心肌损伤和心肌梗塞等疾病。由于人类不能自身合成叶酸, 叶酸的补充主要来源于食物摄取。而主粮作物中叶酸的含量通常较低, 如玉米中平均含量约为0.19 μg/g，水稻约为0.09 μg/g，小麦约为0.26 μg/g而小米中含有丰富叶酸，是主粮作物的5～25倍（平均1.6 μg/g）。因此获得小米中总叶酸及各叶酸衍生物含量的稳定可靠数据，进而对小米品质进行深入研究，对高品质小米产品开发利用都具有较高的理论和实践价值。
发明内容
为解决现有技术存在的技术问题，本发明提供了一种谷子籽粒叶酸提取方法及叶酸含量的测定方法，其操作简单，利用三酶法提取和高校液相色谱法测定，获得谷子籽粒中叶酸的含量。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为一种谷子籽粒叶酸提取方法，按照以下步骤进行操作，以下步骤均在弱光条件下进行，
a、将脱壳后的小米放在60℃烘箱中烘干水分，用研磨机研磨成粉末，并过100目筛子备用；
b、配置终浓度为0.05mol/L的叶酸提取液；
c、称取0.3g小米粉，分别放置于2mL EP离心管中，然后分别再加入1000μL的叶酸提取液，形成匀浆液；
d、在上述匀浆液中加入20μL α-淀粉酶，振荡混匀后，室温下静置40min；
e、向离心管中再加入150μL蛋白酶，振荡混匀后，37℃恒温培养箱孵育1h；
f、取出后，水浴煮沸10min，然后再冰浴迅速冷却10min，再于14000rpm，4℃离心20min；
g、吸取上清，并加入大鼠血清，振荡混匀后，37℃恒温培养箱培养2h；
h、取出后，重复步骤f；
i、吸取上清至300μL内插管中，并装于棕色进样瓶中。
优选的，所述步骤b中叶酸提取液用磷酸二氢钠与磷酸氢二钠配置，并加入1%的抗坏血酸钠盐及0.1% β-巯基乙醇，pH值为6.5。
优选的，所述步骤g中加入的大鼠血清占体积分数的2%。
优选的，所述步骤a中选择谷子品种‘大白谷’，该品种为山西省主栽品种。
一种谷子籽粒中叶酸含量的测定方法，包括利用上述方法提取的叶酸，按照以下步骤进行，精确称取0.01 g叶酸标准品，用0.05mol/L 磷酸缓冲液溶解定容至5mL，得到浓度为2mg/mL的叶酸标准品母液，准确吸取0.5 μL母液定容至1 mL，即为1μg/mL浓度的叶酸标准液；分别吸取叶酸标准液0.5、1、2.5、5、10、25 μL定容至1 mL，即叶酸标准液分别为1、2、5、10、20、50μg/mL；经0.45 μm滤膜过滤后放于棕色进样瓶中，4 ℃避光放置备用；然后再以高效液相色谱法测定叶酸标准曲线；
其中，液相色谱条件为：色谱柱：Thermo-C18 4.6×250mm×5μm;流动相：磷酸盐缓冲液-乙腈；流速1ml/min；进样量20μL；检测波长280nm；柱温30℃；叶酸保留时间为3.9 min；以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制叶酸标准曲线；线性回归方程为：y=0.7677x-0.0397，绝对系数R2=0.9999；
梯度洗脱条件为：0min-3min 2%乙腈+98%磷酸盐缓冲液；3min-5min由原始比例线性变化到30%乙腈+70%磷酸盐缓冲液，变得到该比例后维持3min; 在8min-10min流动项比例线性变回原始的浓度比例；
最后根据峰面积及线性回归方程，计算测试样品中叶酸含量。
与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：本发明操作简单，利用三酶法提取和高校液相色谱法测定，获得谷子籽粒中叶酸的含量，经过提取和测定方法的优化，已有稳定的提取和测定条件，可直接在生产上利用，降低了检测难度，成本低，见效快。
附图说明
图1为本发明中谷子样品的HPLC检测图。
图2为本发明中叶酸标准品的HPLC检测图。
图3为本发明中叶酸测定标准曲线。
具体实施方式
