CN103271934A - 一种含有生物碱类活性成分的海参提取物及其提取方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种含有生物碱类活性成分的海参提取物及其提取方法和应用。该海参提取物由如下方法提取得到：取海参粉加56℃蒸馏水搅拌；浸出液经离心，弃沉渣；上清液过滤膜过滤，滤液经超滤膜超滤；超滤外液经纳滤膜浓缩，得纳滤浓缩内液；浓缩液经旋转蒸发再浓缩；将其过大孔树脂柱；蒸馏水洗脱，弃洗脱峰；再经30%乙醇洗脱，取洗脱峰；蒸发浓缩后，过DA25阴离子柱层析，取活性成分峰，冷冻干燥；得含有H2a、H2b、H2c、H2d、H2e五个生物碱类活性成分的冻干粉。实验证明本发明的海参提取物及所含的生物碱类化合物有治疗贫血、免疫功能低下、创伤及疲劳的恢复、放化疗后的免疫修复等潜在用途。

Description

一种含有生物碱类活性成分的海参提取物及其提取方法和应用

技术领域

本发明涉及含有来源于动物体生物碱类活性成分的提取物，尤其涉及含有与肌苷、腺苷、鸟苷、尿苷和脱氧胸苷为立体异构体的生物活性物质的海参提取物及其提取方法和应用。同时，也涉及来源于动物体的有效成分为主的医药配制品。

背景技术

海参纲(Holothuroidea或Holothurioidea)是棘皮动物门（Echinodermata）中经济意义最大的一纲。其中楯手目分3个科(辛那参科Synallatidae、海参科Holothuriidae、刺参科Stichopodidae)，刺参科又分3个属（仿刺参属Apostichopus、刺参属Stichopus、梅花参属Thelenota）。仿刺参属(刺参)Apostichopus japonicus在辽宁大连、旅顺、海洋岛及山东沿海地区有广泛分布。我国自古以来将其作为佐膳珍品。中医认为：“其性温补，足敌人参，故曰海参”。海参味甘性温，有补肾经。益精髓、消痰涎、壮阳疗萎之功，是滋补、健身、治病、防老之佳品。现代药理研究表明海参有抗凝血、抗血栓、降血脂、降低血粘度、抗肿瘤、免疫调节、抗菌及促细胞生长等多种药理活性。

从海参的化学和活性的研究来看，有效成分研究多集中在粘多糖和蛋白多糖、海参皂甙（海参素）及海参多肽。其中海参粘多糖有抗凝、降血脂等作用^[1,2]。海参皂甙有造血、抑瘤、抗真菌等活性^[3,4,5]。海参多肽则有抗氧化等^[6]。偶有研究报道了海参次生代谢物质的成分，提到了分离到尿嘧啶、胸腺嘧啶、胸腺嘧啶脱氧核苷、腺嘌呤核苷等物质，但并没有与标准品在结构及活性方面比较研究的相关报道^[7]。在诸多海参的化学成分中哪些成分可以作为海参的主要有效成分，这一问题目前仍在探讨中。

海参产地和品种众多，如何对海参质量进行评价？另外，以海参为原料的药品及食品的质量如何评价？显然，质量的评价应该以海参的活性成分的化学性质相关，以确保海参的质量和以海参为原料的药品及食品的质量及安全。同时，海参制剂的制备方法各不相同。如果不清楚海参的主要有效成分，不知道这些有效成分的化学性质，在提取过程中将带有极大的盲目性，有可能造成有效成分的损失及资源的浪费。目前，由于海参的主要活性成分及药理活性仍在探讨中，海参质量尚没有相关的评价标准。在本发明中，从海参活性部分的总提取物中，分离到5种单体化合物H2a、H2b、H2c、H2d、H2e。经二维核磁共振谱分析，它们分别是肌苷、腺苷、鸟苷、尿苷和脱氧胸苷的立体异构体。经与标准品比较，提取物有广泛的药理活性，而标准品则无活性。这些提取物的化学性质及特征，可能成为海参质量的评价标准之一。

