KR102033005B1 - 수소/중수소 교환 질량 분석법 - Google Patents

수소/중수소 교환 질량 분석법 Download PDF

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Abstract

수소/중수소 교환 질량 분석법은 기체 크로마토그래피에 시료를 제공하여, 각각이 기체상인 복수의 분석 물질들을 분리하는 단계, 상기 분석 물질들에 중수화 용매를 분무하여, 상기 기체상 물질들의 수소들과 상기 중수화 용매의 중수소를 교환하는 단계, 및 질량 분석기로 상기 수소들 및 상기 중수소의 교환을 분석하는 단계를 포함한다.

Description

수소/중수소 교환 질량 분석법{THE MASS SPECTROMETRY OF HYDROGEN/DEUTERIUM EXCHANGE}
본 발명은 수소/중수소 교환 질량 분석법에 관한 것이다.
수소/중수소 교환 질량 분석 기술은 약물의 대사체, 불순물 등과 같은 다양한 물질들의 구조를 동정하기 위해 사용하는 방법 중의 하나로, 물질의 구조 중 아민기(-NH, -NH2), 하이드록시기 (-OH), 띠올기 (-SH), 카복실기 (-COOH)등 작용기에 포함된 수소 (hydrogen)를 중수소 (Deuterium)로 교환 시켜 질량 스펙트럼의 변화를 해석함으로써 구조를 확인하는 기술이다.
인용 문헌 1에서는 액체 크로마토그래피, 전기 분무 이온화 및 질량 분석기 (Liquid chromatography-electrospray ionization, and mass spectrometer, LC-ESI/MS)를 이용하여 중수화 용매에 분석 물질을 녹여 직접 주입 (infusion) 하는 방식, 이동 상을 중수화 용매로 사용(on-column)하는 방식, 크로마토그래피 분리 이후 중수화 용매를 첨가(post-column)하는 방식 등이 기재되어 있다.
다만, 직접 주입의 경우 시료로부터 타겟 물질만 추출 및 정제화 하는 과정이 필수적이고, 이동상을 중수화 용매로 사용할 경우 비싼 중수화 용매가 과량으로 필요하며 물과 중수의 극성 차이에 의한 머무름 시간의 변화 등에 대한 문제가 발생된다. 또한 크로마토그래피 이후에 중수화 용매를 첨가하는 방식은 이동상으로 사용하는 수용액이 같이 이온 소스에 도입되어 역교환 (back exchange)에 의해 저하된 수소/중수소의 교환 효율이 나타날 수 있는 문제 등이 있다.
인용 문헌 2에는 이중 스프레이어 (dual sprayer)를 이용하여 대기압 이온 소스 (atmosphere ion source)에서 수소/중수소가 교환되는 방법이 기재되어 있으나, 상기 방법은 교환 효율을 높이기 위해 중수화 용매의 높은 유속을 사용함으로써 여전히 과량의 중수화 용매를 필요로 한다.
인용 문헌 3에는 구리판 위에 중수화 용매를 올려놓고 가열하여 대기압 이온 소스를 중수화 용매가 포화된 상태로 만들어 수소/중수소를 교환하는 방법이 기재되어 있다. 이 방법은 중수화 용매를 수백 마이크로리터를 사용하였으나, 시료를 크로마토그래피에 통과시키지 않고, 분당 1μL로 주입하여, 실제 시료의 분석에는 적용되기 어렵다.
따라서 중수화 용매의 사용은 최소화하면서 실제 시료의 적용을 위한 크로마토그래피가 결합된 새로운 수소/중수소 교환 질량 분석법의 개발이 요구되고 있다.
인용 문헌 1: Liu, D. Q.; Wu, L.; Sun, M.; MacGregor, P. A. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 44 (2007) 320-329. 인용 문헌 2: Wolff, J. C.; Laures, A. M. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2006, 20, 3769-3779. 인용 문헌 3: Kostyukevich, Y.; Kononikhin, A.; Popov, I.; Nikolaev, E. Anal. Chem. 2013, 85, 5330-5334.
