CN114636761A - 检测药物对核酸代谢产物的吸附效率的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测药物对核酸代谢产物的吸附效率的方法。该方法包括：将含有核酸代谢产物的缓冲液与药物进行混合，得到供试品溶液；对所述供试品溶液进行高效液相色谱检测，并基于检测结果确定所述药物对核酸代谢产物吸附效率，其中，所述核酸代谢产物包括选自下列至少之一：尿酸、腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、肌苷和5‑腺苷单磷酸；所述高效液相色谱检测采用的流动相包括缓冲液和/或有机溶剂，所述缓冲液的pH值为3.6～4.0。

Description

检测药物对核酸代谢产物的吸附效率的方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地，涉及检测药物对核酸代谢产物的吸附效率的方法及其应用，更具体地，涉及检测药物对核酸代谢产物的吸附效率的方法和筛选药物的方法。
背景技术
《2019年中国高尿酸血症与痛风诊疗指南》指出高尿酸血症是嘌呤代谢紊乱引起的代谢异常综合征。高尿酸血症(HUA)是指在正常嘌呤饮食状态下，非同日两次空腹血尿酸水平男性高于420μmol/L，女性高于360μmol/L，即称为高尿酸血症。血尿酸超过其在血液或组织液中的饱和度可在关节局部形成尿酸晶体并沉积，诱发局部炎症反应和组织破坏，即痛风；可在肾脏沉积引发急性肾病、慢性间质性肾炎或肾结石，称之为尿酸性肾病。许多证据表明，高尿酸血症和痛风是慢性肾病、高血压、心脑血管疾病及糖尿病等疾病的独立危险因素，是过早死亡的独立预测因子。目前，中国大陆高尿酸血症的患病率13.3％，患病人数已经超过1.2亿；中国大陆痛风的患病率为1.1％，患病人数已经超过1700万。高尿酸血症与痛风存在多种危害，其中痛风石是痛风致死、致残的重要原因，此外关节畸形，痛风性肾病、心脑血管疾病等都不容忽视。
尿酸是人体内嘌呤核苷酸的分解代谢产物，嘌呤核苷酸80％由细胞代谢产生，20％源于饮食，尿酸主要来源于自身合成，来自食物的很少，嘌呤的合成主要在含有黄嘌呤氧化酶的肝脏和小肠组织中进行，食物中的核酸主要以核蛋白形式存在，在胃中被胃酸分解成核酸和蛋白质，核酸进入肠道被各种酶水解，分解成碱基和戊糖,而人体细胞中的核苷酸在核苷酸酶的作用下水解成核苷，核苷经核苷磷酸化酶作用下，分解成自由的碱基和1-磷酸核糖，嘌呤碱可以进一步水解，嘌呤的分解从水解脱氨开始。腺嘌呤水解生成次黄嘌呤，鸟嘌呤水解生成黄嘌呤。脱氨反应可以在碱基、核苷或核苷酸水平上进行。次黄嘌呤氧化生成黄嘌呤，再氧化生成尿酸，人体内嘌呤碱最终水解成尿酸。
目前市场上有抑制黄嘌呤氧化酶的药物别嘌醇，来抑制尿酸合成；促进尿酸排泄药物苯溴马隆通过抑制肾小管对尿酸的重吸收，促进肾尿酸排泄。对核苷酸代谢产物吸附的高分子药物市场是欠缺的，并且检测这些药物对核苷酸代谢产物的吸附能力的方法也是欠缺的，并且准确度不高。
由此可见，开发一种能够高效、快速、准确地检测药物对多种核苷酸代谢产物的吸附度的方法很有必要，为吸附核苷酸代谢产物的高分子药物的筛选提供更便捷有效的方法。
发明内容
为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种检测药物对核酸代谢产物的吸附效率的方法，根据本发明的实施例，所述方法包括：将含有核酸代谢产物的缓冲液与药物进行混合，得到供试品溶液；对所述供试品溶液进行高效液相色谱检测，并基于检测结果确定所述药物对核酸代谢产物吸附效率，其中，所述核酸代谢产物包括选自下列至少之一：尿酸、腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、肌苷和5-腺苷单磷酸；所述高效液相色谱检测采用的流动相包括缓冲液和/或有机溶剂，所述缓冲液的pH值为3.6～4.0。
根据本发明实施例的方法基于HPLC，可以实现供试品溶液中多达8种核苷酸代谢产物达到基线分离，为准确检测吸附阴离子的高分子药物吸附尿酸、腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、肌苷和5-腺苷单磷酸的吸附度提供基础，对于大批量筛选吸附阴离子的高分子药物吸附度情况，可以提高检测效率，节省检测时间，节约检测成本。
根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述缓冲液的pH值为4.0。发明人经过大量的实验，发现当流动相缓冲液的pH为4.0时，可以进一步改善相邻色谱峰之间的分离度，尿酸、腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、肌苷和5-腺苷单磷酸8种物质的分离度良好，标准曲线相关系数r均大于0.999，并且测定的重复性高。
