CN105315192B - 一种从皱瘤海鞘中分离1‑氢‑3‑吲哚甲醛的方法 - Google Patents
一种从皱瘤海鞘中分离1‑氢‑3‑吲哚甲醛的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种从皱瘤海鞘中分离1‑氢‑3‑吲哚甲醛的方法,先将皱瘤海鞘用乙醇浸提,再进行正相硅胶柱层析,然后采用反向固相萃取分离得到粗品,最后用HPLC进行纯化。本发明提供的一种从皱瘤海鞘中分离1‑氢‑3‑吲哚甲醛的方法,方法简单,提取时间短,效率高,得到的1‑氢‑3‑吲哚甲醛纯度高。
Description
技术领域
本发明属于药物分离工艺领域,具体地说,涉及一种从皱瘤海鞘中分离1-氢-3-吲哚甲醛的方法。
背景技术
海鞘是尾索动物亚门海鞘纲的尾索动物,在自然界中已知有1500余种,主要分布在热带及亚热带海域。我国海鞘资源丰富,已记录的中国沿海海鞘种类有100余种,且有很多为我国所特有。据报道,海鞘中含有多种具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗炎等活性的化合物,因此,近年来,海鞘的化学成分及其生物活性成为了海洋天然产物研究的热门领域。
皱瘤海鞘(Styela plicata)是海鞘中的一种,主要分布于我国中南沿海,福建、广东和海南等,部分地区也有人工养殖。皱瘤海鞘经常在一些海产养殖过程中一同生长起来,虽然皱瘤海鞘在部分地区有作为食物食用的习惯,但大部分的皱瘤海鞘仍然是作为养殖过程中的副产物被丢弃掉,造成了大量的浪费。因此,如果能将皱瘤海鞘进行有效的利用,不仅具有一定的经济价值,也可以解决浪费问题。
1-氢-3-吲哚甲醛的化学结构式如下所示,其分子式为C9H7NO,相对分子量为145.161。经报道,1-氢-3-吲哚甲醛具有一定的抗菌、抗炎和抗肿瘤的生物活性,此外,1-氢-3-吲哚甲醛还是一种重要的医药和有机中间体,可以用于合成许多具有生理和药理活性的化合物,例如吲哚乙酸、吲哚美辛等。1-氢-3-吲哚甲醛目前的主要来源之一是化学合成,但化学合成过程比较复杂,涉及有毒有害试剂多,且得率有限;另一途径是从天然的植物中提取,同样也存在提取过程繁琐,收率不高的问题。目前,从皱瘤海鞘中提取分离1-氢-3-吲哚甲醛的方法还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处,提供了一种从皱瘤海鞘中分离1-氢-3-吲哚甲醛的方法,方法简单,提取时间短,效率高,得到的1-氢-3-吲哚甲醛纯度高。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
一种从皱瘤海鞘中分离1-氢-3-吲哚甲醛的方法,包括:
1)取皱瘤海鞘,用乙醇浸提得到乙醇粗提物;乙醇粗提物用甲醇溶解后过滤,滤液浓缩得到粗提物溶液,按粗提物溶液与正相硅胶体积比为1:4~8的比例,用100~200目的正相硅胶进行柱层析;以二氯甲烷-甲醇混合液作为洗脱液,且依次按100%二氯甲烷→0.5~1.5%甲醇→8~12%甲醇→45~55%甲醇→100%甲醇进行梯度洗脱,每一梯度洗脱1~7个柱体积,分别收集每个柱体积的洗脱液,浓缩至干,进行TLC分离;所述TLC分离条件为:硅胶G254薄层板,展开剂为体积比8~12:1的二氯甲烷-甲醇混合液;
2)取步骤1)TLC中Rf值为0.15~0.25的组分,合并后进行反相固相萃取分离,采用Bond Elut C18固相萃取柱,真空固相萃取装置,湿法上样,以甲醇-水混合液作为洗脱液,且依次按100%水→25~35%甲醇→65~75%甲醇→100%甲醇进行梯度洗脱,每一梯度洗脱1~7个柱体积,收集各梯度的洗脱液,得到100%水组分、25~35%甲醇组分、65~75%甲醇组分、100%甲醇组分;
