CN103304613A

CN103304613A - 一种从瓜蒌皮中分离纯化4种核苷类化学成分的方法

Info

Publication number: CN103304613A
Application number: CN2013102403498A
Authority: CN
Inventors: 李爱峰; 孙爱玲; 柳仁民
Original assignee: Liaocheng University
Current assignee: Shanghai No.1 Biochemical & Pharmaceutical Co., Ltd.; Liaocheng University; Shandong University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2013-06-18
Filing date: 2013-06-18
Publication date: 2013-09-18
Anticipated expiration: 2033-06-18
Also published as: CN103304613B

Abstract

本发明涉及一种从中药瓜蒌皮中分离纯化4种核苷类化学成分（腺嘌呤、鸟嘌呤核苷、6-异次黄嘌呤核苷及腺嘌呤核苷）的方法，是以瓜蒌皮为原料，经过下述步骤：（1）瓜蒌皮粗提物的制备；（2）大孔吸附树脂柱粗分离；（3）半制备型高效液相色谱分离纯化，将所得样品分别用半制备型高效液相色谱进行分离纯化，流动相为甲醇-水，得到高纯度的腺嘌呤、鸟嘌呤核苷、6-异次黄嘌呤核苷及腺嘌呤核苷4种单体化合物。本工艺过程绿色环保，对环境无严重危害，综合成本低。

Description

一种从瓜蒌皮中分离纯化4种核苷类化学成分的方法

技术领域

本发明属于化工领域，具体是涉及一种从中药瓜蒌皮中分离纯化4种核苷类化学成分（腺嘌呤、鸟嘌呤核苷、6-异次黄嘌呤核苷及腺嘌呤核苷）的方法。

背景技术

瓜蒌皮为葫芦科栝楼属植物栝楼（Trichosanthes kirilowii Marim.）或双边栝楼（Trichosanthes rosthornii Harms.）的干燥成熟果皮，属于常用中药，具有润肺化痰、利气宽胸等功效，临床上广泛用于治疗痰热咳嗽、痰浊黄稠、咽痛、胸痛、吐血、衄血、便秘、痈疮肿毒等症。现代药理实验及临床实践表明瓜蒌皮具有扩张冠状动脉、增加冠脉血流量、提高心肌耐缺氧能力、降低血清胆固醇、抗菌、抗癌等多种药理作用，尤其是对心血管疾病具有很好的治疗作用。

核苷类成分是生物细胞维持生命的重要物质，参与DNA代谢过程，具有基因治疗、改善脑细胞代谢、免疫调节、改善微循环、调节中枢神经系统、抗病毒、抗癌等多种药理作用。重点核苷类成分已作为药品、保健品和食品添加剂服务于人类健康。腺苷是广泛存在于一些滋补药品如冬虫夏草、灵芝、贝母等中的重要成分，药用作用显著，具有抗凝血、扩张冠状动脉、松弛支气管平滑肌、镇静中枢神经、抗心律不齐、镇痛、抗炎等作用。

现已有文献报道从瓜蒌皮中提取纯化核苷类化学成分的方法。滕勇荣[瓜蒌皮和瓜蒌皮注射液化学成分研究，山东中医药大学硕士学位论文，2011年]利用反复硅胶柱层析、大孔吸附树脂柱色谱及制备型高效液相色谱等分离手段对瓜蒌皮的化学成分进行了研究，共得到7个化合物，其中包括3个核苷类成分（腺嘌呤、鸟嘌呤核苷及6-异次黄嘌呤核苷）。时岩鹏[栝楼化学成分的研究及其α-菠菜甾醇的含量测定（I），中草药，2002年1期]利用反复硅胶柱层析对栝楼的化学成分进行了研究，自石油醚部位、氯仿部位、正丁醇部位分离得到12个化合物，其中10个得到了鉴定，包括1种核苷类成分—尿嘧啶。刘岱琳[瓜蒌的抗血小板聚集活性成分研究. 中草药，2004年12期]利用抗血小板聚集的活性追踪方法，采用Sephadex LH-20柱色谱及反复硅胶柱色谱分离，自瓜蒌中分离得到7个化合物，其中包括1种核苷类成分—腺嘌呤核苷。