目前，在食品或医药制剂领域，已有很多海参产品，但在产品的制备中，海参有效成分的提取工艺及相关制剂多围绕已有的研究成果和一些概念去研发。其中，海参的制剂以海参的全成分胶囊为主的较多^[8,9]。海参多肽是以酶解的方法使蛋白水解成小肽，近年有关制剂的胶囊产品较多^[10,11]。但未见有关活性海参多肽的单体分离，及氨基酸序列分析的报道。海参多糖是研究最多的活性成分之一,海参的多糖提取物作为制剂的专利也最多^{[12,13,14,15,16]}。其他还有用海参皂甙提取工艺作为制剂的原料^[17,18]。因尚不清楚海参的主要活性成分以及有效成分药理作用的有效剂量范围。因此，目前海参制剂的各种提取工艺及其制剂均存在问题，有可能造成浪费的资源，而且各种制剂的有效剂量也无法定量。这些问题给海参在药品及食品的应用中带来一定的盲目性。本发明在海参活性成分清楚的前提下，对其在提取物中的含量进行了定量，对有效剂量范围进行实验验证。

参考文献

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发明内容

本发明提供一种含有生物碱类活性成分的海参提取物及其制备方法和其在医药制剂领域中的应用。本发明的海参提取物中含有与肌苷、腺苷、鸟苷、尿苷和脱氧胸苷为立体异构体的生物碱类活性物质，该生物碱类活性物质为首次由海参中分离出的化合物，具有抗疲劳，提高机体免疫机能等生物活性，在医药及保健品领域具有潜在的应用前景。

本发明的一种含有生物碱类活性成分的海参提取物，含有生物碱类化合物H2a、H2b、H2c、H2d和H2e；

所述海参提取物，按如下步骤提取得到：

（1）取海参粉，按1.25-5%（g/v）加蒸馏水，56℃搅拌4小时，置冰箱冷藏过夜，浸出液经6000rpm离心40分钟，弃沉渣；

（2）浸出液上清过0.8-1.2μ的滤膜过滤，滤液过3KD-10KD超滤膜超滤，超滤外液再过纳滤膜纳滤浓缩，得纳滤浓缩内液；

（3）纳滤浓缩液经56℃旋转蒸发浓缩，得浓缩液；

（4）将步骤（3）的浓缩液过D101大孔树脂柱层析，洗脱液为蒸馏水，弃洗脱峰，换30%乙醇洗脱，收集洗脱峰，56℃经旋转蒸发浓缩，浓缩液经DEAE-葡聚糖凝胶A25阴离子柱层析，洗脱液为蒸馏水,收集洗脱峰，56℃经旋转蒸发浓缩，冷冻干燥，得含有H2a、H2b、H2c、H2d和H2e的海参提取物冻干粉。

本发明所述海参提取物冻干粉，再经液相制备色谱分离，分别得到H2a、H2b、H2c、H2d和H2e五个化合物。

在本发明优选技术方案中，所述的H2a、H2b、H2c、H2d和H2e分别占海参提取物总重量的2.5%、11.3%、3.8%、6.6%和1.3%。

在本发明的优选技术方案中，在步骤（2）中，浸出液上清过0.8μ滤膜过滤，滤液过10KD超滤膜超滤，超滤外液再过纳滤膜纳滤浓缩。

单体化合物H2a、H2b、H2c、H2d和H2e分别为已知化合物肌苷（Inosine）、腺苷（Adenosine）、鸟苷（Guanosine）、尿苷（Uridine）和脱氧胸苷（Thymidine）的立体异构体。经对单体化合物H2a、H2b、H2c、H2d、H2e的波谱分析，其化学结构式分别为：