3)取步骤2)中得到的25~35%甲醇组分,浓缩至干,得到粗品;
4)取步骤3)中得到的粗品,用甲醇配置成0.8~1.2mg/ml,采用HPLC进行纯化;HPLC条件为:固定相:HPLC半制备柱ODS-A,20×250mm,柱内径5μm;流动相:45~55%甲醇;流速:6~10ml/min;进样量:0.95~1.05ml;检测器:检测波长:210nm和254nm;收集12~18min大峰出现时的洗脱液,浓缩,即得1-氢-3-吲哚甲醛。
一实施例中:所述步骤1)中,粗提物溶液与正相硅胶体积比为1:5.5~6.5;以二氯甲烷-甲醇混合液作为洗脱液,且依次按100%二氯甲烷→0.8~1.2%甲醇→9.5~10.5%甲醇→49~51%甲醇→100%甲醇进行梯度洗脱,每一梯度洗脱2~6个柱体积,分别收集每个柱体积的洗脱液,浓缩至干,进行TLC分离;所述TLC分离条件中,展开剂为体积比9~11:1的二氯甲烷-甲醇混合液。
一实施例中:所述步骤2)中,取步骤1)TLC中Rf值为0.18~0.22的组分;反向固相萃取分离中,以甲醇-水混合液作为洗脱液,且依次按100%水→29~31%甲醇→69~71%甲醇→100%甲醇进行梯度洗脱,每一梯度洗脱2~6个柱体积,收集各梯度的洗脱液,得到100%水组分、29~31%甲醇组分、69~71%甲醇组分、100%甲醇组分。
一实施例中:所述步骤3)中,取步骤2)中得到的29~31%甲醇组分,浓缩至干,得到粗品。
一实施例中:所述步骤4)中,取步骤3)中得到的粗品,用甲醇配置成0.9~1.1mg/ml;HPLC条件中,流动相:49~51%甲醇;流速:7~9ml/min;溶液传输单元:LC-6AD;进样器:SIL-10AP;进样量:0.95~1.05ml;检测器:光电二极管阵列检测器SPD-M20A;收集14~16min大峰出现时的洗脱液,浓缩,即得所述之1-氢-3-吲哚甲醛。
一实施例中:所述步骤1)中,用乙醇浸提得到乙醇粗提物的方法为:取皱瘤海鞘,阴干,切碎,向切碎后皱瘤海鞘中加入1~1.5倍体积的乙醇,置均质机中破碎后,浸提6~8d,浸提液取出备用;重新加入1~1.5倍体积的乙醇,浸提2~4d后,浸提液取出备用;再次加入1~1.5倍体积的乙醇,浸提2~4d后,浸提液取出备用;三次得到的的浸提液相互合并,回收溶剂,即得乙醇粗提物。
一实施例中:所述浸提过程中,每天超声振动提取0.5~2h。
一实施例中:所述步骤1)中,正相硅胶型号为SY01。
一实施例中:所述步骤2)中,真空固相萃取装置为12管或24管真空固相萃取装置。
一实施例中:所述步骤2)中,所述固相萃取柱为若干根固相萃取柱并联。
本技术方案与背景技术相比,它具有如下优点:
1.1-氢-3-吲哚甲醛的传统来源之一是从植物中提取,但植物提取方法比较繁琐,其中具有叶绿素等色素,还有纤维素等,这些物质干扰性较强且不易除去,且植物细胞具有细胞壁,相对提取效率较低;本发明提供了一种从皱瘤海鞘中分离1-氢-3-吲哚甲醛的方法,皱瘤海鞘作为一种海洋动物,不具有细胞壁,而且其中的成分较为单纯,含有的氨基酸、糖类的物质也相对容易去除,因此,从皱瘤海鞘中提取1-氢-3-吲哚甲醛,比从植物中提取,方法更为简单,且提取效率更高,纯度更高。
2.皱瘤海鞘经常在其他海产养殖中一并成长起来,以往都是作为副产物被丢弃掉,造成了大量的浪费,本发明提供了从皱瘤海鞘中提取1-氢-3-吲哚甲醛的方法,为皱瘤海鞘的再利用提供了思路,可以有效减少了浪费,实现节约资源的目的。