본 발명의 목적은 최소한의 중수화 용매를 사용하면서, 시료 내 복수의 물질들을 동시에 분석할 수 있는 수소/중수소 교환 질량 분석법을 제공하고자 한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 수소/중수소 교환 질량 분석법은 기체 크로마토그래피에 시료를 제공하여, 각각이 기체상인 복수의 분석 물질들을 분리하는 단계, 상기 분석 물질들에 중수화 용매를 분무하여, 상기 기체상 물질들의 수소들과 상기 중수화 용매의 중수소를 교환하는 단계, 및 질량 분석기로 상기 수소들 및 상기 중수소의 교환을 분석하는 단계를 포함한다.
상기 기체상 물질들의 수소들과 상기 중수화 용매의 상기 중수소의 교환 반응은 단일 단계에서 수행되는 것일 수 있다.
상기 교환하는 단계에서, 상기 중수화 용매는 2 내지 10 ㎕/min의 유속으로 분무되는 것일 수 있다.
상기 교환하는 단계에서, 상기 중수화 용매는 중수 및 아세토나이트릴의 혼합물, 또는 중수화된 메탄올 (CH3OD)을 포함하고, 상기 중수화 용매는 초산 (acetic acid) 또는 포름산 (formic acid)를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 수소/중수소 교환 질량 분석법은 이동관을 통해, 상기 분석 물질들을 전기 분무 이온화 소스로 이동시키는 단계를 더 포함한다.
상기 이동관의 온도는 250 내지 320℃이고, 상기 이동관에 0.8 내지 1.8 mL/min의 유속으로 캐리어 가스가 제공되는 것일 수 있다.
상기 분리하는 단계에서, 상기 시료는 이소메텝텐 (isometheptene), 프로필헥세드린(propylhexedrine), 메톡시펜아민 (methoxyphenamine), 메틸에페드린(methylephedrine), 메페노렉스 (mefenorex), 펜캄파민(fencamfamine), 사이클아조돈 (cyclazodone), 펜플루라민 (fenfluramine), 클로벤조렉스 (clobenzorex), 및 펜에틸린 (fenetylline) 중 적어도 두개를 포함하는 것일 수 있다.
상기 분석하는 단계는 2.1 내지 2.5 kV의 이온 스프레이 전압(ion spray voltage), 및 200 내지 250℃의 모세관 온도 (capillary temperature)를 제공하여, 양이온 모드로 수행되는 것일 수 있다.
상기 분석하는 단계는 0 초과 2 arb (arbitrary) 이하의 시스 가스(sheath gas)를 더 제공하여 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 수소/중수소 교환 질량 분석법은 최소한의 중수화 용매를 사용하면서, 시료 내 복수의 물질들을 동시에 분석할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 수소/중수소 교환 질량 분석법을 개략적으로 나타낸 순서도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 수소/중수소 교환 질량 분석법을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 3은 이온 스프레이 전압과 시스 가스에 따른 프로필헥세드린의 수소/중수소 교환 이온들의 상대적인 높이를 나타낸다.
도 4는 스프레이 용매를 중수와 물을 사용하여 얻어진 크로마토그램을 나타낸다.
도 5는 실시예에 사용된 시료들의 수소/중수소 교환 후에 얻어진 스펙트럼을 나타낸다.
도 6은 펜에틸린의 수소 및 중수소의 비교환, 부분 교환, 및 전체 교환된 이온의 조각 이온 스캔 모드로 분석하여 얻어진 MS/MS 스펙트럼을 나타낸다.
이상의 본 발명의 목적들, 다른 목적들, 특징들 및 이점들은 첨부된 도면과 관련된 이하의 바람직한 실시예들을 통해서 쉽게 이해될 것이다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 실시예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 통상의 기술자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다.
각 도면을 설명하면서 유사한 참조부호를 유사한 구성요소에 대해 사용하였다. 첨부된 도면에 있어서, 구조물들의 치수는 본 발명의 명확성을 위하여 실제보다 확대하여 도시한 것이다. 제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다.