①H2a分子式为C₁₀H₁₂N₄O₅；分子量=268.22；白色粉末，结构式为：

其中，“﹡”所处的N-H键为未定义立体键。

②H2b分子式为C₁₀H₁₃N₅O₄；分子量=267.24；白色粉末，结构式为：

其中“﹡”所处的C-OH键为未定义立体键。

③H2c分子式为C₁₀H₁₃N₅O₅；分子量=283,24；白色粉末，结构式为：

其中“﹡”所处的C-OH键为未定义立体键。

④H2d分子式为C₉H₁₂N₂O₆；分子量=244.20；白色粉末，结构式为：

其中“﹡”所处的N-H键和N-C键为未定义立体键。

⑤H2e分子式为C₁₀H₁₄N₂O₅；分子量=242.23；白色粉末，结构式为：

其中“﹡”所处的N-H键和C-OH键为未定义立体键。

H2a、H2b、H2c、H2d和H2e样品与其标准品肌苷、腺苷、鸟苷、尿苷和脱氧胸苷波谱比较，其化合物结构在二维核磁共振谱上有差别，主要表现在结构上N-H、C-H键角有变化，从而造成结构上的差别。

H2a、H2b、H2c、H2d和H2e与其相应的化合物肌苷、腺苷、鸟苷、尿苷和脱氧胸苷的生物活性存在着显著的差别。H2a、H2b、H2c、H2d和H2e可以表达海参药理活性，其有效剂量范围与相应的细胞刺激因子和生长因子相同。H2a、H2b、H2c、H2d和H2e对由5-氟尿嘧啶（5-FU）处理的小鼠骨髓间充质干细胞的增殖均有刺激作用，与巨噬细胞-粒细胞集落刺激因子（GM-CSF）相似，而肌苷、腺苷、鸟苷、尿苷和脱氧胸苷没有活性。H2a、H2b、H2c、H2d和H2e可以刺激低氧/再给氧损伤的心肌细胞代谢活性，但肌苷、腺苷、鸟苷、尿苷和脱氧胸苷无活性。H2a、H2b、H2c、H2d可以活化小鼠腹腔巨噬细胞增殖，提高巨噬细胞的吞噬功能。H2a、H2b、H2c、H2d可以刺激小鼠脾细胞的增殖。H2a、H2b、H2d可以促进Mo7e（一种细胞因子依赖性细胞株）细胞的增殖。H2a、H2b、H2d样品组对角膜缘干细胞增殖均有刺激作用，与成纤维细胞生长因子（FGF）作用相似。可知，H2a、H2b、H2c、H2d和H2e对皮肤、粘膜的创伤及溃疡、贫血及免疫功能低下、放化疗后的免疫修复及疲劳的恢复等均有潜在用途。