根据本发明的实施例，所述缓冲液选自下列至少之一：磷酸盐缓冲液、枸橼酸缓冲液、乙酸缓冲液和甲酸缓冲液，优选为磷酸盐缓冲液。根据本发明的实施例，上述四种缓冲液作为流动相A均可以使上述8种物质达到良好的分离效果，当流动相A为磷酸盐缓冲液，特别是磷酸二氢钾缓冲液时，上述8种物质的分离检测效果最好。
根据本发明的实施例，所述有机溶剂包括乙腈。根据本发明的实施例，当流动相B为乙腈时，可以有效测定供试品溶液中各物质的量，进而得到待检测药物对上述8种物质的吸附度。
根据本发明的实施例，所述高效液相色谱检测采用梯度洗脱方式，所述梯度洗脱的条件为：0－15分钟时，所述缓冲液与所述有机溶剂的体积比为100％：0％；15－20分钟时，所述缓冲液与所述有机溶剂的体积比为(95％～100％)：(0％～5％)；20－40分钟时，所述缓冲液与所述有机溶剂的体积比为95％：5％；40－41分钟时，所述缓冲液与所述有机溶剂的体积比为(95％～100％)：(0％～5％)；41－60分钟时，所述缓冲盐与所述有机溶剂的体积比为100％：0％。根据本发明的实施例，采用梯度洗脱的方式所得到的峰型最好。
根据本发明的实施例，所述梯度洗脱的条件为：0－15分钟时，所述缓冲液与所述有机溶剂的体积比为100％：0％；15－20分钟时，所述缓冲液与所述有机溶剂的体积比为100％：0％；20－40分钟时，所述缓冲液与所述有机溶剂的体积比为95％：5％；40－41分钟时，所述缓冲液与所述有机溶剂的体积比为95％：5％；41－60分钟时，所述缓冲液与所述有机溶剂的体积比为100％：0％。发明人经过大量的实验，发现采用上述梯度洗脱的方式及流动相配比，可以对上述8种物质达到最佳的分离效果和较好的峰型。
根据本发明的实施例，所述流动相的流速为0.2mL/min-1.0mL/min，优选为0.6mL/min。根据本发明实施例的方法可以提高检测灵敏度并进一步提高分离度。
根据本发明的实施例，所述含有核酸代谢产物的缓冲液中含有缓冲试剂，所述缓冲试剂包括选自下列至少之一：氢氧化钠、磷酸盐、2-(二乙醇氨基)乙磺酸(BES)、氨基丁三醇·盐酸、枸橼酸盐和碳酸盐；优选为磷酸二氢钾。根据本发明的实施例，使用上述缓冲试剂可以很好地模拟体内环境，使配制的含有核酸代谢产物的缓冲液更准确地模拟待检测药物在体内吸附核苷酸代谢产物的情况，进而使所检测的吸附度更接近待检测药物在体内的吸附度，是检测更加准确。
根据本发明的实施例，所述缓冲试剂的pH为6.0～8.0，优选为6.5～7.0。根据本发明的实施例，所述缓冲试剂更接近人体内pH，可以更准确地模拟人体内的环境，模拟待检测药物在人体中吸附核苷酸代谢产物的环境，使所检测的吸附度更接近药物在人体内的吸附度。
根据本发明的实施例，所述混合是在30℃～40℃的条件下进行30min～24h。根据本发明的实施例，在上述混合条件下配制含有核酸代谢产物的缓冲液，尿酸、腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、肌苷和5-腺苷单磷酸各物质的比例模拟体内的比例，使所检测的药物吸附度更接近体内真实值。
根据本发明的实施例，所述高效液相色谱检测采用的色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；所述色谱柱的粒径为3μm～5μm，优选为3μm；所述色谱柱长度为100mm～300mm，优选为150mm。根据本发明的实施例，采用上述色谱柱对上述8种核苷酸代谢产物的检测的分离度更高，标准曲线相关系数高。
根据本发明的实施例，所述高效液相色谱检测采用的柱温为20-40℃。根据本发明的实施例，当采用上述柱温时，分离度更高，检测准确性更好。
根据本发明的实施例，所述高效液相色谱检测采用的检测波长为220nm-300nm，优选为260nm。根据本发明的实施例，采用上述检测波长可以显著提高检测灵敏度。
根据本发明的实施例，所述吸附效率是以各核酸代谢产物结合量的形式表征，
所述各核酸代谢产物结合量由下列公式确定：
Figure BDA0002840004930000031
其中，a为线性回归方程的斜率；b为线性回归方程的截距；A供为供试品溶液的峰面积；C初为所述含有核酸代谢产物的缓冲液中各核酸代谢产物的初始浓度，单位为mg/L；V为供试品溶液稀释体积，单位为L；m为供试品的称样量，单位为g；W为供试品的干燥失重，单位为％。根据本发明的实施例，基于尿酸、腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、肌苷和5-腺苷单磷酸初始量和吸附后的量，可以得到待检测药物对上述8种物质的吸附度，即各物质的结合量。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种筛选药物的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：提供候选药物；采用本发明第一方面所提出的方法检测所述候选药物对核酸代谢产物的吸附效率，基于所得吸附效率确定所述候选药物是否为目标药物。根据本发明的实施例，该方法操作简单，准确性高，可以大批量筛选高效吸附阴离子的高分子药物，可以提高检测效率，节省检测时间，节约检测成本。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为按照实施例1条件所得样品溶液的高效液相色谱图；