본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 층, 막, 영역, 판 등의 부분이 다른 부분 "상에" 있다고 할 경우, 이는 다른 부분 "바로 위에" 있는 경우뿐만 아니라 그 중간에 또 다른 부분이 있는 경우도 포함한다. 반대로 층, 막, 영역, 판 등의 부분이 다른 부분 "하부에" 있다고 할 경우, 이는 다른 부분 "바로 아래에" 있는 경우뿐만 아니라 그 중간에 또 다른 부분이 있는 경우도 포함한다.
달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 성분, 반응 조건, 폴리머 조성물 및 배합물의 양을 표현하는 모든 숫자, 값 및/또는 표현은, 이러한 숫자들이 본질적으로 다른 것들 중에서 이러한 값을 얻는 데 발생하는 측정의 다양한 불확실성이 반영된 근사치들이므로, 모든 경우 "약"이라는 용어에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 기재에서 수치범위가 개시되는 경우, 이러한 범위는 연속적이며, 달리 지적되지 않는 한 이러한 범 위의 최소값으로부터 최대값이 포함된 상기 최대값까지의 모든 값을 포함한다. 더 나아가, 이러한 범위가 정수를 지칭하는 경우, 달리 지적되지 않는 한 최소값으로부터 최대값이 포함된 상기 최대값까지를 포함하는 모든 정수가 포함된다.
본 명세서에 있어서, 범위가 변수에 대해 기재되는 경우, 상기 변수는 상기 범위의 기재된 종료점들을 포함하는 기재된 범위 내의 모든 값들을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들면, "5 내지 10"의 범위는 5, 6, 7, 8, 9, 및 10의 값들뿐만 아니라 6 내지 10, 7 내지 10, 6 내지 9, 7 내지 9 등의 임의의 하위 범위를 포함하고, 5.5, 6.5, 7.5, 5.5 내지 8.5 및 6.5 내지 9 등과 같은 기재된 범위의 범주에 타당한 정수들 사이의 임의의 값도 포함하는 것으로 이해될 것이다. 또한 예를 들면, "10% 내지 30%"의 범위는 10%, 11%, 12%, 13% 등의 값들과 30%까지를 포함하는 모든 정수들뿐만 아니라 10% 내지 15%, 12% 내지 18%, 20% 내지 30% 등의 임의의 하위 범위를 포함하고, 10.5%, 15.5%, 25.5% 등과 같이 기재된 범위의 범주 내의 타당한 정수들 사이의 임의의 값도 포함하는 것으로 이해될 것이다.
이하에서는 본 발명의 일 실시예에 따른 수소/중수소 교환 질량 분석법에 대하여 설명한다.
본 발명에서 "수소/중수소 교환"이란 수소가 중수소로 치환되는 것을 의미하는 것일 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 수소/중수소 교환 질량 분석법을 개략적으로 나타낸 순서도이다. 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 수소/중수소 교환 질량 분석법을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 1 및 도 2를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 수소/중수소 교환 질량 분석법은 기체 크로마토그래피에 시료를 제공하여, 각각이 기체상인 복수의 분석 물질들을 분리하는 단계(S100), 기체상 분석 물질들에 중수화 용매를 분무하여, 기체상 물질들의 수소들과 중수화 용매의 중수소를 교환하는 단계(S200), 및 질량 분석기로 수소/중수소의 교환을 분석하는 단계(S300)를 포함한다.
기체 크로마토그래피에 시료를 제공하여, 각각이 기체상인 복수의 분석 물질들을 분리한다(S100).
분리하는 단계(S100)에서, 시료들은 2차 아민기 또는 하이드록시기를 갖는 흥분제류이며 모두 질소를 포함하는 구조일 수 있다. 시료들은 예를 들어, 이소메텝텐 (isometheptene), 프로필헥세드린(propylhexedrine), 메톡시펜아민 (methoxyphenamine), 메틸에페드린(methylephedrine), 메페노렉스 (mefenorex), 펜캄파민(fencamfamine), 사이클아조돈 (cyclazodone), 펜플루라민 (fenfluramine), 클로벤조렉스 (clobenzorex), 및 펜에틸린 (fenetylline) 중 적어도 두개를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 수소/중수소 교환 질량 분석법은 이동관을 통해, 기체상 분석 물질들을 전기 분무 이온화 소스로 이동시키는 단계를 더 포함한다. 예를 들어, 분리하는 단계(S100)에서 분리된 분석 물질들은 이동관을 통해 전기 분무 이온화 소스로 이동한다. 예를 들어, 분리하는 단계(S100)에서 분리된 분석 물질들은 컬럼 이동관(column transferline)을 통해 전기 분무 이온화 소스의 주입구로 이동한다.
