CN108864234B - 一种从皱瘤海鞘中分离肌苷的方法 - Google Patents

一种从皱瘤海鞘中分离肌苷的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种从皱瘤海鞘中分离肌苷的方法，首次从皱瘤海鞘中提取、分离和鉴别出化合物肌苷，能够对皱瘤海鞘进行充分回收利用，避免浪费；采用高速逆流色谱进行分离，具有样品无损失、无污染、高效、快速和分离量大的优点，具体分离步骤简单易操作；分离得到的肌苷在制药等领域具有广泛用途，对海洋天然产物有效成分的研究具有十分重要的意义。

Description

一种从皱瘤海鞘中分离肌苷的方法
技术领域
本发明涉及生物来源的新药物提取分离工艺技术领域，具体涉及一种从皱瘤海鞘中分离肌苷的方法，首次从皱瘤海鞘(Styela plicata)中提取、分离和鉴别出化合物肌苷。
背景技术
海鞘是尾索动物亚门海鞘纲的尾索动物，在自然界中已知有1500余种，主要分布在热带及亚热带海域。我国海鞘资源丰富，已记录的中国沿海海鞘种类有100余种，且有很多为我国所特有。一般而言，海鞘可为自珊瑚礁海域采集到的野生型﹝wild type﹞，亦可为经养殖得到的养殖型﹝cultured type﹞。据报道，海鞘中含有多种具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗炎等活性的化合物，因此，近年来，海鞘的化学成分及其生物活性成为了海洋天然产物研究的热门领域。
皱瘤海鞘(Styela plicata)是海鞘中的一种，主要分布于我国中南沿海的福建、广东和海南等，部分地区也有人工养殖。皱瘤海鞘经常在一些海产养殖过程中一同生长起来，虽然皱瘤海鞘在部分地区有作为食物食用的习惯，但大部分的皱瘤海鞘仍然是作为养殖过程中的副产物被丢弃掉，造成了大量的浪费。因此，如果能将皱瘤海鞘进行有效的利用，不仅具有一定的经济价值，也可以解决浪费问题。
肌苷(Inosine)，也称为次黄苷、次黄嘌呤核苷等，化学结构式如下式所示，分子式为C10H12N4O5，相对分子量为268。肌苷是由次黄嘌呤于核糖结合而成的核苷类化合物。在嘌呤的从头合成(de novo synthesis)中，肌苷酸(IMP)可以作为合成腺苷酸(AMP)和鸟苷酸(GMP)的前体。适用于各种原因引起的白细胞减少症、血小板减少症、各种心脏疾患、急性及慢性肝炎、肝硬化等，此外尚可治疗中心视网膜炎、视神经萎缩等。
Figure GDA0002346080190000021
目前尚未有研究揭示皱瘤海鞘中是否含有肌苷，更没有如何从皱瘤海鞘中获得肌苷的分离技术报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种从皱瘤海鞘中分离肌苷的方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种从皱瘤海鞘中分离肌苷的方法，包括：
1)取皱瘤海鞘，用正己醇浸提若干次，合并浸提液，浓缩得到粗提物；
2)步骤1)得到的粗提物用高速逆流液相色谱分离：溶剂体系为乙酸乙酯：甲醇：水＝4.5～5.5:0.8～1.2:4.5～5.5，充分混合后静置分层，然后分离上相与下相；所述粗提物用45～55％甲醇溶解为浓度680～700mg/mL进样，以上相为固定相，以下相为流动相，流速2～4mL/min，正接正转，转速800～900r/min；温度34～36℃；检测波长：205～215nm；收集55～83min出峰对应的组份；
3)取步骤2)中55～83min出峰对应的组份，用反相液相色谱分离：固定相：YMC-Triart C18；流动相：甲醇-水混合液；梯度洗脱1.5～2.5h，流动相中甲醇浓度从4～6％均匀递增到100％；流速55～65mL/min；柱温24～26℃；检测波长195～205nm、250～260nm、305～315nm；
4)收集步骤3)中流动相中甲醇浓度为13％～25％时对应的组份，用反相液相色谱分离：固定相：YMC-Triart C18；流动相：甲醇浓度为30～34％的甲醇-水混合液；等度洗脱；流速55～65mL/min；柱温24～26℃；检测波长210～220nm、250～260nm、330～340nm；