本发明还提供用本发明的提取方法得到的含有生物碱类活性成分的海参提取物在制备治疗贫血、创伤及疲劳的恢复、免疫功能低下和放、化疗后的免疫修复的药物中的应用。

所述海参提取物，可作为保健或功能食品及饮料的添加剂，可与相应药用载体结合制备成各种剂型,包括如下医药剂型：

（1）注射剂，0.075mg/只，敷料为注射用水，用于肌肉或静脉注射；

（2）片剂，0.075mg/片，敷料为药用淀粉，用于内服；

（3）胶囊剂，0.075mg/粒，用药用胶囊装入，用于内服；

（4）栓剂，0.050mg/枚，辅料为水溶性基质，用于肛门及阴道；

（5）气雾剂，0.010mg/mL，辅料为抛射剂，用于呼吸道；

（6）滴眼剂，0.010mg/mL，辅料为缓冲液，用于眼部疾患的水剂和软膏；

（7）微球，0.075mg/粒，辅料为包衣材料，用于消化道疾患；

（8）贴剂，0.020mg/片，辅料为沾合剂，用于口腔粘膜疾患。

本发明的突出特点是：（1）发现了在海参中前人从未发现的、与已知化合物肌苷、腺苷、鸟苷、尿苷和脱氧胸苷为立体异构体的化合物H2a、H2b、H2c、H2d和H2e，并有效的提取和分离出来。（2）检定了H2a、H2b、H2c、H2d和H2e与相对应的肌苷、腺苷、鸟苷、尿苷和脱氧胸苷在结构上的差异。（3）验证了由于这种结构上的差异，导致其之间生物活性的显著差异，以及有效剂量范围。使得H2a、H2b、H2c、H2d和H2e在医药学上有着极为可观的潜在用途。（4）在提取工艺上：（Ⅰ）采用膜分离技术提取和浓缩提取物,以保证化合物不受剧烈外界条件影响。（Ⅱ）使用纯水作溶剂，不存在其他离子掺入的问题。（Ⅲ）使用离子交换层析技术脱色素，并纯化活性成分，得到总提取物；本工艺可以最大限度的保留活性成分，减少有机溶剂的使用和残留。

具体实施方式

实施例1含有生物碱类活性成分的海参提取物的制备

取海参粉30克加蒸馏水2400毫升，56℃搅拌4小时，置冰箱冷藏过夜。浸出液经6000rpm离心40分钟，弃沉渣。浸出液上清过0.8μ滤膜过滤。滤液过10KD超滤膜超滤，得超滤外液。超滤外液过纳滤膜纳滤，得纳滤浓缩内液。浓缩内液经56℃旋转蒸发浓缩，得纳滤浓缩液。纳滤浓缩液过D101大孔树脂柱，洗脱液为蒸馏水，弃洗脱峰，换30%乙醇继续洗脱，收集洗脱峰，洗脱峰溶液经旋转蒸发浓缩后，过DEAE-葡聚糖凝胶A25（DA25）阴离子柱，洗脱液为蒸馏水，收集洗脱峰Ⅱ、Ⅲ，经56℃旋转蒸发浓缩，冷冻干燥，得含有生物碱类活性成分的海参提取物冻干粉（简称为海参提取物，HS）30mg。

HS用高效液相色谱仪分离（C18柱，流动相为甲醇:水:甲酸=7:93:0.1）得到含有生物碱类活性成分的各组分，各组分经旋转蒸发浓缩，冷冻干燥后得到单体化合物H2a(0.76mg)、H2b(3.4mg)、H2c(1.14mg)、H2d(1.98mg)和H2e(0.39mg)，共计7.67mg，占海参提取物（HS）重量的25%。

实施例2海参提取物及各单体化合物对5-氟尿嘧啶处理的模型小鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）增殖的影响

实验方法：取10只小鼠，尾静脉注射5-氟尿嘧啶（5-FU）150mg/kg体重，48小时后取股骨骨髓细胞,培养得到小鼠骨髓间充质干细胞（MSCs），培养方法参考文献。

细胞接种在96孔培养板中，细胞接种密度为1.0×10⁴个细胞/孔100μl，细胞接种24小时后换成无血清培养液。对照组加等体积培养液，阳性药物加入巨噬细胞-粒细胞集落刺激因子（GM-CSF），加药组分别加入样品海参提取物（HS）、H2a、H2b、H2c、H2d和H2e及相应的化合物标准品肌苷（Inosine）、腺苷（Adenosine）、鸟苷（Guanosine）、尿苷（Uridine）和脱氧胸苷（Thymidine），所有样品的终浓度均为100、10、1.0ng/ml三个剂量组。5%CO₂、37℃孵育24小时。在细胞培养结束前4h，每孔加入20μL MTT继续培养，4h后弃培养液，加入100μL100%二甲基亚砜。经微量振荡器振荡后，用自动酶标光度计测定570nm处各孔的A值，结果见表1和表2。