이동관의 온도는 250 내지 320 ?이고, 이동관에 0.8 내지 1.8 mL/min의 유속으로 캐리어 가스가 제공되는 것일 수 있다. 상기 범위 미만이면, 분석물질들이 크로마토그래피의 피크 넓힘 현상이 발생하거나 이동관에 흡착되어 피크가 검출되지 않을 수 있다. 또한 상기 범위 초과이면, 크로마토그래피 분리능이 저하되거나 이동관에 결함이 발생 할 수 있다.
기체상 분석 물질들에 중수화 용매를 분무하여, 기체상 물질들의 수소들과 중수화 용매의 중수소를 교환한다(S200). 기체상 물질들의 수소들과 중수화 용매의 중수소의 교환 반응은 단일 단계에서, 보다 구체적으로 교환하는 단계(S200)에서 수행되는 것일 수 있다.
교환하는 단계(S200)는 대기압 이온 소스(atmosphere ion source)에서 수행되는 것일 수 있다.
교환하는 단계(S200)에서, 중수화 용매는 2 내지 10㎕/min의 유속으로 분무되는 것일 수 있다. 예를 들어 중수화 용매는 2 내지 10㎕/min의 유속으로 분석 시간 동안 분무되는 것일 수 있다. 상기 범위 미만이면, 중수화 용매가 적어 수소/중수소의 교환 반응이 충분히 일어나지 않을 수 있고, 또한 분무가 불안정하게 일어날 수 있다. 상기 범위 초과이면, 중수화 용매 대비 교환 반응의 효율이 떨어지고, 이온들의 감도가 떨어질 수 있다.
예를 들어, 교환하는 단계(S200)에서,20 분의 분석 시간 동안 40 내지 200 ㎕의 중수화 용매를 제공하는 것일 수 있다. 상기 범위 미만이면, 중수화 용매가 적어 수소/중수소의 교환 반응이 충분히 일어나지 않을 수 있고, 또한 분무가 불안정하게 일어날 수 있다. 상기 범위 초과이면, 중수화 용매 대비 교환 반응의 효율이 떨어지고, 이온들의 감도가 떨어질 수 있다.
교환하는 단계(S200)에서, 중수화 용매는 예를 들어, 중수 및 아세토나이트릴의 혼합물, 또는 중수화된 메탄올 (CH3OD)을 포함하고, 중수화 용매는 초산 (acetic acid) 또는 포름산 (formic acid)을 더 포함하는 것일 수 있다.
예를 들어, 중수화 용매가 중수 (Deuterium oxide, D2O) 및 아세토나이트릴(acetonitrile)의 혼합물일 때, 중수는 중수: 아세토나이트릴의 부피비 9:1 내지 1:9로 혼합된 것일 수 있다. 상기 범위 미만이면, 실린지 펌프의 압력이 증가하여 분무가 불안정하게 일어날 수 있고, 상기 범위 초과이면, 이온화 소스로 유입되는 중수의 양이 적어 교환 반응의 효율이 저하될 수 있다. 또한, 초산(acetic acid) 또는 포름산(formic acid)은 중수를 기준으로 0.1 중량% 포함되는 것일 수 있다. 상기 범위 미만이면, 수소/중수소 교환 반응의 효율이 저하될 수 있으며, 상기 범위 초과이면, 질량분석기의 오염문제가 발생 될 수 있다.
질량 분석기로 수소/중수소의 교환을 분석한다(S300). 분석하는 단계(S300)는 예를 들어, 고분해능 질량 분석기 (High resolution mass spectrometry) 또는 사중극자텐덤질량 분석기(Triple-quadrupole mass spectrometry)로 수행되는 것일 수 있다.