图2为按照实施例2条件所得样品溶液的高效液相色谱图；
图3为按照实施例3条件所得样品溶液的高效液相色谱图；
图4为按照实施例4条件所得样品溶液的高效液相色谱图；
图5为按照对比例1条件所得样品溶液的高效液相色谱图；
图6为按照对比例2条件所得样品溶液的高效液相色谱图；
图7为按照对比例3条件所得样品溶液的高效液相色谱图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
需要注意的是，本文中所使用的核苷酸代谢产物指5-腺苷单磷酸(腺苷酸，AMP)、鸟嘌呤核苷酸(鸟苷酸，GMP)和次黄嘌呤核苷酸(肌苷酸，IMP)在人体内分解代谢过程中所产生的各中间产物及终产物，具体地，在本文中核苷酸代谢产物指5-腺苷单磷酸(腺苷酸，AMP)、鸟嘌呤核苷酸(鸟苷酸，GMP)和次黄嘌呤核苷酸(肌苷酸，IMP)，及其代谢的产物尿酸、腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷和肌苷的至少之一。
检测药物对核酸代谢产物的吸附效率的方法
在本发明的一个方面，本发明提出了一种检测药物对核酸代谢产物的吸附效率的方法，根据本发明的实施例，所述方法包括：将含有核酸代谢产物的缓冲液与药物进行混合，得到供试品溶液；对所述供试品溶液进行高效液相色谱检测，并基于检测结果确定所述药物对核酸代谢产物吸附效率，其中，所述核酸代谢产物包括选自下列至少之一：尿酸、腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、肌苷和5-腺苷单磷酸；所述高效液相色谱检测采用的流动相包括缓冲液和/或有机溶剂，所述缓冲液的pH值为3.6～4.0。根据本发明的实施例，该检测方法灵敏度高、专属性强、精密度高、准确性强、操作方便，可有效检测吸附阴离子的高分子药物吸附尿酸、腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、肌苷和5-腺苷单磷酸的量。
根据本发明的一些实施例，含有核酸代谢产物的缓冲液包括尿酸、腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、肌苷和5-腺苷单磷酸以及缓冲试剂，将上述8种核苷酸代谢产物配制成溶液，溶液pH等条件接近人体内的环境，由此模拟药物在体内吸附核苷酸代谢产物的环境。
根据本发明的一些实施例，称取待检测药品置于锥形瓶中，加入含有核酸代谢产物的缓冲液，在水浴温度37℃±5℃，磁子搅拌30min～24h结合，然后样品溶液静置，取上清液过滤，检测吸附阴离子的高分子药物吸附尿酸、腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、肌苷和5-腺苷单磷酸的量。
根据本发明的一些实施例，待检测药物与含有核酸代谢产物的缓冲液中的核苷酸代谢产物结合的环境为：水浴温度37℃±5℃，磁子搅拌30min～24h，或气浴温度37℃±5℃，100rpm～300rpm 30min～24h，或水浴摇床37℃±5℃，100rpm～300rpm。优选为水浴温度37℃±5℃，磁子搅拌30min～24h。
在本发明的一些实施例中，使用磷酸二氢钾缓冲液作为流动相A，使用乙腈作为流动相B，磷酸二氢钾缓冲液的浓度为0.01mol/L～0.10mol/L，优选为0.05mol/L。
根据本发明的一些实施例，梯度洗脱的条件为：0－15分钟时，所述磷酸二氢钾缓冲液与乙腈的体积比为100％：0％；15－20分钟时，所述磷酸二氢钾缓冲液与乙腈的体积比为100％：0％，95％：5％；20－40分钟时，所述磷酸二氢钾缓冲液与乙腈的体积比为95％：5％；40－41分钟时，所述磷酸二氢钾缓冲液与乙腈的体积比为95％：5％，100％：0％；41－60分钟时，所述磷酸二氢钾缓冲液与乙腈的体积比为100％：0％。
根据本发明的具体实施例，可以依照以下步骤实现：
(1)配制含有核酸代谢产物的缓冲液(磷酸二氢钾缓冲液pH6.8)
(2)称取样品置于锥形瓶中，加入含有核酸代谢产物的缓冲液，在水浴温度37℃±5℃，磁子搅拌30min～24h结合，然后样品溶液静置，取上清液过滤，注入高效液相色谱仪器。
(2)设置色谱柱柱温25℃-35℃，优选为30℃。流动相的流速为0.5-0.7mL/min，优选为0.6ml/min，检测波长为254nm-262nm，优选为260nm。
(3)取(2)的样品溶液进样量2μL-20μL，优选为10μL，注入高效液相色谱仪，完成测定。