3.本发明的从皱瘤海鞘中提取1-氢-3-吲哚甲醛的方法,采用了反相固相萃取的方式,与传统的分子筛相比,所需时间大大缩短,能够缩短提取时间一倍以上,提取效率更高,而且成本可比分子筛降低至少一倍;与反相液相色谱提取方法相比,能够大大减少提取过程中样品损耗较大的问题。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1为本实施例1中得到的1-氢-3-吲哚甲醛在流动相为50%甲醇时的HPLC分析谱图。
图2为本实施例1中得到的1-氢-3-吲哚甲醛的MS谱图。
图3为本实施例1中得到的1-氢-3-吲哚甲醛的1H谱谱图。
图4为本实施例1中得到的1-氢-3-吲哚甲醛的13C谱谱图。
具体实施方式
下面通过实施例具体说明本发明的内容:
实施例1
1)取湿重10kg的皱瘤海鞘,阴干,切碎,向切碎后皱瘤海鞘中加入1.25倍体积的乙醇,置均质机中破碎后,置于5L烧杯中,浸提7d且浸提过程中每天超声振动提取1h以加速提取,浸提液取出备用;重新加入1.25倍体积的乙醇,浸提3d且浸提过程中每天超声振动提取1h以加速提取,浸提液取出备用;再次加入1.25倍体积的乙醇,浸提3d且浸提过程中每天超声振动提取1h以加速提取,浸提液取出备用;三次得到的的浸提液相互合并,以旋转蒸发仪蒸发回收溶剂,即得乙醇粗提物120g;向乙醇粗提物中加入甲醇直至溶剂呈无色,过滤,除去不溶性杂质如盐类等,滤液用旋转蒸发仪蒸发回收溶剂并浓缩至50ml,得到粗提物溶液;按粗提物溶液与正相硅胶体积比为1:6的比例量取正相硅胶进行柱层析;本实施例之中,所述正相硅胶为SY01,100~200目,用量为600g;以二氯甲烷-甲醇混合液作为洗脱液,依次按100%二氯甲烷→1%甲醇→10%甲醇→50%甲醇→100%甲醇进行梯度洗脱,每一梯度洗脱3~5个柱体积,分别收集每个柱体积的洗脱液,浓缩至干,进行TLC分离;所述TLC分离条件为:硅胶G254薄层板,展开剂为体积比10:1的二氯甲烷-甲醇混合液;
2)取步骤1)TLC中Rf值为0.2的组分,合并共250mg,取230mg进行反相固相萃取分离,采用3根瓦里安Bond Elut C18固相萃取柱(每根柱体积60ml)相互并联,Mediwax 12管或24管真空固相萃取装置,湿法上样,以甲醇-水混合液作为洗脱液,依次按100%水→30%甲醇→70%甲醇→100%甲醇进行梯度洗脱,每一梯度洗脱3~5个柱体积,收集各梯度的洗脱液,得到100%水组分、30%甲醇组分、70%甲醇组分、100%甲醇组分;
3)取步骤2)中得到的30%甲醇组分用TLC鉴定:采用硅胶G254薄层板,体积比为10:1的氯仿-甲醇混合液作为展开剂,紫外灯下观察有明显显色点,表明30%甲醇组分中确实含有目标产物;将30%甲醇组分浓缩至干,得到粗品105mg;
4)取步骤3)中得到的粗品105mg,用甲醇配置成1mg/ml,采用HPLC进行纯化;HPLC条件为:岛津高效液相色谱仪制备系统;固定相:HPLC半制备柱YMC ODS-A,20×250mm,柱内径5μm;流动相:50%甲醇;流速:8ml/min;溶液传输单元:LC-6AD;进样器:SIL-10AP;进样量:1ml;检测器:光电二极管阵列检测器SPD-M20A;检测波长:210nm和254nm;收集15min大峰出现时的洗脱液,浓缩,即得所述之1-氢-3-吲哚甲醛20mg。
将得到的1-氢-3-吲哚甲醛用HPLC进行纯度分析:岛津Nexera X2高效液相色谱系统;固定相:Shim-pack XR-ODSⅢ,20×75mm,柱内径1.6μm;流动相:50%甲醇;流速:0.2ml/min;柱温:40℃;进样量:0.5μl;检测器:光电二极管阵列检测器SPD-M20A;检测波长:254nm。经检测,本实施例中得到的1-氢-3-吲哚甲醛纯度为95%,HPLC分析谱图如图1所示。
本实施例中得到的1-氢-3-吲哚甲醛的MS数据:ESI源,分子离子峰为145.1610,碎片峰为168.0411[M+Na],如图2所示。