분석하는 단계(S300)는 2.1 내지 2.5 kV의 이온 스프레이 전압(ion spray voltage), 및 200 내지 250℃의 모세관 온도 (capillary temperature)를 제공하여, 양이온 모드로 수행되는 것일 수 있다. 상기 범위 미만이면, 용매가 분무 되지 않는 문제가 발생 할 수 있으며, 상기 범위 초과이면, 수소/중수소 교환반응의 효율이 저하되거나 분석 물질이 이온화 소스 내 깨짐(fragmentation)이 발생 할 수 있다.
분석하는 단계(S300)는 시스 가스(sheath gas) 없이 수행될 수도 있고, 0 초과 2 arb (arbitrary) 이하의 시스 가스를 더 제공하여, 수행되는 것일 수 있다. 2 arb (arbitrary) 초과의 시스 가스가 제공되면, 2 arb 초과의 시스 가스가 제공되면, 이온화의 저하로 피크 감도가 낮아질 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 수소/중수소 교환 질량 분석법은 최소한의 중수화 용매를 사용하면서, 시료 내 복수의 물질들을 동시에 분석할 수 있다.
이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시에 불과하며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 기체 크로마토그래피, 전기 분무 이온화, 및 질량 분석기
기체 크로마토그래피는 Agilent 사의 6890N (Palo Alto, CA)기기를 사용하였다. 컬럼은 DB-EUPAH (20m x 0.180mm I.D., 0.14 ㎛ film thickness, J&W Scientific, Rancho Corodova, CA, USA)를 사용하였고, 비분할모드에서 시료들을 1㎕ 주입하였다. 기체 크로마토그래피와 이온 소스를 연결한 컬럼 이동관 (column transferline)과 주입구의 온도는 280℃로 유지하였다. 컬럼 오븐 온도는 60℃에서 2분간 유지하다 분당 15℃로 280℃까지 증가시킨 후, 280℃에서 3분간 유지하였다. 캐리어 가스는 헬륨 (99.9999 %)을 유속 1.5 mL/min로 일정 압력 (constant pressure) 조건을 사용하였다.
질량 분석기는 Thermo사의 LTQ Orbitrap (San Jose, CA, USA) 기기를 사용하였다. 질량 분석기는 양이온 모드에서 스프레이 전압(Spray voltage)이 2.1 kV, 모세관 온도가 200℃, 튜브렌즈 (Tube lens) 100 V의 조건으로 풀스캔 모드 (Full scan mode) 및 조각 이온 스캔모드 (Product ion scan mode)를 사용하였다.
전기 분무 이온화의 스프레이 용매는 실린지 펌프 (Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA)를 사용하여 분당 2 ㎕로 0.1 중량%의 포름산을 포함하는 중수과 아세토닐니트릴을 1:1의 부피비로 하여 이온 소스에 주입하였다.
2. 흥분제류의 분석
수소/중수소 교환을 위해 이소메텝텐 (isometheptene), 프로필헥세드린(propylhexedrine), 메톡시펜아민 (methoxyphenamine), 메틸에페드린(methylephedrine), 메페노렉스 (mefenorex), 펜캄파민(fencamfamine), 사이클아조돈 (cyclazodone), 펜플루라민 (fenfluramine), 클로벤조렉스 (clobenzorex), 및 펜에틸린 (fenetylline) 각각을 10 μg/mL의 농도로 에틸아세테이트(ethyl acetate)에 제조하였다.
3. 분석 결과
기체상 수소/중수소 교환에 대한 이온화 조건은 프로필헥세드린을 사용하여 최적화하였다. 프로필헥세드린 (분자량 155)은 한 개의 2차 아민기 (-NH)을 가지고 있으므로 최종적으로 프로톤 (proton, H+) 이온을 포함하여 두 개의 수소가 교환될 수 있다. 기체 크로마토그래피기, 전기 분무 이온화기, 및 질량 분석기를 사용한 수소/중수소 교환 반응에 의해 프로필헥세드린의 스펙트럼은 비교환 (m/z 156), 부분 교환 (m/z 157), 및 전체 교환된 이온 (m/z 158)의 세 개의 피크들로 검출되었다.