上述方法主要存在的问题是：分离过程步骤较为繁琐，有时需要使用氯仿为萃取剂或洗脱剂，对人体和环境均有严重危害，而且得到的核苷类物质的种类少，生产周期较长，生产成本较高。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种操作简便、绿色环保、综合成本低、生产周期短的快速从中药瓜蒌皮中分离纯化核苷类化学成分的方法。

本发明的方案如下：

从中药瓜蒌皮中分离纯化核苷类化学成分的方法，步骤为：

（1）瓜蒌皮粗提物的制备：取粉碎好的瓜蒌皮药材，用水加热回流提取，提取液经减压浓缩至相对密度为1.2左右，向浓缩液中加入95%乙醇至乙醇的浓度达70%左右，静置72 h，过滤，取上层清液，减压浓缩得粗提物；

（2）大孔吸附树脂柱粗分离：将瓜蒌皮粗提物溶于水中，上HPD826型大孔吸附树脂柱进行层析，先用水进行洗脱，再用浓度为10%左右的乙醇-水溶液进行洗脱，最后用浓度为30%左右的乙醇-水溶液进行洗脱，分别收集10%及30%左右的乙醇-水洗脱液，前者减压浓缩，得样品1，后者减压浓缩，得样品2；

（3）样品1的进一步分离纯化：将样品1用半制备型高效液相色谱进行分离纯化，色谱柱为YMC ODS-AQ柱，流动相为甲醇-水，检测波长为254 nm；

（4）样品2的进一步分离纯化：将样品2用半制备型高效液相色谱进行分离纯化，色谱柱为YMC ODS-AQ柱，流动相为甲醇-水，检测波长为254 nm；

收集目标组分馏分，将得到的馏分减压浓缩，即得到所要分离的单体化合物。

前面所述的方法，优选的方案是，步骤（1）加热回流提取时提取时间为1-3小时，更优选提取时间为1.5-2.5小时（优选2小时）。

前面所述的方法，优选的方案是，步骤（1）提取次数为2-6次，更优选提取次数为3-5次（优选4次）。

前面所述的方法，优选的方案是，步骤（3）流动相为3%-7%的甲醇-水洗脱液，优先选用洗脱方式为7%甲醇-水等度洗脱/5%甲醇-水等度洗脱/3%甲醇-水等度洗脱/甲醇-水梯度洗脱，控制洗脱液流速为2.5-4.5 mL/min（优选3.5 mL/min）。

前面所述的方法，优选的方案是，步骤（4）分离纯化时的洗脱方式为8%甲醇-水等度洗脱/6%甲醇-水等度洗脱/4%甲醇-水等度洗脱/甲醇-水梯度洗脱，控制洗脱液流速为2.5-4.5 mL/min（优选3.5 mL/min）。

本发明提供的是从中药瓜蒌皮中分离纯化核苷类化学成分的方法,步骤为：（1）瓜蒌皮粗提物的制备：取粉碎好的瓜蒌皮药材，用水加热回流提取，提取液经减压浓缩至相对密度为1.2左右，向浓缩液中加入95%乙醇至乙醇的浓度达70%左右，静置72 h，过滤，取上层清液，减压浓缩得粗提物。（2）大孔吸附树脂柱粗分离：将瓜蒌皮粗提物溶于水中，上HPD826型大孔吸附树脂柱进行层析，先用水进行洗脱，再用浓度为10%左右的乙醇-水溶液进行洗脱，最后用浓度为30%左右的乙醇-水溶液进行洗脱，分别收集10%及30%左右的乙醇-水洗脱液，前者减压浓缩，得样品1，后者减压浓缩，得样品2。（3）样品1的进一步分离纯化：将样品1用半制备型高效液相色谱进行分离纯化，色谱柱为YMC ODS-AQ柱（250 mm×10 mm I. D., 10 μm，大连江申分离科技有限公司），流动相为甲醇-水，检测波长为254 nm。（4）样品2的进一步分离纯化：将样品2用半制备型高效液相色谱进行分离纯化，色谱柱为YMC ODS-AQ柱（250 mm×10 mm I. D., 10 μm，大连江申分离科技有限公司），流动相为甲醇-水，检测波长为254 nm。