表1.海参提取物及各单体对5-FU处理的小鼠MSCs增殖的影响

对照组0.188±0.006，与对照组比较^*P<0.05,^**P<0.01,^***P<0.001,其余P>0.05。

表1结果表明，与对照组相比较，样品HS、H2a、H2b、H2c、H2d和H2e均有刺激模型小鼠MSCs细胞增殖的作用，在剂量范围100.0-1.0ng/ml之间均有效，其作用与GM-CSF的作用相似。

表2.海参提取物中单体与相应标准品比较对5-FU处理的小鼠MSCs增殖的影响

对照组0.160±0.004，与对照组比较^*P<0.05,^**P<0.01,^***P<0.001,其余P>0.05。

表2结果表明，与对照组相比较，样品H2a、H2b、H2c、H2d和H2e均有刺激模型小鼠MSCs细胞增殖的作用，在剂量范围100.0-1.0ng/ml之间均有效；而其相对应的标准品对小鼠MSCs细胞的增殖无刺激作用。

实施例3海参提取物及各单体化合物对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

实验方法：乳鼠心肌细胞培养：无菌操作取出生3d的乳鼠心脏，去除心包膜，取心尖部心肌组织剪成1mm3小块，用D-Hank’s液冲洗2遍，加入0.125%胰蛋白酶，37℃消化20min。将组织块吹打制备成细胞悬液，离心10min弃上清。加入D-Hank’s液，离心10min弃上清洗涤两遍。细胞悬液加入含15%胎牛血清的DMEM培养液，置25ml培养瓶。37℃培养60分钟。取培养液中细胞，弃贴壁细胞。经差速贴壁纯化后的心肌细胞再次制备成细胞悬液，接种至96孔培养板，置5%CO₂培养箱37℃培养。

缺氧/复氧模型建立：原代培养的心肌细胞经胰酶消化，加入低糖培养液制成细胞悬液，接种在96孔培养板中，细胞数密度为3×10⁵个细胞/孔，同时加入不同浓度的受试样品。对照组加入等体积培养液，实验组分别加入样品海参提取物（HS）、H2a、H2b、H2d、H2e及其相应的化合物标准品肌苷（Inosine）、腺苷（Adenosine）、尿苷（Uridine）和脱氧胸苷（Thymidine）。所有样品的终浓度均为100、10、1ng/ml三个剂量组。低氧条件为5%CO₂、3%O₂、92%N₂，37℃培养，饱和湿度下，细胞与受试样品共同孵育2h后，恢复常氧条件及5%CO₂，37℃继续孵育2h。终止培养，加入含5%MTT的培养液100μl，继续孵育4h，弃培养液后，加入100μL 100%二甲基砜，经微量震荡器震荡后，用自动酶标光度计测定570nm处各孔的A₅₇₀值，以A₅₇₀值表示线粒体脱氢酶活性。结果见表3和表4。

表3.海参提取物及各单体对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤后线粒体脱氢酶活性的影响

对照组0.156±0.005，与对照组比较^*P<0.05,^**P<0.01,^***P<0.001,其余P>0.05。

表4.海参提取物中各单体与相应标准品比较对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤后线粒体脱氢酶活性的影响

对照组0.149±0.006，与对照组比较^*P<0.05,^**P<0.01,^***P<0.001,其余P>0.05.

表3和表4的结果表明，样品HS、H2a、H2b、H2c、H2d和H2e，均能提高缺氧/复氧损伤后乳鼠心肌细胞的脱氢酶活性，对缺氧/复氧损伤后的乳鼠心肌细胞均有一定的保护作用，在剂量范围100.0-1.0ng/ml之间均有效，而其相对应的标准品则无影响。