기체 크로마토그래피기, 전기 분무 이온화기, 및 질량 분석기에 의한 수소/중수소 교환 조건을 최적화하기 위해 이온 스프레이 전압을 2.1 내지 4 kV의 범위 내에서 수소/중수소 교환 효율을 확인한 결과, 2.1 kV 에서 전체 교환된 이온 (m/z 158) 의 상대적 높이가 가장 높게 나타났다. 2.1 kV 미만의 전압을 사용할 경우 스프레이 용매가 불안정하게 분무되어 모든 이온이 생성되지 않았다. 또한 시스 가스는 0, 2, 및 5 arb (arbitrary) 각각에 대하여 교환 효율을 실험한 결과 시스 가스를 사용하지 않았을 때 전체 교환된 이온의 상대적인 감도가 가장 높게 나타났다. 스프레이 전압과 시스 가스에 대한 세 이온 (m/z 156, 157, 158) 들의 상대적인 높이는 도 3에 나타내었다. 스프레이 용매로서 0.1 중량% 포름산을 포함한 중수 및 아세토니트릴의 혼합 용액을 2 내지 10 ㎕/min의 유속을 사용하여 수소/중수소 교환 결과를 확인한 결과 유속이 높을수록 교환 정도는 크게 차이가 없었으나 이온들의 전체적인 감도가 하락하였다. 또한 2 ㎕/min 미만의 유속을 사용할 경우 불안정하게 분무되었다.
최적화된 기체 크로마토그래피, 전기 분무 이온화기, 및 질량 분석기를 이용한 수소/중수소 교환 방법은 시료들로 아민기 또는 하이드록시기를 포함한 10개의 흥분제류 (stimulants)를 준비하여 실시하였다. 10개 흥분제류의 구조, 분자량 및 머루름 시간은 하기 표 1에 나타내었다. 스프레이 용매로 0.1 중량% 포름산을 포함한 중수 및 아세토니트릴을 1:1로 부피비로 혼합한 혼합 용액 사용하여 얻어진 10개 물질의 전체 크로마토그래피는 도 4에 나타내었다. 도 4에서 보는 것과 같이 스프레이 용매로 물 (H2O)과 중㎕수 (D2O)을 사용하였을 때 물질의 머무름 시간에는 차이는 없다.
Figure 112017109242066-pat00001
(실험에 사용된 물질들 (흥분제류)의 구조, 분자량, 머무름 시간 및 수소/중수소 교환 후 얻어진 이온들의 상대적 감도)
기체 크로마토그래피, 전기 분무 이온화기, 및 질량 분석기를 이용한 수소/중수소 교환 후 얻어진 스펙트럼은 도 5에 나타내었다. 흥분제류의 수소/중수소 교환 스펙트럼에서 비교환 ([MH +H]+), 부분 교환 ([MH +D]+ 또는 [MD+H]+), 및 전체 교환된 이온 ([MD+D]+)들이 검출되었다. 검출된 이온들 중 가장 큰 이온을 기준으로 나타낸 상대적 감도에 대하여 자연적으로 존재하는 동위원소의 비를 고려하여 보정된 결과는 상기 표 1에 나타내었다. 구조에서 염소 (Cl)를 포함하는 메페노렉스와 클로벤조렉스는 첫 번째, 두 번째 동위원소를 모두 고려하였고, 이를 제외한 8개의 흥분제류에 대해서는 첫 번째 동위원소의 비율만 고려하였다. 보정에 사용된 동위원소의 비율은 상기 표 1에 나타내었다. 에타미반의 경우는 전체 교환된 이온의 보정된 상대적 감도는 5 % 미만으로서 10개 흥분제류는 전체 수소/중수소 교환이 일어났다. 낮은 교환 효율을 나타낸 메틸에페드린은 기체 상태의 분석물질에 의한 교환 때문이 아니라 물질의 특이적 성질에 의한 것임을 직접주입분석법과 비교함으로써 확인하였다.