本发明涉及一种从中药瓜蒌皮中分离纯化4种核苷类化学成分（腺嘌呤、鸟嘌呤核苷、6-异次黄嘌呤核苷及腺嘌呤核苷）的方法，是以瓜蒌皮为原料，经过下述步骤：（1）瓜蒌皮粗提物的制备：取粉碎好的瓜蒌皮药材，用水加热回流提取，提取液经减压浓缩至相对密度为1.2左右，向浓缩液中加入95%乙醇至乙醇的浓度达70%左右，静置72 h，过滤，取上层清液，减压浓缩得粗提物。（2）大孔吸附树脂柱粗分离：将瓜蒌皮粗提物溶于水中，上HPD826型大孔吸附树脂柱进行层析，先用水进行洗脱，再用浓度为10%左右的乙醇-水溶液进行洗脱，最后用浓度为30%左右的乙醇-水溶液进行洗脱，分别收集10%及30%左右的乙醇-水洗脱液，前者减压浓缩，得样品1，后者减压浓缩，得样品2。（3）半制备型高效液相色谱分离纯化：将样品1和样品2分别用半制备型高效液相色谱进行分离纯化，流动相为甲醇-水，得到高纯度的腺嘌呤、鸟嘌呤核苷、6-异次黄嘌呤核苷及腺嘌呤核苷4种单体化合物。工艺过程绿色环保，对环境无严重危害，综合成本低。

本发明从中药瓜蒌皮中分离纯化4种核苷类化合物的方法，首先采用大孔吸附树脂柱粗分离，再用半制备型高效液相色谱法进行分离纯化，所得目标化合物纯度高，杂质含量极低，这一点可从图5-图8中看出。除此之外，还具有如下优势：

（1）提取物经过大孔吸附树脂柱粗分离后可以除去大部分的杂质，使混合物的组成得到简化，可以为后续的分离工作降低难度，并且可以保护半制备型高效液相色谱柱不被污染，有效地延长了色谱柱的使用寿命。

（2）使用半制备型高效液相色谱法两次分离纯化就可以同时得到腺嘌呤、鸟嘌呤核苷、6-异次黄嘌呤核苷和腺嘌呤核苷4种高纯度单体化合物，方法操作简单，效率高，工艺周期短，洗脱剂也可以回收后重复使用，节省试剂，降低了生产成本。

（3）纯化过程中不使用对环境和人体危害大的氯仿等有机溶剂，大孔吸附树脂经再生后可以重复使用多次，绿色环保。

（4）优化了层析方法的条件（洗脱液的组成和流速），使化合物的纯度和效率都大为提高。

附图说明

图1是样品1的高效液相色谱图。

图2是样品2的高效液相色谱图。

图3是样品1的半制备型高效液相色谱图。

图4是样品2的半制备型高效液相色谱图

图5是腺嘌呤的高效液相色谱图及紫外光谱图。

图6是鸟嘌呤核苷的高效液相色谱图及紫外光谱图。

图7是6-异次黄嘌呤核苷的高效液相色谱图及紫外光谱图。

图8是腺嘌呤核苷的高效液相色谱图及紫外光谱图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图详细说明本发明的技术方案，但保护范围不被此限制。实施例中所用设备或原料皆可从市场获得。所用试剂均购自济南试剂总厂，所用水为去离子水。

实施例：从中药瓜蒌皮中分离纯化核苷类化学成分的方法，其步骤为：

（1）瓜蒌皮粗提物的制备：瓜蒌皮药材经粉碎后，以水为溶剂加热回流提取4次，合并提取液，减压浓缩至相对密度为1.2左右，向浓缩液中加入95%乙醇至乙醇的浓度达70%左右，静置72 h，过滤，取上层清液，减压浓缩得粗提物。

（2）大孔吸附树脂柱粗分离：将瓜蒌皮粗提物溶于水中，上HPD826型大孔吸附树脂柱进行层析，先用水进行洗脱，再用浓度为10%左右的乙醇-水溶液进行洗脱，最后用浓度为30%左右的乙醇-水溶液进行洗脱，分别收集10%及30%左右的乙醇-水洗脱液，前者减压浓缩，得样品1，后者减压浓缩，得样品2。