基于公式：
Figure BDA0002840004930000061
完成待检测药物对核酸代谢产物的吸附效率，
其中，a为线性回归方程的斜率；b为线性回归方程的截距；A供为供试品溶液的峰面积；C初为所述含有核酸代谢产物的缓冲液中各核酸代谢产物的初始浓度，单位为mg/L；V为供试品溶液稀释体积，单位为L；m为供试品的称样量，单位为g；W为供试品的干燥失重，单位为％。
本发明的方法可准确的测量高分子药物对尿酸、腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、肌苷和5-腺苷单磷酸的吸附量，并且可将尿酸、腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、肌苷和5-腺苷单磷酸完全分离，各峰之间的分离度良好，可操作性强，分析方法专属性强、精密度高、准确性强、操作方便，可准确的进行高分子药物对尿酸、腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、肌苷和5-腺苷单磷酸的吸附量测定。
筛选药物的方法
在本发明的又一方面，本发明提出了一种筛选药物的方法。根据本发明的实施，包括：
提供候选药物；采用上述方法检测所述候选药物对核酸代谢产物的吸附效率，基于所得吸附效率确定所述候选药物是否为目标药物。本发明的方法操作简单，准确性高，可以大批量筛选高效吸附阴离子的高分子药物，可以提高检测效率，节省检测时间，节约检测成本。
下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
仪器：Agilent1260高效液相色谱仪，1260Infinity二极管阵列检测器
色谱柱：YMC-Pack ODS-AQ C18(150×4.6mm，5μm)
流动相A：0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(用磷酸或氢氧化钠试液调节pH值至4.0)
流动相B：乙腈
梯度洗脱如表1所示
表1：
时间(min) 磷酸盐缓冲液(％) 乙腈(％)
0 100 0
15 100 0
20 95 5
40 95 5
41 100 0
60 100 0
流速：0.6mL/min
检测波长：260nm
柱温：30℃
进样体积：10μL
稀释剂：磷酸二氢钾缓冲液(pH6.8)
运行时间：60分钟
实验步骤：
磷酸二氢钾缓冲液(pH6.8)：称取磷酸二氢钾13.658g，置于1000mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，磷酸或氢氧化钠试液调节pH值至6.8。
混合结合溶液配制：
分别精密称取尿酸450.34mg、腺嘌呤440.60mg、鸟嘌呤451.44mg、次黄嘌呤446.68mg、腺嘌呤核苷410.74mg、鸟嘌呤核苷455.40mg、肌苷441.00mg、5-腺苷单磷酸458.64mg，置于1000mL容量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
混合标准工作液：精密吸取混合结合溶液置于10ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，分别配制成1μg/ml，5μg/ml，10μg/ml，15μg/ml，20μg/ml，定量限为线性最低点。
样品处理：
精密称取高分子聚合物0.1g，置于锥形瓶中，加入混合结合溶液，在水浴温度37℃±5℃，磁子搅拌30min～24h结合，然后样品溶液静置，取上清液过滤，取续滤液作为样品溶液
取样品溶液，在上述色谱条件下进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见附图1。
图1中保留时间为10.912min、11.846min、12.623min、16.551min、20.968min、25.401min、25.715min、30.586min的色谱峰分别为尿酸、鸟嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤、5-腺苷单磷酸、肌苷、腺嘌呤核苷、腺嘌呤核苷的色谱峰，最小分离度是鸟嘌呤与次黄嘌呤，分离度为2.09，分离度大于1.5。
吸附效率按下式计算：
Figure BDA0002840004930000081
式中：
a为线性回归方程的斜率；
b为线性回归方程的截距；
A供为供试品溶液的峰面积；
C初为供试品溶液中混合结合溶液各物质的初始浓度，mg/L；
V为供试品溶液稀释体积，L；
m为供试品的称样量，g；
W为供试品的干燥失重，单位为％。
各种物质的线性范围、回归方程、相关系数和定量限，精密度如表2所示：
表2：8种混标的线性范围、回归方程、相关系数和定量限及精密度
Figure BDA0002840004930000082