实施例4海参提取物及各单体化合物对小鼠腹腔巨噬细胞（MΦ）增殖及吞噬功能的影响

实验方法：巨噬细胞增殖活性实验：昆明种小鼠（18～22g），抽取腹腔巨噬细胞。将细胞调整至2×10⁶/ml，接种于96孔培养板中，100μL/孔。在5%CO₂、37℃培养箱中培养。细胞培养液为Eagle MEM。培养24小时后，弃上清液，加入100μL/孔的无血清培养液。按实验分组加入各组样品，其中，加药组分别加入样品海参提取物（HS）、H2a、H2b、H2d，阳性药物组加入巨噬细胞-粒细胞集落刺激因子（GM-CSF），每个样品的终浓度均设100.0、10.0、1.0μg/mL三个剂量组，每个剂量设3个平行孔，对照组加入等体积的培养液。所述加药组，和对照组均含有终浓度为10μg/mL细菌粘多糖（LPS）。分组加药的巨噬细胞，在饱和湿度条件下，37℃、5%CO₂孵育24h。在细胞培养结束前4h，每孔加入20μL MTT继续培养，4h后中止反应，弃培养液，加入100μL 100%二甲基亚砜。经微量振荡器振荡后，用自动酶标光度计测定570nm处各孔的A₅₇₀值，结果见表5。

巨噬细胞吞噬中性红试验：按上述方法分组加药的巨噬细胞经37℃孵育24h后，每孔加入中性红生理盐水液，终浓度为1g/L，继续培养20min。细胞经PBS洗涤3遍，每孔加入细胞溶解液（乙酸﹕无水乙醇=50﹕50）100μL，室温放置2h。待细胞溶解后，用自动酶标光度计测各孔吸光度A₅₄₀值，测量波长540nm，以A₅₄₀值表示巨噬细胞吞噬功能的强弱，结果见表6和表7。

表5.海参提取物中各组分对小鼠腹腔巨噬细胞（MΦ）增殖的影响

对照组0.062±0.009。与对照组比较^*P<0.05,^**P<0.01,^***P<0.001,其余P>0.05。

表5结果表明，样品H2a、H2b和H2d对小鼠巨噬细胞增殖均有刺激作用，其作用与GM-CSF相似，在剂量范围100.0-1.0ng/ml之间均有效。

表6.海参提取物及各单体对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响

对照组0.084±0.005，与对照组比较^*P<0.05,^**P<0.01,^***P<0.001,其余P>0.05。

表6结果表明，样品HS、GM-CSF和各单体化合物均提高小鼠巨噬细胞吞噬功能，剂量范围100.0-1.0ng/ml之间均有显著刺激作用。

表7.海参提取物及各单体的标准品对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响

对照组0.090±0.007，与对照组比较*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,其余P>0.05.

表7结果表明，样品HS、GM-CSF均提高小鼠巨噬细胞吞噬功能，但各单体化合物相应的标准品则无刺激活性。

实施例5海参提取物及各单体化合物对小鼠脾细胞增殖的影响

实验方法：脾细胞悬液制备：昆明种小白鼠10只，无菌取脾，放置在无血清的PRMI－1640培养液中，去除包膜和结缔组织，置青瓶中，将脾剪成1mm³小块，用注射器芯研磨至单个细胞，过200目尼龙网，1000rpm,离心10min，双蒸水每支试管加5mL，轻轻吹打，放置20秒，加2倍浓缩的生理盐水混均，1000rpm,离心10min，Hank’s液冲洗重复两次，再过一次200目尼龙网，制成脾细胞悬液，密度为1×10⁸/mL备实验用。

按实验分组加入各组样品，其中加药组分别加入样品海参提取物（HS）、H2a、H2b、H2d，阳性药物组加入集落刺激因子（GM-CSF），对照组加入等体积培养液，每个样品设终浓度为100.0、10.0、1.0μg/mL的三个剂量组，每个剂量设3个平行孔。5%CO₂、37℃孵育24小时。在细胞培养结束前4h，每孔加入20μL MTT继续培养。培养4h后弃培养液，加入100μL100%二甲基亚砜，经微量振荡器振荡后，用自动酶标光度计测定570nm处各孔的A₅₇₀值，结果见表8。