（3）样品1的进一步分离纯化：将样品1用半制备型高效液相色谱进行分离纯化，色谱柱为YMC ODS-AQ柱（250 mm×10 mm I. D., 10 μm，大连江申分离科技有限公司），流动相为甲醇-水，检测波长为254 nm。

（4）样品2的进一步分离纯化：将样品2用半制备型高效液相色谱进行分离纯化，色谱柱为YMC ODS-AQ柱（250 mm×10 mm I. D., 10 μm，大连江申分离科技有限公司），流动相为甲醇-水，检测波长为254 nm。

发明人通过使用不同浓度的甲醇作流动相，采用不同的洗脱方式，控制洗脱液的流速为2.5-4.5 mL/min（优选3.5 mL/min），优选出了实现本发明目的的纯化条件，有关实验结果如下：

表一样品1的半制备型高效液相色谱分离条件

	洗脱液条件
		实施例1	7%甲醇-水等度洗脱
实施例2	5%甲醇-水等度洗脱
		实施例3	3%甲醇-水等度洗脱
实施例4	甲醇-水梯度洗脱

在实施例1中，采用7%甲醇-水为洗脱液等度洗脱，各成分洗脱时间较短，但相互之间分离效果不够理想，所得成分纯度较低。实施例2中采用5%甲醇-水为洗脱液等度洗脱，各成分之间分离良好，分离时间也较为适宜。实施例3中采用3%甲醇-水为洗脱液等度洗脱，各成分分离良好，但分离时间太长。实施例4采用甲醇-水梯度洗脱，各成分分离良好，分离时间也可以，但洗脱液由于浓度变化导致回收再利用存在较大困难。

图3是当选用实施例2体系时的色谱图，由图3可见，各成分分离良好，分离时间也较为适宜。根据色谱图收集各峰组分，回收溶剂后，即可得到相应高纯度化合物。经高效液相色谱面积归一化法分析测试，实施例2所得到的各个组分的纯度很高，均在98%以上，这一点可从图5-图6中看出。

表二样品2的半制备型高效液相色谱分离条件

（洗脱液流速为2.5-4.5 mL/min（优选3.5 mL/min））

	洗脱液条件
		实施例5	8%甲醇-水等度洗脱
实施例6	6%甲醇-水等度洗脱
		实施例7	4%甲醇-水等度洗脱
实施例8	甲醇-水梯度洗脱

在实施例5中，采用8%甲醇-水为洗脱液等度洗脱，各成分洗脱时间较短，但相互之间分离效果不够理想，所得成分纯度较低。实施例6中采用6%甲醇-水为洗脱液等度洗脱，各成分之间分离良好，分离时间也较为适宜。实施例7中采用4%甲醇-水为洗脱液等度洗脱，各成分分离良好，但分离时间太长。实施例8采用甲醇-水梯度洗脱，各成分分离良好，分离时间也可以，但洗脱液由于浓度变化导致回收再利用存在较大困难。

图4是当选用实施例6体系时的色谱图，由图4可见，各成分分离良好，分离时间也较为适宜。根据色谱图收集各峰组分，回收溶剂后，即可得到相应高纯度化合物。经高效液相色谱面积归一化法分析测试，实施例6所得到的各个组分的纯度很高，均在98%以上，这一点可从图7-图8中看出。

根据核磁共振氢谱和碳谱的测试，对所得峰组分进行鉴定，得到了腺嘌呤、鸟嘌呤核苷、6-异次黄嘌呤核苷和腺嘌呤核苷。4种化合物的鉴定结果如下：

化合物I（腺嘌呤）：¹H-NMR（400 MHz，DMSO-d₆）δ ppm：12.83（1H，br s，9-H），8.11（2H，d，2-H，8-H），7.09（2H，s，6-NH₂）。¹³C-NMR（100 MHz，DMSO-d₆）δ ppm：155.6（C-6），152.3（C-2），150.4（C-4），139.2（C-8），118.6（C-5）。

