CN114989185A - 一种千金藤素的提取制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种采用山乌龟提取制备千金藤素的方法，包括原料提取、萃取、硅胶柱层析、重结晶四个步骤，工艺步骤少，生产周期较短，操作简单，成本低，易于放大生产。

Description

一种千金藤素的提取制备方法
技术领域
本发明涉及一种天然产物的提取方法，具体涉及一种从山乌龟中提取制备千金藤素的方法，属于天然产物提取领域。
背景技术
山乌龟为防己科千金藤属StephaniaLour植物的块根，此块根硕大露于地面，故名山乌龟，主产于长江流域及以南各地，为民间常用药。其中一种山乌龟((Stephaniaepigaea)主用于提升白细胞、清热解毒、消炎止痛、毒蛇咬伤、无名肿毒等作用。其主要药用成分千金藤素(Cepharanthine)含量较高，用于肿瘤病人放射治疗或因苯等有机溶剂引起的白细胞减少，已取得良好效果。CN113046327A公开千金藤素在抗新冠病毒SARS COV 2方面表现出异常强的活性，因此具有广阔的应用前景。
千金藤素的分子结构式如下：
Figure BDA0003733845800000011
为更好地开发、利用山乌龟的药用价值，提高千金藤素的产量，降低千金藤素的生产成本，还需要深入研究千金藤素的提取制备技术。发明人长期研究千金藤素提取制备方法，在大量的试验研究中发现了千金藤素一种简便高效的提取制备方法，从而完成了本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种采用山乌龟提取千金藤素的方法，通过酸化的乙醇-水溶液提取-萃取-硅胶柱层析-重结晶的简单工艺制备得到克级至公斤级的千金藤素。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
提供一种采用山乌龟提取制备千金藤素的方法，包括如下步骤：
(1)原料提取：将山乌龟药材粉碎，加入10-40％酸性乙醇-水溶液回流提取2-3次，过滤并合并滤液，减压蒸馏除去乙醇后，采用大孔树脂富集，用醇溶液进行洗脱，收集醇洗液并浓缩得到原料提取液；
(2)萃取：取原料提取液，加水稀释后量取等体积乙酸乙酯萃取1-3次，弃乙酸乙酯层，水层用氢氧化钠调节pH至8-9，再加入等体积乙酸乙酯萃取2-3次，合并乙酸乙酯层并浓缩备用；
(3)硅胶柱层析：取浓缩后的乙酸乙酯萃取液，加入硅胶均匀拌样、烘干后，将样品加入硅胶柱层析中，用石油醚-乙酸乙酯-氨水体系梯度洗脱，通过薄层色谱进行监控，收集千金藤素流份，浓缩得到千金藤素粗品；
(4)重结晶：将层析得到的千金藤素粗品，分别加入乙醇加热溶解，放置结晶，得到的晶体重复本步骤操作2-3次得结晶的千金藤素。
在一实施方案中，步骤(1)中，回流提取时10-40％酸性乙醇-水溶液中所采用的酸的质量浓度为0.5％，10-40％酸性乙醇-水溶液的加入量为山乌龟药材质量的6-8倍。
在一实施方案中，步骤(1)中，所述10-40％酸性乙醇-水溶液为盐酸或硫酸。
在一实施方案中，步骤(1)中，所述大孔树脂为D101或AB-8。
在一实施方案中，步骤(1)中，所述醇溶液为60％-90％甲醇或乙醇。
在一实施方案中，步骤(3)中，所述硅胶柱层析装柱料为100-200目硅胶。
在一实施方案中，步骤(3)中，拌样硅胶与装柱硅胶比例为1:3或1:5。
在一实施方案中，步骤(3)中，所述氨水为0.1-0.2％氨水，由0.1-0.2体积份25％浓氨水与100体积份水配制而成；所述薄层色谱的薄层展开剂为6.8:3.2:1的正己烷/乙酸乙酯/甲醇，所述薄层色谱的显色剂为改良碘化铋钾。
本发明千金藤素含量的HPLC检测方法如下：
一、色谱条件：
1.色谱柱：Kromasil 4.6×250mm 5μm；
2.流动相：A：乙腈，B：pH＝8的三乙胺-水溶液，70％A、30％B等度洗脱；