*Y：peak area；X：mass concentration，mg/ml
重复性试验：取同一吸附阴离子的高分子药物，按样品处理方法平行制备6份样液，进样10μl进行色谱分析，根据测得吸附阴离子高分子药物吸附尿酸、腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、肌苷和5-腺苷单磷酸的量，计算RSD值，结果得出，吸附阴离子的高分子药物结合7种组分的量值为1.9％～4.9％，测定重复性良好，结果如表3所示。
表3：吸附阴离子高分子药物吸附尿酸、腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、肌苷和5-腺苷单磷酸的量的重复性
Figure BDA0002840004930000091
实施例2柱温25℃
仪器：Agilent1260高效液相色谱仪，1260Infinity二极管阵列检测器
色谱柱：YMC-Pack ODS-AQ C18(150×4.6mm，5μm)
流动相A：0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(用磷酸或氢氧化钠试液调节pH值至4.0)
流动相B：乙腈
梯度洗脱与实施例1相同
流速：0.6mL/min
检测波长：260nm
柱温：25℃
进样体积：10μL
稀释剂：磷酸二氢钾缓冲液(pH6.8)
运行时间：60分钟
实验步骤：
磷酸二氢钾缓冲液(pH6.8)：称取磷酸二氢钾13.658g，置于1000mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，磷酸或氢氧化钠试液调节pH值至6.8。
混合结合溶液配制：分别精密称取尿酸450.34mg、腺嘌呤440.60mg、鸟嘌呤451.44mg、次黄嘌呤446.68mg、腺嘌呤核苷410.74mg、鸟嘌呤核苷455.40mg、肌苷441.00mg、5-腺苷单磷酸458.64mg，置于1000mL容量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
取混合结合溶液，在上述色谱条件下进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见附图2。
图2保留时间为12.757min、13.591min、14.564min、18.430min、22.910min、25.957min、26.339min、32.105min的色谱峰分别为尿酸、鸟嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤、5-腺苷单磷酸、肌苷、腺嘌呤核苷、腺嘌呤核苷的色谱峰，最小分离度是尿酸与次鸟嘌呤，分离度为2.04，分离度大于1.5。
色谱图表明8种物质之间可以达到良好的分离。
实施例3柱温35℃
仪器：Agilent1260高效液相色谱仪，1260Infinity二极管阵列检测器
色谱柱：YMC-Pack ODS-AQ C18(150×4.6mm，5μm)
流动相A：0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(用磷酸或氢氧化钠试液调节pH值至4.0)
流动相B：乙腈
梯度洗脱与实施例1相同
流速：0.6mL/min
检测波长：260nm
柱温：35℃
进样体积：10μL
稀释剂：磷酸二氢钾缓冲液(pH6.8)
运行时间：60分钟
实验步骤：
磷酸二氢钾缓冲液(pH6.8)：称取磷酸二氢钾13.658g，置于1000mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，磷酸或氢氧化钠试液调节pH值至6.8。
混合结合溶液配制：分别精密称取尿酸450.34mg、腺嘌呤440.60mg、鸟嘌呤451.44mg、次黄嘌呤446.68mg、腺嘌呤核苷410.74mg、鸟嘌呤核苷455.40mg、肌苷441.00mg、5-腺苷单磷酸458.64mg，置于1000mL容量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
取混合结合溶液，在上述色谱条件下进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见附图3。
图3保留时间为9.354min、10.317min、10.939min、14.785min、17.538min、24.765min、25.066min、29.113min的色谱峰分别为尿酸、鸟嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤、5-腺苷单磷酸、肌苷、腺嘌呤核苷、腺嘌呤核苷的色谱峰，最小分离度是鸟嘌呤与次黄嘌呤，分离度为1.90，分离度大于1.5。