本实施例中得到的1-氢-3-吲哚甲醛的NMR数据:
1H NMR(600MHz,MeOD)δ12.34(broad,s,1H),9.89(s,1H),8.16-8.09(m,2H),7.48-7.22(m,3H)。1H谱谱图如图3所示。
13C NMR(151MHz,MeOD)δ186.01,138.27,137.54,124.32,123.59,122.20,120.98,118.73,111.72。13C谱谱图如图4所示。
实施例2
1)取湿重5kg的皱瘤海鞘,阴干,切碎,向切碎后皱瘤海鞘中加入1.25倍体积的乙醇,置均质机中破碎后,置于5L烧杯中,浸提7d且浸提过程中每天超声振动提取1h以加速提取,浸提液取出备用;重新加入1.25倍体积的乙醇,浸提3d且浸提过程中每天超声振动提取1h以加速提取,浸提液取出备用;再次加入1.25倍体积的乙醇,浸提3d且浸提过程中每天超声振动提取1h以加速提取,浸提液取出备用;三次得到的的浸提液相互合并,以旋转蒸发仪蒸发回收溶剂,即得乙醇粗提物58g;向乙醇粗提物中加入甲醇直至溶剂呈无色,过滤,除去不溶性杂质如盐类等,滤液用旋转蒸发仪蒸发回收溶剂并浓缩至25ml,得到粗提物溶液;按粗提物溶液与正相硅胶体积比为1:6的比例量取正相硅胶进行柱层析;本实施例之中,所述正相硅胶为SY01,100~200目,用量为300g;以二氯甲烷-甲醇混合液作为洗脱液,依次按100%二氯甲烷→1%甲醇→10%甲醇→50%甲醇→100%甲醇进行梯度洗脱,每一梯度洗脱3~5个柱体积,分别收集每个柱体积的洗脱液,浓缩至干,进行TLC分离;所述TLC分离条件为:硅胶G254薄层板,展开剂为体积比10:1的二氯甲烷-甲醇混合液;
2)取步骤1)TLC中Rf值为0.2的组分,合并共118mg,进行反相固相萃取分离,采用2根瓦里安Bond Elut C18固相萃取柱(每根柱体积60ml)相互并联,Mediwax 12管或24管真空固相萃取装置,湿法上样,以甲醇-水混合液作为洗脱液,依次按100%水→30%甲醇→70%甲醇→100%甲醇进行梯度洗脱,每一梯度洗脱3~5个柱体积,收集各梯度的洗脱液,得到100%水组分、30%甲醇组分、70%甲醇组分、100%甲醇组分;
3)取步骤2)中得到的30%甲醇组分用TLC鉴定:采用硅胶G254薄层板,体积比为10:1的氯仿-甲醇混合液作为展开剂,紫外灯下观察有明显显色点,表明30%甲醇组分中确实含有目标产物;将30%甲醇组分浓缩至干,得到粗品48mg;
4)取步骤3)中得到的粗品48mg,用甲醇配置成1mg/ml,采用HPLC进行纯化;HPLC条件为:岛津高效液相色谱仪制备系统;固定相:HPLC半制备柱YMC ODS-A,20×250mm,柱内径5μm;流动相:50%甲醇;流速:8ml/min;溶液传输单元:LC-6AD;进样器:SIL-10AP;进样量:1ml;检测器:光电二极管阵列检测器SPD-M20A;检测波长:210nm和254nm;收集15min大峰出现时的洗脱液,浓缩,即得所述之1-氢-3-吲哚甲醛9.5mg。
将得到的1-氢-3-吲哚甲醛用HPLC进行纯度分析,HPLC条件同实施例1;经检测,本实施例中得到的1-氢-3-吲哚甲醛纯度为96%。
本实施例中得到的1-氢-3-吲哚甲醛的MS数据、NMR数据同实施例1。
实施例3