为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例一谷子籽粒叶酸的提取
一种谷子籽粒叶酸提取方法，按照以下步骤进行操作，以下步骤均在弱光条件下进行，
a、选择谷子品种‘大白谷’，该品种为山西省主栽品种，生产性状较好，将脱壳后的小米放在60℃烘箱中烘干水分，并用研磨机研磨成粉末，并过100目筛子备用；
b、配置终浓度为0.05mol/L的叶酸提取液，叶酸提取液用磷酸二氢钠与磷酸氢二钠配置，并加入1%的抗坏血酸钠盐及0.1% β-巯基乙醇，pH值为6.5；
c、称取0.3g小米粉，分别放置于2mL EP离心管中，然后分别再加入1000μL的叶酸提取液，形成匀浆液；
d、在上述匀浆液中加入20μL α-淀粉酶，振荡混匀后，室温下静置40min；
e、向离心管中再加入150μL蛋白酶，振荡混匀后，37℃恒温培养箱孵育1h；
f、取出后，水浴煮沸10min，然后冰浴迅速冷却10min，再于14000rpm，4℃离心20min；
g、吸取上清，并加入大鼠血清，加入的大鼠血清占体积分数的2%，振荡混匀后，以37℃的温度恒温培养箱培养2h；
h、取出后，重复步骤f；
i、吸取上清至300μL内插管中，并装于棕色进样瓶中，直接上样测定叶酸含量或冻存于-80℃。
实施例二谷子籽粒中叶酸含量的测定
在利用上述方法提取到叶酸后，按照以下步骤进行，精确称取0.01 g叶酸标准品，用0.05mol/L 磷酸缓冲液溶解定容至5mL，得到浓度为2mg/mL的叶酸标准品母液，准确吸取0.5 μL母液定容至1 mL，即为1μg/mL浓度的叶酸标准液；分别吸取叶酸标准液0.5、1、2.5、5、10、25 μL定容至1 mL，即叶酸标准液分别为1、2、5、10、20、50μg/mL；经0.45 μm滤膜过滤后放于棕色进样瓶中，4 ℃避光放置备用；然后再以高效液相色谱法测定叶酸标准曲线；
其中，液相色谱条件为：色谱柱：Thermo-C18 4.6×250mm×5μm;流动相：磷酸盐缓冲液-乙腈；流速1ml/min；进样量20μL；检测波长280nm；柱温30℃；标准品检测色谱图见图2，叶酸保留时间为3.9 min；以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制叶酸标准曲线，见图3；线性回归方程为：y=0.7677x-0.0397，绝对系数R2=0.9999；
梯度洗脱条件为：0min-3min 2%乙腈+98%磷酸盐缓冲液；3min-5min由原始比例线性变化到30%乙腈+70%磷酸盐缓冲液，变得到该比例后维持3min; 在8min-10min流动项比例线性变回原始的浓度比例；
最后根据峰面积及线性回归方程，计算测试样品中叶酸含量。
实施例三
利用本方法进行种实验，对不同来源地、不同品种谷子、多地种植后，利用本发明方法进行叶酸的提取与叶酸含量测定，如下表。
表一对不同来源地不同品种谷子多地种植后叶酸测定值
| 品种 | 来源地 | 2016TG-SA（μg/g） | 2017TG-SA（μg/g） | 2018TG-SA（μg/g） | 2018JC-SA（μg/g） |
| 晋谷21 | 山西 | 1.46 | 2.01 | 2.69 | 2.53 |
| 晋谷54 | 山西 | 0.95 | 1.92 | 1.62 | 1.49 |
| 昭和糯 | 日本 | 1.40 | 1.66 | 1.26 | 1.18 |
| Ise-455 | 美国 | 1.57 | 1.54 | 1.28 | 1.15 |
| 金德 | 美国 | 1.50 | 1.26 | 1.46 | 1.45 |
| 小红谷 | 青海 | 1.47 | 0.93 | 1.49 | 1.29 |
| 刀把齐 | 陕西省 | 1.42 | 1.51 | 1.26 | 1.18 |
| 公矮2号 | 吉林省 | 1.35 | 1.54 | 1.50 | 1.62 |