色谱图表明8种物质之间可以达到良好的分离。
实施例4缓冲试剂为BES
仪器：Agilent1260高效液相色谱仪，1260Infinity二极管阵列检测器
色谱柱：YMC-Pack ODS-AQ C18(150×4.6mm，5μm)
流动相A：0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(用磷酸或氢氧化钠试液调节pH值至4.0)
流动相B：乙腈
梯度洗脱与实施例1相同
流速：0.6mL/min
检测波长：260nm
柱温：30℃
进样体积：10μL
稀释剂：BES缓冲液(pH7.0)
运行时间：60分钟
实验步骤：
BES缓冲液(pH7.0)：称取BES(N,N-(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸)21.32g和氯化钠4.67g，加入至1000ml纯化水中，溶解，混匀，用氢氧化钠饱和溶液(约需3.5ml)调pH值至7.0。
混合结合溶液配制：分别精密称取尿酸225.78mg、腺嘌呤220.59mg、鸟嘌呤225.62mg、次黄嘌呤446.68mg、腺嘌呤核苷220.01mg、鸟嘌呤核苷225.17mg、肌苷220.14mg、5-腺苷单磷酸240.39mg，置于500mL容量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
混合标准工作液：精密吸取混合结合溶液置于10ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，分别配制成1μg/ml，5μg/ml，10μg/ml，15μg/ml，20μg/ml。
样品处理：
精密称取高分子聚合物0.1g，置于锥形瓶中，加入混合结合溶液，在水浴温度37℃±5℃，磁子搅拌30min～24h结合，然后样品溶液静置，取上清液过滤，取续滤液作为样品溶液
取样品溶液，在上述色谱条件下进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见附图4。
图4中保留时间为10.912min、11.846min、12.623min、16.553min、20.969min、25.402min、25.715min、30.588min的色谱峰分别为尿酸、鸟嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤、5-腺苷单磷酸、肌苷、腺嘌呤核苷、腺嘌呤核苷的色谱峰，尿酸与鸟嘌呤的分离度为2.61，鸟嘌呤与次黄嘌呤的分离度为2.10，次黄嘌呤与腺嘌呤的分离度为7.72，腺嘌呤与5-腺苷单磷酸的分离度为7.00，5-腺苷单磷酸的肌苷的分离度为11.45，肌苷与鸟嘌呤核苷的分离度为2.24，鸟嘌呤核苷与腺嘌呤核苷的分离度为20.48，8中物质的分离度均大于1.5。
吸附阴离子的高分子药物吸附尿酸、腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、肌苷、5-腺苷单磷酸的量按下式计算：
Figure BDA0002840004930000111
式中：
a为线性回归方程的斜率；
b为线性回归方程的截距；
A供为供试品溶液的峰面积；
C初为供试品溶液中混合结合溶液各物质的初始浓度，mg/L；
V为供试品溶液稀释体积，L；
m为供试品的称样量，g；
W为供试品的干燥失重，单位为％。
表4为吸附阴离子高分子药物吸附腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、肌苷和5-腺苷单磷酸的量
表4：
序号 化合物 结合量(mg/g)
1 尿酸 71.611
2 鸟嘌呤 18.891
3 次黄嘌呤 28.855
4 腺嘌呤 17.837
5 5-腺苷单磷酸 319.585
6 肌苷 14.973
7 鸟嘌呤腺苷 10.763
8 腺嘌呤核苷 6.147
对比例1流动相A缓冲液的pH为3.5
仪器：Agilent1260高效液相色谱仪，1260Infinity二极管阵列检测器
色谱柱：YMC-Pack ODS-AQ C18(150×4.6mm，5μm)
流动相A：0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(用磷酸或氢氧化钠试液调节pH值至3.5)
流动相B：乙腈
梯度洗脱与实施例1相同
流速：0.6mL/min
检测波长：260nm
柱温：30℃
进样体积：10μL
稀释剂：磷酸二氢钾缓冲液(pH6.8)
运行时间：60分钟
实验步骤：
磷酸二氢钾缓冲液(pH6.8)：称取磷酸二氢钾13.658g，置于1000mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，磷酸或氢氧化钠试液调节pH值至6.8。