化合物II（鸟嘌呤核苷）：¹H-NMR（400 MHz，DMSO-d₆）δppm：10.63（1H，s，1-H），7.93（1H，s，8-H），6.45（2H，s，2-NH₂），5.70（1H，d，J=6.0 Hz，1′-H），5.38（1H，d，J=6.0 Hz，2′-OH），5.11（1H，d，J=4.4 Hz，3′-OH），5.02（1H，m，5′-OH），4.40（1H，d，J=5.6 Hz，H-2′），4.09（1H，d，J=4.0 Hz，H-3′），3.87（1H，d，J=3.6 Hz，H-4′），3.61（1H，m，H-5′a），3.53（1H，m，H-5′b）。¹³C-NMR（100 MHz，DMSO-d₆）δppm：156.6（C-6），153.6（C-2），151.2（C-4），135.5（C-8），116.7（C-5），86.3（C-1′），85.1（C-4′），73.6（C-2′），70.3（C-3′），61.3（C-5′）。

化合物III（6-异次黄嘌呤核苷）：¹H-NMR（400 MHz，DMSO-d₆）δ ppm：8.35（1H，s，3-H），8.14（1H，s，8-H），7.33（1H，s，6-H），5.88（1H，d，J=6.0 Hz，1′-H），5.42（2H，s，2′-OH，3′-OH），5.18（1H，d，5′-OH），4.61（1H，t，3′-H），4.14（1H，t，4′-H），3.96（1H，dd，2′-H)，3.67（1H，d，5′a-H），3.55（1H，d，5′b-H）。¹³C-NMR（100 MHz，DMSO-d₆）δ ppm：156.0（C-2），152.2（C-4），149.0（C-6），139.7（C-8），119.2（C-5），87.8（C-1′），85.8（C-4′），73.4（C-3′），70.5（C-2′），61.6（C-5′）。

化合物IV（腺嘌呤核苷）：¹H-NMR（400 MHz，DMSO-d₆）δ ppm：8.37（1H，s，2-H），8.23（1H，s，8-H），5.98（1H，d，J=6.4 Hz，1′-H），4.70（1H，t，J=5.6 Hz，2′-H），4.31（1H，m，3′-H），4.19（1H，m，4′-H），3.84（1H，m，5′a-H），3.80（1H，m，5′b-H）。¹³C-NMR（100 MHz，DMSO-d₆）δppm：156.8（C-6），153.8（C-2），149.9（C-4），141.9（C-8），120.2（C-5），89.5（C-1′），87.2（C-4′），74.9（C-2′），71.8（C-3′），62.8（C-5′）。

经现代波谱数据证实所提取纯化得到的4种核苷类物质的化学结构式如下：

Figure 2013102403498100002DEST_PATH_IMAGE001

Figure 2013102403498100002DEST_PATH_IMAGE003

Figure 2013102403498100002DEST_PATH_IMAGE004

应当指出的是，具体实施方式只是本发明比较有代表性的例子，显然本发明的技术方案不限于上述实施例。还可以有很多变形。本领域的普通技术人员，从此文件中所公开提到或是联想到的，均应认为是本专利所要保护的范围。

Claims

1.从中药瓜蒌皮中分离纯化核苷类化学成分的方法，其特征是，步骤为：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤（1）加热回流提取时提取时间为1-3小时。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征是，步骤（1）提取时间为1.5-2.5小时（优选2小时）。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤（1）提取次数为2-6次。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤（1）提取次数为3-5次（优选4次）。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤（3）流动相为3%-7%的甲醇-水溶液。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征是，洗脱方式为7%甲醇-水等度洗脱/5%甲醇-水等度洗脱/3%甲醇-水等度洗脱/甲醇-水梯度洗脱。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征是，洗脱液流速为2.5-4.5 mL/min（优选3.5 mL/min）。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤（4）分离纯化时的洗脱方式为8%甲醇-水等度洗脱/6%甲醇-水等度洗脱/4%甲醇-水等度洗脱/甲醇-水梯度洗脱。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征是，洗脱液流速为2.5-4.5 mL/min（优选3.5 mL/min）。