1)取湿重10kg的皱瘤海鞘,阴干,切碎,向切碎后皱瘤海鞘中加入1.25倍体积的乙醇,置均质机中破碎后,置于5L烧杯中,浸提7d且浸提过程中每天超声振动提取1h以加速提取,浸提液取出备用;重新加入1.25倍体积的乙醇,浸提3d且浸提过程中每天超声振动提取1h以加速提取,浸提液取出备用;再次加入1.25倍体积的乙醇,浸提3d且浸提过程中每天超声振动提取1h以加速提取,浸提液取出备用;三次得到的的浸提液相互合并,以旋转蒸发仪蒸发回收溶剂,即得乙醇粗提物125g;向乙醇粗提物中加入甲醇直至溶剂呈无色,过滤,除去不溶性杂质如盐类等,滤液用旋转蒸发仪蒸发回收溶剂并浓缩至50ml,得到粗提物溶液;按粗提物溶液与正相硅胶体积比为1:6的比例量取正相硅胶进行柱层析;本实施例之中,所述正相硅胶为SY01,100~200目,用量为600g;以二氯甲烷-甲醇混合液作为洗脱液,依次按100%二氯甲烷→1%甲醇→10%甲醇→50%甲醇→100%甲醇进行梯度洗脱,每一梯度洗脱3~5个柱体积,分别收集每个柱体积的洗脱液,浓缩至干,进行TLC分离;所述TLC分离条件为:硅胶G254薄层板,展开剂为体积比10:1的二氯甲烷-甲醇混合液;
2)取步骤1)TLC中Rf值为0.2的组分,合并共258mg,取230mg进行反相固相萃取分离,采用3根瓦里安Bond Elut C18固相萃取柱(每根柱体积60ml)相互并联,Mediwax 12管或24管真空固相萃取装置,湿法上样,以甲醇-水混合液作为洗脱液,依次按100%水→30%甲醇→70%甲醇→100%甲醇进行梯度洗脱,每一梯度洗脱3~5个柱体积,收集各梯度的洗脱液,得到100%水组分、30%甲醇组分、70%甲醇组分、100%甲醇组分;
3)取步骤2)中得到的30%甲醇组分用TLC鉴定:采用硅胶G254薄层板,体积比为10:1的氯仿-甲醇混合液作为展开剂,紫外灯下观察有明显显色点,表明30%甲醇组分中确实含有目标产物;将30%甲醇组分浓缩至干,得到粗品109mg;
4)取步骤3)中得到的粗品109mg,用甲醇配置成1mg/ml,采用HPLC进行纯化;HPLC条件为:岛津高效液相色谱仪制备系统;固定相:HPLC半制备柱YMC ODS-A,20×250mm,柱内径5μm;流动相:50%甲醇;流速:8ml/min;溶液传输单元:LC-6AD;进样器:SIL-10AP;进样量:1ml;检测器:光电二极管阵列检测器SPD-M20A;检测波长:210nm和254nm;收集15min大峰出现时的洗脱液,浓缩,即得所述之1-氢-3-吲哚甲醛21mg。
将得到的1-氢-3-吲哚甲醛用HPLC进行纯度分析,HPLC条件同实施例1;经检测,本实施例中得到的1-氢-3-吲哚甲醛纯度为95.5%。
本实施例中得到的1-氢-3-吲哚甲醛的MS数据、NMR数据同实施例1。
本领域普通技术人员可知,当本发明的技术参数在如下范围内变化时,可以预期得到与上述实施例相同或相近的技术效果:
一种从皱瘤海鞘中分离1-氢-3-吲哚甲醛的方法,包括:
1)取皱瘤海鞘,用乙醇浸提得到乙醇粗提物;乙醇粗提物用甲醇溶解后过滤,滤液浓缩得到粗提物溶液,按粗提物溶液与正相硅胶体积比为1:4~8的比例,用100~200目的正相硅胶进行柱层析;以二氯甲烷-甲醇混合液作为洗脱液,且依次按100%二氯甲烷→0.5~1.5%甲醇→8~12%甲醇→45~55%甲醇→100%甲醇进行梯度洗脱,每一梯度洗脱1~7个柱体积,分别收集每个柱体积的洗脱液,浓缩至干,进行TLC分离;所述TLC分离条件为:硅胶G254薄层板,展开剂为体积比8~12:1的二氯甲烷-甲醇混合液;
2)取步骤1)TLC中Rf值为0.15~0.25的组分,合并后进行反相固相萃取分离,采用Bond Elut C18固相萃取柱,真空固相萃取装置,湿法上样,以甲醇-水混合液作为洗脱液,且依次按100%水→25~35%甲醇→65~75%甲醇→100%甲醇进行梯度洗脱,每一梯度洗脱1~7个柱体积,收集各梯度的洗脱液,得到100%水组分、25~35%甲醇组分、65~75%甲醇组分、100%甲醇组分;
3)取步骤2)中得到的25~35%甲醇组分,浓缩至干,得到粗品;