3.流速：1.0ml/min；
4.检测波长：283nm；
5.进样量：10μl；
6.柱温：30℃。
二、样品配制：
1.对照品配制：精密称取千金藤素对照品5mg于100ml容量瓶中，加入50ml甲醇，超声溶解，超声10min，再加入45ml甲醇超声20min，冷却后加甲醇定容至100ml。
2.供试品配制：精密称取供试品适量(依含量而定称样量)于100ml容量瓶中，加入50ml甲醇，超声溶解，超声10min，再加入45ml甲醇超声20min，冷却后加甲醇定容至100ml。
三、样品测定
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各约10ml，弃去初滤液，注入液相色谱仪，20μl定量环定量，测定，外标法计算千金藤素的含量。
四、含量计算：
Figure BDA0003733845800000031
其中：M标样—为千金藤素标准品重量，
C标样—为千金藤素标准品含量，
A样品—为样品峰面积，
A标样—为千金藤素标准品峰面积，
M样品—为样品重量。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明通过酸化的乙醇-水溶液提取-萃取-硅胶柱层析-重结晶的简单工艺制备得到克级至公斤级的千金藤素，为千金藤素的抗新冠病毒研究提供了物质基础；
2、本发明利用千金藤素易溶于10-40％酸性乙醇-水溶液的特点，采用10-40％酸性乙醇-水溶液对药材进行提取，减少了脂溶性杂质的提取率，有利于进一步的纯化，并且避免了有机试剂的使用，对环境友好；
3、本发明采用10-40％酸性乙醇-水溶液提取除杂，碱性水溶液富集千金藤素工艺进一步除掉非生物碱类杂质，且萃取溶剂可以反复回收利用，节约了成本；
4、本发明硅胶柱层析中在石油醚-乙酸乙酯体系中加入0.1-0.2％氨水，提高了色谱分离度同时增强了对千金藤素的洗脱能力，提高了纯化效率；
5、本发明工艺步骤少，生产周期较短，操作简单，易于放大生产，且实验中使用的溶剂均可回收再利用极大的降低了成本。
附图说明
图1为山乌龟提取液的HPLC检测图谱；
图2为本发明实施例1制得的千金藤素HPLC图谱；
图3为本发明实施例2制得的千金藤素HPLC图谱。
具体实施方式
下面结合各实施例对本发明作进一步说明，本发明的方式包括但不仅限于以下实施例。
实施例1
本实施例提供一种采用山乌龟提取制备千金藤素的方法，包括如下步骤：
1)提取：将山乌龟10kg(药材的千金藤素含量0.47％)粉碎成30-40目粗粉，加入10倍量的含0.5％H2SO4的20％乙醇-水溶液，回流提取3次，每次2小时，合并提取液，过AB-8大孔树脂，分别用水和60％甲醇洗脱，收集醇洗液，浓缩至8L。
2)萃取：取步骤1)中浓缩后的提取液8L，加2倍水分散，加入等体积乙酸乙酯萃取3次，弃去乙酸乙酯层，水层用氢氧化钠调节pH至8-9，加入等体积乙酸乙酯萃取3次。合并乙酸乙酯层，浓缩至1.2L。
3)硅胶柱层析：取乙酸乙酯萃取液1.2L，加入1kg硅胶均匀拌样，烘干。将拌样后的样品加入100-200目硅胶柱层析中，用石油醚(60℃-90℃)-乙酸乙酯-氨水体系依次按体积比30:1:0.1、10:1:0.1、5:1:0.05、3:1:0.02进行梯度洗脱(氨水为0.1％氨水，由0.1体积份25％浓氨水与100体积份水配制而成)，通过薄层色谱进行监控，收集千金藤素流份，浓缩。本方法中使用的拌样硅胶与装柱硅胶比例为1:5，所用薄层展开剂为正己烷:乙酸乙酯:甲醇(6.8:3.2:1)，氨蒸气饱和环境下，喷以改良碘化铋钾显色。
4)取上述步骤中的浓缩后固体，分别加入乙醇加热溶解，放置结晶。晶体重复上述操作2次得千金藤素结晶42.3g，纯度99.72％。
实施例2
本实施例提供一种采用山乌龟提取千金藤素的方法，包括如下步骤：