混合结合溶液配制：分别精密称取尿酸450.34mg、腺嘌呤440.60mg、鸟嘌呤451.44mg、次黄嘌呤446.68mg、腺嘌呤核苷410.74mg、鸟嘌呤核苷455.40mg、肌苷441.00mg、5-腺苷单磷酸458.64mg，置于1000mL容量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
取混合结合溶液，在上述色谱条件下进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见附图5。
图5保留时间为10.367min、10.687min、11.194min、12.027min、15.686min、25.179min、25.474min、28.239min的色谱峰分别为尿酸、鸟嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤、5-腺苷单磷酸、肌苷、腺嘌呤核苷、腺嘌呤核苷的色谱峰，尿酸与鸟嘌呤的分离度为0.93，鸟嘌呤与次黄嘌呤的分离度为1.33，其他物质之间分离度大于1.5。
色谱图表明8种物质之间无法达到良好的分离。
对比例2流动相A缓冲液的pH为4.2
仪器：Agilent1260高效液相色谱仪，1260Infinity二极管阵列检测器
色谱柱：YMC-Pack ODS-AQ C18(150×4.6mm，5μm)
流动相A：0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(用磷酸或氢氧化钠试液调节pH值至4.2)
流动相B：乙腈
梯度洗脱与实施例1相同
流速：0.6mL/min
检测波长：260nm
柱温：30℃
进样体积：10μL
稀释剂：磷酸二氢钾缓冲液(pH6.8)
运行时间：60分钟
实验步骤：
磷酸二氢钾缓冲液(pH6.8)：称取磷酸二氢钾13.658g，置于1000mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，磷酸或氢氧化钠试液调节pH值至6.8。
混合结合溶液配制：分别精密称取尿酸23.17mg、腺嘌呤22.48mg、鸟嘌呤、次黄嘌呤22.80mg、腺嘌呤核苷20.64mg、鸟嘌呤核苷23.00mg、肌苷22.50mg、5-腺苷单磷酸23.40mg，置于1000mL容量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
取混合结合溶液，在上述色谱条件下进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见附图6。
图6保留时间为10.371min、11.746min、12.182min、18.779min、22.055min、25.146min、25.465min、30.564min的色谱峰分别为尿酸、鸟嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤、5-腺苷单磷酸、肌苷、腺嘌呤核苷、腺嘌呤核苷的色谱峰，鸟嘌呤与次黄嘌呤的分离度为1.18，5-腺苷单磷酸与肌苷的分离度为0.49，其他物质之间分离度大于1.5。
色谱图表明8种物质之间无法达到良好的分离。
对比例3流动相B有机溶剂为甲醇
仪器：Agilent1260高效液相色谱仪，1260Infinity二极管阵列检测器
色谱柱：YMC-Pack ODS-AQ C18(150×4.6mm，5μm)
流动相A：0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(用磷酸或氢氧化钠试液调节pH值至4.0)
流动相B：甲醇
梯度洗脱与实施例1相同
流速：0.6mL/min
检测波长：260nm
柱温：30℃
进样体积：10μL
稀释剂：磷酸二氢钾缓冲液(pH6.8)
运行时间：60分钟
实验步骤：
磷酸二氢钾缓冲液(pH6.8)：称取磷酸二氢钾13.658g，置于1000mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，磷酸或氢氧化钠试液调节pH值至6.8。
混合结合溶液配制：分别精密称取尿酸450.34mg、腺嘌呤440.60mg、鸟嘌呤451.44mg、次黄嘌呤446.68mg、腺嘌呤核苷410.74mg、鸟嘌呤核苷455.40mg、肌苷441.00mg、5-腺苷单磷酸458.64mg，置于1000mL容量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
取混合结合溶液，在上述色谱条件下进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见附图7。