수소/중수소 교환된 이온의 조각 이온 스캔 (MS/MS) 분석은 중수소를 포함한 조각에서 질량 차이가 나기 때문에 물질의 구조 해석에 더욱 많은 정보를 제공하였다. 펜에틸린에 대하여 기체 크로마토그래피기, 전기 분무 이온화기, 및 질량 분석기를 이용한 수소/중수소 교환 의해 생성된 비교환, 부분교환, 및 전체 교환된 이온들의 조각 이온 스캔 분석을 수행하였다. 세 이온에 대한 조각 이온 스캔 스펙트럼은 도 6에 나타내었다. 도 6에서 보는 것처럼 펜에틸린은 두 가지의 과정으로 조각 이온들이 형성될 수 있다. 도 6에서 비교환 즉 양성자화된 펜에딜린의 조각 이온 스캔 스펙트럼을 보면, 양성자화된 질소와 옆의 탄소 사이의 불균일 분해(heterolytic cleavage)에 의해 양이온 (m/z 119)과 중성 분자 (223 Da)가 만들어 질 수 있으며, 또한 수소의 재배열 (hydrogen rearrangement) 과정에 의해 양이온 (m/z 224)와 중성 분자 (118 Da)가 생성 되었다. 더욱이 m/z 224 조각 이온으로부터 NH3의 손실로 인해 m/z 207 조각 이온이 생성되었다. 이차 아민 (-NH)을 포함한 m/z 224조각 이온이 전체 수소/중수소 교환된 이온의 조각 이온 스캔 스펙트럼에서 중수소의 질량만큼 증가된 m/z 226으로 나타났고, 부분 교환된 이온의 조각 이온 스캔 스펙트럼에서는 m/z 225를 나타내었다. 조각 이온 m/z 224 외에 다른 조각 이온들은 질량의 변화가 없음으로써 제안된 두 가지 조각 이온 형성 과정이 입증되었다.
이상, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징으로 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예는 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (8)

  1. 기체 크로마토그래피에 시료를 제공하여, 각각이 기체상인 복수의 분석 물질들을 분리하는 단계;
    상기 분석 물질들에 중수화 용매를 분무하여, 상기 기체상 물질들의 수소들과 상기 중수화 용매의 중수소를 교환하는 단계; 및
    질량 분석기로 상기 수소들 및 상기 중수소의 교환을 분석하는 단계;를 포함하고,
    상기 중수화 용매는 2 내지 10 ㎕/min의 유속으로 분무되고,
    상기 분석하는 단계는 2.1 내지 2.5 kV의 이온 스프레이 전압(ion spray voltage), 및 200 내지 250 ℃의 모세관 온도 (capillary temperature)를 제공하여, 양이온 모드로 수행되고,
    0 초과 2 arb (arbitrary) 이하의 시스 가스(sheath gas)를 더 제공하여 수행되는 수소/중수소 교환 질량 분석법.
  2. 제1 항에 있어서,
    상기 기체상 물질들의 수소들과 상기 중수화 용매의 상기 중수소의 교환 반응은 단일 단계에서 수행되는 것인 수소/중수소 교환 질량 분석법.
  3. 삭제
  4. 제1 항에 있어서,
    상기 교환하는 단계에서,
    상기 중수화 용매는
    중수 및 아세토나이트릴의 혼합물, 또는 중수화된 메탄올 (CH3OD)을 포함하고,
    상기 중수화 용매는
    초산 (acetic acid) 또는 포름산 (formic acid)를 더 포함하는 것인 수소/중수소 교환 질량 분석법.
  5. 제1 항에 있어서,
    이동관을 통해, 상기 분석 물질들을 전기 분무 이온화 소스로 이동시키는 단계를 더 포함하고,
    상기 이동관의 온도는 250 내지 320 ℃이고,
    상기 이동관에 0.8 내지 1.8 mL/min의 유속으로 캐리어 가스가 제공되는 것인 수소/중수소 교환 질량 분석법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 분리하는 단계에서,
    상기 시료는 이소메텝텐 (isometheptene), 프로필헥세드린(propylhexedrine), 메톡시펜아민 (methoxyphenamine), 메틸에페드린(methylephedrine), 메페노렉스 (mefenorex), 펜캄파민(fencamfamine), 사이클아조돈 (cyclazodone), 펜플루라민 (fenfluramine), 클로벤조렉스 (clobenzorex), 및 펜에틸린 (fenetylline) 중 적어도 두개를 포함하는 것인 수소/중수소 교환 질량 분석법.
  7. 삭제
  8. 삭제
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