1)提取：将山乌龟100kg(药材的千金藤素含量0.45％)粉碎成30-40目粗粉，加入6倍量的含0.5％HCl的40％乙醇-水溶液，回流提取4次，每次2小时，合并提取液，过D101大孔树脂，分别用水和95％乙醇醇洗脱，收集醇洗液，浓缩至106L。
2)萃取：取步骤1)中浓缩后的提取液106L，加2倍水分散，加入等体积乙酸乙酯萃取3次，弃去乙酸乙酯层，水层用氢氧化钠调节pH至8-9，加入等体积乙酸乙酯萃取4次。合并乙酸乙酯层，浓缩至17L。
3)硅胶柱层析：取乙酸乙酯萃取液17L，加入20kg硅胶均匀拌样，烘干。将拌样后的样品加入100-200目硅胶柱层析中，用石油醚(60℃-90℃)-乙酸乙酯-氨水体系依次按体积比30:1:0.1、10:1:0.05、5:1:0.02、3:1:0.01进行梯度洗脱(氨水为0.2％氨水，由0.2体积份25％浓氨水与100体积份水配制而成)，通过薄层色谱进行监控，收集千金藤素流份，浓缩。本方法中使用的拌样硅胶与装柱硅胶比例为1:3，所用薄层展开剂为正己烷:乙酸乙酯:甲醇(6.8:3.2:1)，氨蒸气饱和环境下，喷以改良碘化铋钾显色。
4)取上述步骤中的浓缩后固体，分别加入乙醇加热溶解，放置结晶。晶体重复上述操作2次得千金藤素结晶0.4188kg，纯度99.38％。

Claims (8)

1.一种采用山乌龟提取制备千金藤素的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)原料提取：将山乌龟药材粉碎，加入10-40％酸性乙醇-水溶液回流提取2-3次，过滤并合并滤液，减压蒸馏除去乙醇后，采用大孔树脂富集，用醇溶液进行洗脱，收集醇洗液并浓缩得到原料提取液；(2)萃取：取原料提取液，加水稀释后量取等体积乙酸乙酯萃取1-3次，弃乙酸乙酯层，水层用氢氧化钠调节pH至8-9，再加入等体积乙酸乙酯萃取2-3次，合并乙酸乙酯层并浓缩备用；(3)硅胶柱层析：取浓缩后的乙酸乙酯萃取液，加入硅胶均匀拌样、烘干后，将样品加入硅胶柱层析中，用石油醚-乙酸乙酯-氨水体系梯度洗脱，通过薄层色谱进行监控，收集千金藤素流份，浓缩得到千金藤素粗品；(4)重结晶：将层析得到的千金藤素粗品，分别加入乙醇加热溶解，放置结晶，得到的晶体重复本步骤操作2-3次得结晶的千金藤素。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，回流提取时10-40％酸性乙醇-水溶液中所采用的酸的质量浓度为0.5％，10-40％酸性乙醇-水溶液的加入量为山乌龟药材质量的6-8倍。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述10-40％酸性乙醇-水溶液中的酸为盐酸或硫酸。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述大孔树脂为D101或AB-8。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述醇溶液为60％-90％甲醇或乙醇。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述硅胶柱层析装柱料为100-200目硅胶。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，拌样硅胶与装柱硅胶比例为1:3或1:5。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述氨水为0.1-0.2％氨水，由0.1-0.2体积份25％浓氨水与100体积份水配制而成；所述薄层色谱的薄层展开剂为6.8:3.2:1的正己烷/乙酸乙酯/甲醇，所述薄层色谱的显色剂为改良碘化铋钾。
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