图7保留时间为10.645min、11.604min、12.333min、16.377min、20.543min、29.536min、31.254min的色谱峰分别为尿酸、鸟嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤、5-腺苷单磷酸、肌苷和鸟嘌呤核苷、腺嘌呤核苷的色谱峰，肌苷和鸟嘌呤完全重合。
色谱图表明8种物质之间无法达到良好的分离。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (11)

1.一种检测药物对核酸代谢产物的吸附效率的方法，其特征在于，包括：
将含有核酸代谢产物的缓冲液与药物进行混合，得到供试品溶液；
对所述供试品溶液进行高效液相色谱检测，并基于检测结果确定所述药物对核酸代谢产物吸附效率，
其中，所述核酸代谢产物包括选自下列至少之一：尿酸、腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、肌苷和5-腺苷单磷酸；
所述高效液相色谱检测采用的流动相包括缓冲液和/或有机溶剂，所述缓冲液的pH值为3.6～4.0。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缓冲液的pH值为4.0。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缓冲液选自下列至少之一：磷酸盐缓冲液、枸橼酸缓冲液、乙酸缓冲液和甲酸缓冲液，优选为磷酸盐缓冲液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂包括乙腈。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测采用梯度洗脱方式，所述梯度洗脱的条件为：
0－15分钟时，所述缓冲液与所述有机溶剂的体积比为100％：0％；
15－20分钟时，所述缓冲液与所述有机溶剂的体积比为(95％～100％)：(0％～5％)；
20－40分钟时，所述缓冲液与所述有机溶剂的体积比为95％：5％；
40－41分钟时，所述缓冲液与所述有机溶剂的体积比为(95％～100％)：(0％～5％)；
41－60分钟时，所述缓冲盐与所述有机溶剂的体积比为100％：0％；
优选地，所述梯度洗脱的条件为：
0－15分钟时，所述缓冲液与所述有机溶剂的体积比为100％：0％；
15－20分钟时，所述缓冲液与所述有机溶剂的体积比为100％：0％；
20－40分钟时，所述缓冲液与所述有机溶剂的体积比为95％：5％；
40－41分钟时，所述缓冲液与所述有机溶剂的体积比为95％：5％；
41－60分钟时，所述缓冲液与所述有机溶剂的体积比为100％：0％；
任选地，所述流动相的流速为0.2mL/min-1.0mL/min，优选为0.6mL/min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有核酸代谢产物的缓冲液中含有缓冲试剂，所述缓冲试剂包括选自下列至少之一：
氢氧化钠、磷酸盐、2-(二乙醇氨基)乙磺酸、氨基丁三醇·盐酸、枸橼酸盐和碳酸盐；
优选为磷酸二氢钾。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述缓冲试剂的pH为6.0～8.0，优选为6.5～7.0。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合是在30℃～40℃的条件下进行30min～24h。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测采用的色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；
任选地，所述色谱柱的粒径为3μm～5μm，优选为3μm；
任选地，所述色谱柱长度为100mm～300mm，优选为150mm；
任选地，所述高效液相色谱检测采用的柱温为20℃-40℃；
任选地，所述高效液相色谱检测采用的检测波长为220nm-300nm，优选为260nm。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述吸附效率是以各核酸代谢产物结合量的形式表征，
所述各核酸代谢产物结合量由下列公式确定：
Figure FDA0002840004920000021
其中，a为线性回归方程的斜率；
b为线性回归方程的截距；
A供为供试品溶液的峰面积；
C初为所述含有核酸代谢产物的缓冲液中各核酸代谢产物的初始浓度，单位为mg/L；
V为供试品溶液稀释体积，单位为L；
m为供试品的称样量，单位为g；
W为供试品的干燥失重，单位为％。
11.一种筛选药物的方法，其特征在于，包括：
提供候选药物；
采用权利要求1～10任一项所述的方法检测所述候选药物对核酸代谢产物的吸附效率，基于所得吸附效率确定所述候选药物是否为目标药物。
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