4)取步骤3)中得到的粗品,用甲醇配置成0.8~1.2mg/ml,采用HPLC进行纯化;HPLC条件为:固定相:HPLC半制备柱ODS-A,20×250mm,柱内径5μm;流动相:45~55%甲醇;流速:6~10ml/min;进样量:0.95~1.05ml;检测器:检测波长:210nm和254nm;收集12~18min大峰出现时的洗脱液,浓缩,即得1-氢-3-吲哚甲醛。
所述步骤1)中,粗提物溶液与正相硅胶体积比为1:5.5~6.5;以二氯甲烷-甲醇混合液作为洗脱液,且依次按100%二氯甲烷→0.8~1.2%甲醇→9.5~10.5%甲醇→49~51%甲醇→100%甲醇进行梯度洗脱,每一梯度洗脱2~6个柱体积,分别收集每个柱体积的洗脱液,浓缩至干,进行TLC分离;所述TLC分离条件中,展开剂为体积比9~11:1的二氯甲烷-甲醇混合液。
所述步骤2)中,取步骤1)TLC中Rf值为0.18~0.22的组分;反向固相萃取分离中,以甲醇-水混合液作为洗脱液,且依次按100%水→29~31%甲醇→69~71%甲醇→100%甲醇进行梯度洗脱,每一梯度洗脱2~6个柱体积,收集各梯度的洗脱液,得到100%水组分、29~31%甲醇组分、69~71%甲醇组分、100%甲醇组分。
所述步骤3)中,取步骤2)中得到的29~31%甲醇组分,浓缩至干,得到粗品。
所述步骤4)中,取步骤3)中得到的粗品,用甲醇配置成0.9~1.1mg/ml;HPLC条件中,流动相:49~51%甲醇;流速:7~9ml/min;溶液传输单元:LC-6AD;进样器:SIL-10AP;进样量:0.95~1.05ml;检测器:光电二极管阵列检测器SPD-M20A;收集14~16min大峰出现时的洗脱液,浓缩,即得所述之1-氢-3-吲哚甲醛。
所述步骤1)中,用乙醇浸提得到乙醇粗提物的方法为:取皱瘤海鞘,阴干,切碎,向切碎后皱瘤海鞘中加入1~1.5倍体积的乙醇,置均质机中破碎后,浸提6~8d,浸提液取出备用;重新加入1~1.5倍体积的乙醇,浸提2~4d后,浸提液取出备用;再次加入1~1.5倍体积的乙醇,浸提2~4d后,浸提液取出备用;三次得到的的浸提液相互合并,回收溶剂,即得乙醇粗提物。
所述浸提过程中,每天超声振动提取0.5~2h。
所述步骤1)中,正相硅胶型号为SY01。
所述步骤2)中,真空固相萃取装置为12管或24管真空固相萃取装置。
所述步骤2)中,所述固相萃取柱为若干根固相萃取柱并联。
以上所述,仅为本发明较佳实施例而已,故不能依此限定本发明实施的范围,即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰,皆应仍属本发明涵盖的范围内。
Claims (10)
1.一种从皱瘤海鞘中分离1-氢-3-吲哚甲醛的方法,其特征在于:包括:
1)取皱瘤海鞘,用乙醇浸提得到乙醇粗提物;乙醇粗提物用甲醇溶解后过滤,滤液浓缩得到粗提物溶液,按粗提物溶液与正相硅胶体积比为1:4~8的比例,用100~200目的正相硅胶进行柱层析;以二氯甲烷-甲醇混合液作为洗脱液,且依次按100%二氯甲烷→0.5~1.5%甲醇→8~12%甲醇→45~55%甲醇→100%甲醇进行梯度洗脱,每一梯度洗脱1~7个柱体积,分别收集每个柱体积的洗脱液,浓缩至干,进行TLC分离;所述TLC分离条件为:硅胶G254薄层板,展开剂为体积比8~12:1的二氯甲烷-甲醇混合液;
2)取步骤1)TLC中Rf值为0.15~0.25的组分,合并后进行反相固相萃取分离,采用BondElut C18固相萃取柱,真空固相萃取装置,湿法上样,以甲醇-水混合液作为洗脱液,且依次按100%水→25~35%甲醇→65~75%甲醇→100%甲醇进行梯度洗脱,每一梯度洗脱1~7个柱体积,收集各梯度的洗脱液,得到100%水组分、25~35%甲醇组分、65~75%甲醇组分、100%甲醇组分;