5)收集步骤4)中7～11min出峰对应的组份，用0.5～2％甲醇水配制成140～160mg/mL，用高效液相色谱分离：固定相：YMC-Triart C18；流动相：甲醇浓度为0.5～2％的甲醇-水混合液；等度洗脱；流速：8～12mL/min；柱温24～26℃；检测波长：195～205nm、245～255nm和255～265nm；收集66～75min出峰对应的组份，即为肌苷。
一实施例中：所述步骤2)中，高速逆流液相色谱采用TBE-300B。
一实施例中：所述步骤2)中，上样体积为14～16mL。
一实施例中：所述步骤2)中，以上相为固定相，以下相为流动相，用35～45mL/min的流速将固定相泵满，调节转速为800～900r/min，温度34～36℃，以2～4mL/min的流速向柱中泵入流动相，当流动相从主机出口稳定流出时，证明体系已经达到流体动力学平衡；随后再用于粗提物的高速逆流液相色谱分离。
一实施例中：所述步骤3)中，反相液相色谱采用
Figure GDA0002346080190000031
4250，带有DAC-50动态轴向压缩柱系统；所述固定相YMC-Triart C18的规格为50×250mm，粒径10μm。
一实施例中：所述步骤4)中，反相液相色谱采用
Figure GDA0002346080190000032
4250，带有DAC-50动态轴向压缩柱系统；所述固定相YMC-Triart C18的规格为50×250mm，粒径10μm。
一实施例中：所述步骤5)中，高效液相色谱采用岛津高效液相色谱仪制备系统LC-6AD；固定相YMC-Triart C18制备柱的规格为20×250mm，粒径5μm。
一实施例中：所述步骤5)中，采用SPD-M20A二级管阵列检测器。
一实施例中：所述步骤5)中，进样量280～320μL。
本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：
本发明以人工养殖的皱瘤海鞘为原料进行分离，原料易得，能够对皱瘤海鞘进行充分回收利用，避免浪费；采用高速逆流色谱(HSCCC)进行分离，具有样品无损失、无污染、高效、快速和分离量大的优点，且具体分离步骤简单易操作；所得的肌苷为首次从皱瘤海鞘(Styela plicata)中提取、分离纯化得到，在作为白细胞减少症、血小板减少症、各种心脏疾患、急性及慢性肝炎、肝硬化、中心视网膜炎、视神经萎缩等疾病的治疗或辅助治疗方面具有广泛用途，对于海洋天然产物有效成分的研究具有十分重要的意义。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1为实施例中化合物qb-1-3-2-14即肌苷在1％甲醇洗脱时UPLC分析图谱。
图2为实施例中化合物qb-1-3-2-14即肌苷的MS图谱。
图3为实施例中化合物qb-1-3-2-14即肌苷的1H谱图。
图4为实施例中化合物qb-1-3-2-14即肌苷的13C谱图。
具体实施方式
下面通过实施例具体说明本发明的内容：
1)将湿重10Kg皱瘤海鞘冻干后，切成碎片，以粉碎机打碎置于5000mL烧杯中，以正丁醇浸泡并用超声加速浸提，重复浸提若干次直至浸提液变淡至近无色后，合并浸提液，以旋转蒸发仪抽干溶剂，得到正丁醇层粗提物(qb)52g；
2)取步骤1)得到的正丁醇层粗提物(qb)52g用75mL 50％甲醇水溶解，使之浓度为693mg/mL，用高速逆流液相色谱(HSCCC)(TBE-300B)分离切段成4组分；分为五次上样，每次上样体积为15mL；
高速逆流液相色谱系统TBE-300B；溶剂体系为乙酸乙酯：甲醇：水＝5:1:5(V/V)，按比例将四种溶剂混合配制好，摇匀，超声30min使其充分混合，静置过夜使上下相充分饱和平衡，分层，分离上相与下相；
开主机；以上相为固定相，以下相为流动相，用40mL/min的流速将固定相泵满聚四氟乙烯管，调节转速为850r/min，恒温水浴35℃，以3mL/min的流速向柱中泵入流动相，当流动相从主机出口稳定流出时，证明体系已经达到流体动力学平衡；计算分配系数K值为52.02％；
