CN108344815A - 一种碱基类物质的分离方法及其应用 - Google Patents

一种碱基类物质的分离方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种碱基类物质的分离方法及其应用。本发明采用高效液相色谱法对碱基类物质进行分离，所述的高效液相色谱法中的色谱柱为三键键合的酰胺基键合相的氨基色谱柱；所述的高效液相色谱法中的流动相为含盐水溶液和极性有机溶剂；所述的碱基类物质为腺嘌呤、次黄嘌呤和鸟嘌呤。该分离方法操作简单，可以将三种碱基类物质完全分离，峰形好，且不受其他有机杂质干扰，灵敏度高、简单快速。

Description

一种碱基类物质的分离方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种碱基类物质的分离方法及其应用。
背景技术
近20年来，随着生物技术的进步，核酸系列产品，包括核苷酸、核苷及其衍生物得到广泛使用。其中核苷类化合物在抗病毒、抗肿瘤方面，展示了不可取代的独特作用。美国FDA批准的抗艾滋病药物中大都是核苷类衍生物。核苷类药物有望成为继磺胺药和抗生素之后的新一代具有重要作用的药物。
对于一类新的药物，对其代谢产物的研究与监控显得尤其重要，尤其核苷类药物的代谢产物为内源性物质。腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶是核糖核酸(RNA)代谢的最终产物。腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶是脱氧核糖核酸(DNA)代谢的最终产物，次黄嘌呤是RNA代谢的中间产物。
目前，测定核苷及其碱基主要采用高效液相色谱法，但是存在以下问题：由于该类成分极性大，一般色谱柱很难达到较好的保留，出峰时间过早，受杂质峰干扰较大，分离效果差，尤其是对于成分复杂的中药和成方制剂，为了达到分离效果，常采用高水相的流动相，或者是含有离子对试剂为流动相，长期使用容易造成色谱柱柱效下降、寿命缩短。
因而，在不损耗色谱柱的情况下，如何快速有效地对核苷的代谢产物进行分离，是本领域亟待解决的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是现有的分离纯化碱基类物质的方法复杂，存在复杂样品难以达到有效分离、色谱条件苛刻、长期使用对色谱柱损伤大、峰形差、灵敏度低、重复性差等问题，从而提供了一种碱基类物质的分离方法及其应用。该分离方法操作简单，可以将多种碱基类物质完全分离，峰形好，且不受其他有机杂质干扰，灵敏度高、简单快速。
本发明提供了一种碱基类物质的分离方法，其包含以下步骤：采用高效液相色谱法对碱基类物质进行分离，即可；
所述的高效液相色谱法中的色谱柱为三键键合的酰胺基键合相的氨基色谱柱，例如XBridge Amide柱；
所述的高效液相色谱法中的流动相为含盐水溶液和极性有机溶剂；
所述的碱基类物质为腺嘌呤、次黄嘌呤和鸟嘌呤。
本发明中，所述含盐水溶液中盐的种类可为本领域中流动相常规所用的种类，例如甲酸铵和/或乙酸铵。
本发明中，所述含盐水溶液中还可含有甲酸。所述甲酸的浓度可为本领域常规的浓度，例如0.1％，所述百分比是指体积百分比。
本发明中，所述含盐水溶液中盐的浓度可为本领域常规的浓度，例如10mmol/L。
本发明中，所述含盐水溶液可为含有5mmol/L的甲酸铵、5mmol/L的乙酸铵和0.1％的甲酸的水溶液，所述百分比是指体积百分比。
本发明中，所述极性有机溶剂中还可含有0.1％甲酸，所述百分比是指体积百分比。
本发明中，所述极性有机溶剂可根据三键键合的酰胺基键合相的氨基色谱柱的性能进行常规选择，例如乙腈。
本发明中，所述的高效液相色谱法可采用梯度洗脱，所述梯度洗脱时所述含盐水溶液和所述极性有机溶剂的体积比可为8:92～50:50。
本发明中，所述梯度洗脱中，所述流动相比例随时间的变化范围可如表1所示：
表1
本领域技术人员均知，所述梯度洗脱中，不同时间段内，所述流动相呈线性变化。
本发明中，所述腺嘌呤、次黄嘌呤和鸟嘌呤的样品一般以溶液形式存在。所述溶液中的溶剂可选自水溶液、或、乙腈与水的混合溶液。
本发明中，所述流动相的流速可为本领域HPLC检测分析时的常规流速，例如0.3～1.5mL/min，再例如0.4mL/min。
本发明中，所述高效液相色谱法的进样量可为本领域HPLC检测分析的常规进样量，例如1μL～5μL，再例如2μL。
本发明中，所述色谱柱的填料颗粒度可为本领域常规的颗粒度，例如1.7μm～5μm，又例如3.5μm。所述色谱柱的长度可为本领域常规的长度，例如50mm～250mm，又例如100mm。
本发明中，所述色谱柱的柱温可为本领域常规的柱温，例如25～40℃，又例如35℃。
本发明中，所述高效液相色谱法中的高效液相色谱仪可采用本领域的常规高效液相色谱仪，例如Thermo scientific DionexUltiMate 3000液相色谱仪。
本发明还提供了一种所述分离方法在碱基类物质的分析检测中的应用，其包含以下步骤：将所述高效液相色谱法中的高效液相色谱仪与检测器联用，对碱基类物质进行分析检测，即可；所述碱基类物质为腺嘌呤、次黄嘌呤和鸟嘌呤。
所述应用中，所述检测器可为质谱检测器。
所述质谱检测器可为四极杆-静电场轨道阱-线性离子阱三合一组合型高分辨质谱仪，例如Thermo Scientific的Orbitrap Fusion Lumos质谱仪。