3)取步骤2)中得到的25~35%甲醇组分,浓缩至干,得到粗品;
4)取步骤3)中得到的粗品,用甲醇配置成0.8~1.2mg/ml,采用HPLC进行纯化;HPLC条件为:固定相:HPLC半制备柱ODS-A,20×250mm,柱内径5μm;流动相:45~55%甲醇;流速:6~10ml/min;进样量:0.95~1.05ml;检测器:检测波长:210nm和254nm;收集12~18min大峰出现时的洗脱液,浓缩,即得1-氢-3-吲哚甲醛。
2.根据权利要求1所述的一种从皱瘤海鞘中分离1-氢-3-吲哚甲醛的方法,其特征在于:所述步骤1)中,粗提物溶液与正相硅胶体积比为1:5.5~6.5;以二氯甲烷-甲醇混合液作为洗脱液,且依次按100%二氯甲烷→0.8~1.2%甲醇→9.5~10.5%甲醇→49~51%甲醇→100%甲醇进行梯度洗脱,每一梯度洗脱2~6个柱体积,分别收集每个柱体积的洗脱液,浓缩至干,进行TLC分离;所述TLC分离条件中,展开剂为体积比9~11:1的二氯甲烷-甲醇混合液。
3.根据权利要求2所述的一种从皱瘤海鞘中分离1-氢-3-吲哚甲醛的方法,其特征在于:所述步骤2)中,取步骤1)TLC中Rf值为0.18~0.22的组分;反向固相萃取分离中,以甲醇-水混合液作为洗脱液,且依次按100%水→29~31%甲醇→69~71%甲醇→100%甲醇进行梯度洗脱,每一梯度洗脱2~6个柱体积,收集各梯度的洗脱液,得到100%水组分、29~31%甲醇组分、69~71%甲醇组分、100%甲醇组分。
4.根据权利要求3所述的一种从皱瘤海鞘中分离1-氢-3-吲哚甲醛的方法,其特征在于:所述步骤3)中,取步骤2)中得到的29~31%甲醇组分,浓缩至干,得到粗品。
5.根据权利要求4所述的一种从皱瘤海鞘中分离1-氢-3-吲哚甲醛的方法,其特征在于:所述步骤4)中,取步骤3)中得到的粗品,用甲醇配置成0.9~1.1mg/ml;HPLC条件中,流动相:49~51%甲醇;流速:7~9ml/min;溶液传输单元:LC-6AD;进样器:SIL-10AP;进样量:0.95~1.05ml;检测器:光电二极管阵列检测器SPD-M20A;收集14~16min大峰出现时的洗脱液,浓缩,即得所述之1-氢-3-吲哚甲醛。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的一种从皱瘤海鞘中分离1-氢-3-吲哚甲醛的方法,其特征在于:所述步骤1)中,用乙醇浸提得到乙醇粗提物的方法为:取皱瘤海鞘,阴干,切碎,向切碎后皱瘤海鞘中加入1~1.5倍体积的乙醇,置均质机中破碎后,浸提6~8d,浸提液取出备用;重新加入1~1.5倍体积的乙醇,浸提2~4d后,浸提液取出备用;再次加入1~1.5倍体积的乙醇,浸提2~4d后,浸提液取出备用;三次得到的的浸提液相互合并,回收溶剂,即得乙醇粗提物。
7.根据权利要求6所述的一种从皱瘤海鞘中分离1-氢-3-吲哚甲醛的方法,其特征在于:所述浸提过程中,每天超声振动提取0.5~2h。
8.根据权利要求1至5中任一项所述的一种从皱瘤海鞘中分离1-氢-3-吲哚甲醛的方法,其特征在于:所述步骤1)中,正相硅胶型号为SY01。
9.根据权利要求1至5中任一项所述的一种从皱瘤海鞘中分离1-氢-3-吲哚甲醛的方法,其特征在于:所述步骤2)中,真空固相萃取装置为12管或24管真空固相萃取装置。
10.根据权利要求1至5中任一项所述的一种从皱瘤海鞘中分离1-氢-3-吲哚甲醛的方法,其特征在于:所述步骤2)中,所述固相萃取柱为若干根固相萃取柱并联。
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