取上述用50％甲醇水溶解的浓度为693mg/mL的粗提物进样，以上相为固定相，以下相为流动相，流速3mL/min泵入柱中，仪器为正接正转，转速850r/min；温度35℃；柱口流出物通过紫外检测器在210nm下连续监测；收集57～81min出峰对应的流出物为第一组份，收集81～102min出峰对应的流出物为第二组份，收集102～282min出峰对应的流出物为第三组份；然后改为以下相为固定相，以上相为流动相，流速3mL/min泵入柱中，仪器为反接正转，转速850r/min，温度35℃，收集282～392min出峰对应的流出物为第四组份；分离完成后，停止主机，用空气将柱内溶剂推出，吹干；第一组份、第二组份、第三组份、第四组分分别旋转蒸发得到qb-1、qb-2、qb-3、qb-4。
3)取步骤2)中57～81min出峰对应的第一组份(qb-1)(48.5262g)，用反相制备液相色谱分离：
Figure GDA0002346080190000051
4250，带有DAC-50动态轴向压缩柱系统；固定相：YMC-Triart C18(50×250mm，粒径10μm)；流动相：甲醇-水混合液；梯度洗脱2h，流动相中甲醇浓度从5％均匀递增到100％；流速60mL/min；柱温25℃；检测波长200nm、254nm、310nm；
4)收集步骤3)中流动相中甲醇浓度为15％～24％时对应的组份(qb-1-3)(1198mg)，用反相制备液相色谱分离：
Figure GDA0002346080190000052
4250，带有DAC-50动态轴向压缩柱系统；固定相：YMC-Triart C18(50×250mm，粒径10μm)；流动相：甲醇浓度为32％的甲醇-水混合液；等度洗脱2h；流速60mL/min；柱温25℃；检测波长214nm、254nm、337nm；
5)将步骤4)中收集的8～10.5min对应的组分(qb-1-3-2)(361mg)，用1％甲醇水配制成150mg/mL，用高效液相色谱分离：
岛津高效液相色谱仪制备系统LC-6AD，LC-6AD(SHIMADZU)溶液传输单元，SIL-10AP高效进样器，SPD-M20A高灵敏度二级管阵列检测器；固定相：YMC-Triart C18制备柱(20×250mm，粒径5μm)；流动相：甲醇浓度为1％的甲醇-水混合液；流速：10mL/min；进样量300μL；柱温25℃；检测波长：200nm、250nm和262nm；分离得到20个组份，收集第十四出峰(68～74min)对应的组份(qb-1-3-2-14)(10mg)，为白色粉末状，进行UPLC、MS、NMR分析。
A)化合物qb-1-3-2-14进行UPLC分析：
UPLC型号：Nexera X2岛津
检测器：SPD-M20A；
色谱柱：YMC-Triart C18柱，50×3.0mml.D S-1.9μm；
液相条件：
流动相：甲醇：水＝1％：99％，15min；
流速：0.3mL/min，柱温：35℃，进样量：3.0μL；
检测波长：248nm；
UPLC图谱如图1所示。
B)化合物qb-1-3-2-14进行正离子分辨质谱分析：
MS仪器：采用Q ExactiveTM四级杆Orbitrap质谱仪(Thermo)进行高分辨质谱分析，MS类型为ESI源；
MS图谱如图2所示；MS数据：[M+H+]m/z测得值269.20，确定其分子式为C10H12N4O5。
C)化合物qb-1-3-2-14进行NMR分析：
NMR仪器：Bruker AvanceⅡ-600型核磁共振仪；
1H-NMR(600MHz，DMSO)及13C-NMR图谱分别如图3和图4所示，1H-NMR数据如下：
12.38(1H，s，OH-4)，8.29(1H，s，H-3)，8.05(1H，s，H-3)，
5.85(1H，d，J＝6.0，H-5)，5.53(1H，s，OH-7)，
5.25(1H，s，OH-l0)，5.11(1H，s，OH-8)，
3.1-4.5(5H，ribose protons)。