所述质谱检测器中的离子源可采用ESI离子源。
本发明还提供了一种所述分离方法在碱基类物质含量测定中的应用，所述碱基类物质为腺嘌呤、次黄嘌呤和鸟嘌呤。
所述碱基类物质含量测定的方法可为本领域常规的含量测试方法。
所述碱基类物质的待测物可为可能含有腺嘌呤、次黄嘌呤和鸟嘌呤的介质，例如瓜蒌皮注射液。所述瓜蒌皮注射液为上海上药第一生化药业有限公司生产。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
(1)本发明提供的分离方法操作简单，可以将腺嘌呤、次黄嘌呤、鸟嘌呤完全分离，峰形好，且不受其他有机杂质干扰，灵敏度高、简单快速。
(2)本发明提供的分离方法除了可以对腺嘌呤、次黄嘌呤、鸟嘌呤进行分离之外，其还可用于腺嘌呤、次黄嘌呤、鸟嘌呤的分析检测，还可以进一步用于腺嘌呤、次黄嘌呤、鸟嘌呤的含量测定。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1
1、供试品的制备
取腺嘌呤、次黄嘌呤、鸟嘌呤各对照品适量，精密称定，加水制成浓度为1mg/ml的储备液，分别精密吸取各对照品储备液适量于同一量瓶中，加水稀释定容至刻度，得浓度为1μg/ml的混合溶液，用乙腈稀释一倍即得碱基类物质混合对照品溶液，
2、色谱条件和方法
液相色谱仪：Thermo-Fisher UltiMate 3000 series高效液相色谱仪
色谱柱：ACQUITYXBridge Amide(100mm×2.1mm，3.5μm)
流动相：以乙腈(含0.1％甲酸)和水(含5mM甲酸铵，5mM乙酸铵，0.1％甲酸)分别为流动相A和B。
梯度洗脱：
表1
柱温：35℃；
流速：0.4mL/min；
进样量：2μL；
检测条件：
质谱仪：四极杆-静电场轨道阱-线性离子阱三合一组合式高分辨质谱仪(UHPLC-Orbitrap Fusion Lumos HRMS)
电喷雾离子源(ESI)正离子模式检测，喷雾电压3.8KV，离子源温度350℃，鞘气流速35Arb，辅助气流速10Arb，毛细管温度350℃。采用FT采集一级质谱数据，质量范围m/z70～700，分辨率120K，auto gain control(AGC)为100 000，采用高能诱导裂解(HCD)方式裂解，归一化碰撞能量30％，采用FT采集二级质谱数据，分辨率30K，采用“Top Speed”算法进行数据依赖扫描，离子强度高于2.5e4一级离子进行二级碎裂，动态排除时间为6s。
数据采集和处理使用Xcalibur 4.0软件。
3.检测结果
腺嘌呤的保留时间为3.512min，次黄嘌呤的保留时间为4.631min，鸟嘌呤的保留时间为5.413min。分离度大于1.5，峰形良好，不拖尾，不前伸。
实施例2
1、供试品的制备
取瓜蒌皮注射液(上海上药第一生化药业有限公司生产)1ml，加水稀释至50ml，混匀，用乙腈稀释一倍，即得。
2、色谱条件和方法
同实施例1。
3.检测结果
腺嘌呤的保留时间为3.512min，次黄嘌呤的保留时间为4.631min，鸟嘌呤的保留时间为5.413min。分离度大于1.5，峰形良好，不拖尾，不前伸。
对比例1
与实施例1不同的是，将色谱柱替换为普通C18柱(Agilent poroshell 120 SB-C18 2.7μm，3.0×75mm)，流动相：以乙腈(含0.1％甲酸)和水(含5mM甲酸铵，5mM乙酸铵，0.1％甲酸)分别为流动相A和B。同时采用以下梯度洗脱方式：
表2
其他操作均参考实施例1中的操作方式，腺嘌呤、次黄嘌呤和鸟嘌呤得不到基线分离，且在色谱柱上保留较差，保留时间均在1分钟以内。
对比例2
与实施例2不同的是，将流动相B替换为含0.1％甲酸的水溶液，同时采用以下梯度洗脱方式：
表3
其他操作均参考实施例2中的操作方式，腺嘌呤、次黄嘌呤和鸟嘌呤得不到基线分离。
对比例3
1、供试品的制备
同实施例2。
2、色谱条件和方法
液相色谱仪：Waters Acquity Ultra-Performance LC-Synapt G2quadrupoletime-of-flight(Q/TOF)液质联用仪(美国Waters公司)；
色谱柱：Waters Acquity UPLC HSS T3色谱柱(2.1mm×100mm，1.8μm)，配有预柱WatersAcquity HSS T3VanGuard(2.1mm×5mm，1.8μm)；
流动相：以水(A)和乙腈(B)为流动相
梯度洗脱：
表4
时间(min) 流动相B(％，v/v)
0～2 5
2～12 5～40
12～18 40～90
18～21 90～5
21～25 5
柱温：45℃；
流速：0.3ml/min；
进样量：5μl；
质谱条件：采用电喷雾离子源(ESI)，正、负离子两种模式测定，各参数分别为：毛细管电压-2.5kV(ESI-)，+3kV(ESI+)；锥孔电压-25V(ESI-)，+30V(ESI+)；离子源温度120℃；脱溶剂气温度350℃；锥孔气流量50L/h；脱溶剂气(N2)流速600L/h；氩气作为碰撞气体；质量数检测范围50～1500Da，低碰撞能量通道：4eV；高碰撞能量通道：10～30eV能量梯度。
3、检测结果
碱基类物质中黄嘌呤的保留时间为1.22min，腺嘌呤的保留时间为1.55min，未分离得到鸟嘌呤。