| 汾选3号 | 山西 | 0.66 | 1.40 | 0.80 | 0.73 |
| 长谷1号 | 山西 | 0.77 | 1.30 | 1.27 | 1.42 |
其中，2016TG-SA（μg/g）：表示2016年种植于晋中太谷地区谷子叶酸含量的测定值；2017TG-SA（μg/g）：表示2017年种植于晋中太谷地区谷子叶酸含量的测定值；2018TG-SA（μg/g）：表示2018年种植于晋中太谷地区谷子叶酸含量的测定值；2018JC-SA（μg/g）：表示2018年种植于晋城地区谷子叶酸含量的测定值；
通过上述表格能够得出，通过多年对不同来源地不同品种谷子多地种植后叶酸测定值，可以反映除气候、地理因素外，本发明的方法能够进行稳定的叶酸提取与叶酸含量测定，可直接在生产上利用，降低了检测难度，成本低，见效快。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包在本发明范围内。
Claims (5)
1.一种谷子籽粒叶酸提取方法，其特征在于：按照以下步骤进行操作，以下步骤均在弱光条件下进行，
a、将脱壳后的小米放在60℃烘箱中烘干水分，并用研磨机研磨成粉末，并过100目筛子备用；
b、配置终浓度为0.05mol/L的叶酸提取液；
c、称取0.3g小米粉，分别放置于2mL EP离心管中，然后分别再加入1000μL的叶酸提取液，形成匀浆液；
d、在上述匀浆液中加入20μL α-淀粉酶，振荡混匀后，室温下静置40min；
e、向离心管中再加入150μL蛋白酶，振荡混匀后，37℃恒温培养箱孵育1h；
f、取出后，水浴煮沸10min，然后冰浴迅速冷却10min，再于14000rpm，4℃离心20min；
g、吸取上清，并加入大鼠血清，振荡混匀后，37℃恒温培养箱培养2h；
h、取出后，重复步骤f；
i、吸取上清至300μL内插管中，并装于棕色进样瓶中。
2.根据权利要求1所述的一种谷子籽粒叶酸提取方法，其特征在于：所述步骤b中叶酸提取液用磷酸二氢钠与磷酸氢二钠配置，并加入1%的抗坏血酸钠盐及0.1% β-巯基乙醇，pH值为6.5。
3.根据权利要求1所述的一种谷子籽粒叶酸提取方法，其特征在于：所述步骤g中加入的大鼠血清占体积分数的2%。
4.根据权利要求1所述的一种谷子籽粒叶酸提取方法，其特征在于：所述步骤a中选择谷子品种‘大白谷’，该品种为山西省主栽品种。
5.一种谷子籽粒中叶酸含量的测定方法，包括利用上述方法提取的叶酸，其特征在于：按照以下步骤进行，精确称取0.01 g叶酸标准品，用0.05mol/L 磷酸缓冲液溶解定容至5mL，得到浓度为2mg/mL的叶酸标准品母液，准确吸取0.5 μL母液定容至1 mL，即为1μg/mL浓度的叶酸标准液；分别吸取叶酸标准液0.5、1、2.5、5、10、25 μL定容至1 mL，即叶酸标准液分别为1、2、5、10、20、50μg/mL；经0.45 μm滤膜过滤后放于棕色进样瓶中，4 ℃避光放置备用；然后再以高效液相色谱法测定叶酸标准曲线；
其中，液相色谱条件为：色谱柱：Thermo-C18 4.6×250mm×5μm;流动相：磷酸盐缓冲液-乙腈；流速1ml/min；进样量20μL；检测波长280nm；柱温30℃；叶酸保留时间为3.9 min；以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制叶酸标准曲线；线性回归方程为：y=0.7677x-0.0397，绝对系数R2=0.9999；
梯度洗脱条件为：0min-3min 2%乙腈+98%磷酸盐缓冲液；3min-5min由原始比例线性变化到30%乙腈+70%磷酸盐缓冲液，变得到该比例后维持3min; 在8min-10min流动项比例线性变回原始的浓度比例；
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