结合上述分析，鉴定化合物qb-1-3-2-14为肌苷(Inosine)。
Figure GDA0002346080190000071
以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (9)

1.一种从皱瘤海鞘中分离肌苷的方法，其特征在于：包括：
1)取皱瘤海鞘，用正己醇浸提若干次，合并浸提液，浓缩得到粗提物；
2)步骤1)得到的粗提物用高速逆流液相色谱分离：溶剂体系为乙酸乙酯：甲醇：水＝4.5～5.5:0.8～1.2:4.5～5.5，充分混合后静置分层，然后分离上相与下相；所述粗提物用45～55％甲醇溶解为浓度680～700mg/mL进样，以上相为固定相，以下相为流动相，流速2～4mL/min，正接正转，转速800～900r/min；温度34～36℃；检测波长：205～215nm；收集55～83min出峰对应的组份；
3)取步骤2)中55～83min出峰对应的组份，用反相液相色谱分离：固定相：YMC-TriartC18；流动相：甲醇-水混合液；梯度洗脱1.5～2.5h，流动相中甲醇浓度从4～6％均匀递增到100％；流速55～65mL/min；柱温24～26℃；检测波长195～205nm、250～260nm、305～315nm；
4)收集步骤3)中流动相中甲醇浓度为13％～25％时对应的组份，用反相液相色谱分离：固定相：YMC-Triart C18；流动相：甲醇浓度为30～34％的甲醇-水混合液；等度洗脱；流速55～65mL/min；柱温24～26℃；检测波长210～220nm、250～260nm、330～340nm；
5)收集步骤4)中7～11min出峰对应的组份，用0.5～2％甲醇水配制成140～160mg/mL，用高效液相色谱分离：固定相：YMC-Triart C18；流动相：甲醇浓度为0.5～2％的甲醇-水混合液；等度洗脱；流速：8～12mL/min；柱温24～26℃；检测波长：195～205nm、245～255nm和255～265nm；收集66～75min出峰对应的组份，即为肌苷。
2.根据权利要求1所述的从皱瘤海鞘中分离肌苷的方法，其特征在于：所述步骤2)中，高速逆流液相色谱采用TBE-300B。
3.根据权利要求1所述的从皱瘤海鞘中分离肌苷的方法，其特征在于：所述步骤2)中，上样体积为14～16mL。
4.根据权利要求1所述的从皱瘤海鞘中分离肌苷的方法，其特征在于：所述步骤2)中，以上相为固定相，以下相为流动相，用35～45mL/min的流速将固定相泵满，调节转速为800～900r/min，温度34～36℃，以2～4mL/min的流速向柱中泵入流动相，当流动相从主机出口稳定流出时，证明体系已经达到流体动力学平衡；随后再用于粗提物的高速逆流液相色谱分离。
5.根据权利要求1所述的从皱瘤海鞘中分离肌苷的方法，其特征在于：所述步骤3)中，反相液相色谱采用
Figure FDA0001722357410000021
4250，带有DAC-50动态轴向压缩柱系统；所述固定相YMC-Triart C18的规格为50×250mm，粒径10μm。
6.根据权利要求1所述的从皱瘤海鞘中分离肌苷的方法，其特征在于：所述步骤4)中，反相液相色谱采用
Figure FDA0001722357410000022
4250，带有DAC-50动态轴向压缩柱系统；所述固定相YMC-Triart C18的规格为50×250mm，粒径10μm。
7.根据权利要求1所述的从皱瘤海鞘中分离肌苷的方法，其特征在于：所述步骤5)中，高效液相色谱采用岛津高效液相色谱仪制备系统LC-6AD；固定相YMC-Triart C18制备柱的规格为20×250mm，粒径5μm。
8.根据权利要求1所述的从皱瘤海鞘中分离肌苷的方法，其特征在于：所述步骤5)中，采用SPD-M20A二级管阵列检测器。
9.根据权利要求1所述的从皱瘤海鞘中分离肌苷的方法，其特征在于：所述步骤5)中，进样量280～320μL。
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