Claims (10)

1.一种碱基类物质的分离方法，其特征在于，其包含以下步骤：采用高效液相色谱法对碱基类物质进行分离，即可；
所述的高效液相色谱法中的色谱柱为三键键合的酰胺基键合相的氨基色谱柱；
所述的高效液相色谱法中的流动相为含盐水溶液和极性有机溶剂；
所述的碱基类物质为腺嘌呤、次黄嘌呤和鸟嘌呤。
2.如权利要求1所述的碱基类物质的分离方法，其特征在于，所述的三键键合的酰胺基键合相的氨基色谱柱为XBridge Amide柱；
所述的含盐水溶液中盐的种类为甲酸铵和/或乙酸铵；
和/或，所述的含盐水溶液中盐的浓度为10mmol/L。
3.如权利要求1所述的碱基类物质的分离方法，其特征在于，所述的含盐水溶液和/或所述的极性有机溶剂中含有甲酸，所述甲酸的浓度优选为0.1％，百分比是指体积百分比。
4.如权利要求1所述的碱基类物质的分离方法，其特征在于，所述腺嘌呤、次黄嘌呤和鸟嘌呤以溶液形式存在，所述溶液中的溶剂为水溶液、或、乙腈与水的混合溶液；
所述含盐水溶液为含有5mmol/L的甲酸铵、5mmol/L的乙酸铵和0.1％的甲酸的水溶液，所述百分比是指体积百分比；
和/或，所述的极性有机溶剂为乙腈。
5.如权利要求1所述的碱基类物质的分离方法，其特征在于，所述的高效液相色谱法采用梯度洗脱，所述梯度洗脱时所述的含盐水溶液和所述的极性有机溶剂的体积比为8:92～50:50。
6.如权利要求1所述的碱基类物质的分离方法，其特征在于，所述的流动相的流速为0.3～1.5mL/min，优选为0.4mL/min；
和/或，所述高效液相色谱法的进样量为1μL～5μL，优选为2μL；
和/或，所述的色谱柱的填料颗粒度为1.7μm～5μm，优选为3.5μm；
和/或，所述的色谱柱的长度为50mm～250mm，优选为100mm；
和/或，所述的色谱柱的柱温为25～40℃，优选为35℃；
和/或，所述高效液相色谱法中的高效液相色谱仪为Thermo scientificDionexUltiMate 3000液相色谱仪。
7.一种如权利要求1～6任一项所述的碱基类物质的分离方法在碱基类物质分析检测中的应用，其特征在于，其包含以下步骤：将所述高效液相色谱法中的高效液相色谱仪与检测器联用，对碱基类物质进行分析检测，即可；所述碱基类物质为腺嘌呤、次黄嘌呤和鸟嘌呤。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述检测器为质谱检测器，优选为三合一组合型高分辨质谱仪，更优选为Thermo Scientific的Orbitrap Fusion Lumos质谱仪。
9.一种如权利要求1～6任一项所述的碱基类物质的分离方法在碱基类物质含量测定中的应用，所述碱基类物质为腺嘌呤、次黄嘌呤和鸟嘌呤。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述碱基类物质的待测物为瓜蒌皮注射液。
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