表8.海参提取物及各单体对小鼠脾细胞增殖的影响

对照组0.098±0.007。与对照组比较^*P<0.05,^**P<0.01,^***P<0.001,其余P>0.05。

表8结果表明，与对照组相比较，样品HS、H2a、H2b和H2d在100.0-1.0ng/mL范围内对脾细胞增殖均有刺激作用，其作用与GM-CSF相似。

实施例6海参提取物及各单体化合物对Mo7e细胞增殖的影响

实验方法：取生长状态良好的Mo7e细胞株（人巨细胞白血病细胞株），制成细胞悬液，以1.0×10⁴/孔100μl接种在96孔培养板中，按实验分组加入各组样品，加入量为20μL，其中加药组分别加入样品海参提取物（HS）、H2a、H2b和H2d，阳性对照组加入GM-CSF，对照组加入等体积培养液。每个样品分别设终浓度为100.0、10.0、1.0μg/mL的三个剂量组，每个剂量设三个复孔。加药处理后的细胞在含5%CO₂，37℃饱和湿度下孵育24小时后，加入XTT/PMS（终浓度为0.2mg/mL XTT和25μmoL/LPMS）溶液25μL，继续培养6小时后，酶标仪测定各孔光密度值(OD)。λ_测量=450nm，λ_参考=620nm。数据经“t”显著性检验，结果见表9。

表9.海参提取物及各单体对Mo7e细胞增殖的影响

对照组0.028±0.006。与对照组比较^*P<0.05,^**P<0.01,^***P<0.001,其余P>0.05。

表9结果表明，与对照组相比较，样品HS、H2a、H2b和H2d在100.0-1.0ng/mL范围内均有刺激Mo7e细胞增殖的作用，其作用与GM-CSF的作用相似。

实施例7海参提取物中各单体化合物对角膜缘干细胞增殖的影响

实验方法：角膜缘干细胞的分离培养：日本大耳白兔,无菌条件下取全眼球，沿角膜缘外1mm处环形剪下角膜，摘除晶状体、虹膜、除去多余巩膜组织，完整角膜片放入Hank’s液培养皿中液洗涤两次，从角膜缘内侧1mm处环形剪下角膜缘，除去内皮层和多余固有层，将角膜缘上皮组织尽量剪碎，再用0.25%胰蛋白酶和0.2%EDTA（1：1）消化，37℃消化30min，加入Hank’s液碎打，1000rpm/分钟,离心5min，冲洗2次，用含15%胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的DMEM/F12培养液制备成细胞悬液，接种至培养瓶中，3天换培养液一次，等细胞铺满瓶底备实验用。

细胞接种在96孔培养板中，细胞接种密度为1.0×10⁴个细胞/孔100μL，细胞接种24小时后换成无血清培养液。对照组加等体积培养液，阳性对照组加入成纤维细胞生长因子（FGF），加药组分别加入样品H2a、H2b、H2d。每个加入样品分别设终浓度为100、10、1ng/mL的3个剂量组，每个剂量组4个平行孔。5%CO₂、37℃孵育24小时。在细胞培养结束前4h，每孔加入10μL MTT继续培养，4h后弃培养液，加入100μL 100%二甲基亚砜。经微量振荡器振荡后，用自动酶标光度计测定570nm处各孔的A₅₇₀值。结果见表10。

表10.海参提取物中各单体对角膜缘干细胞增殖的影响

对照组0.044±0.002。各组与对照组比较^*P<0.05,^**P<0.01,^***P<0.001其余P>0.05。

表10的结果表明，H2a、H2b、H2d样品组剂量在10.0-1.0ng/mL范围内对角膜缘干细胞增殖均有刺激作用，其作用与FGF作用相似。

实施例8含有海参提取物的制剂

以下含有海参提取物(HS)（含H2a、H2b、H2c、H2d和H2e成分）的制剂，可作为保健或功能食品及饮料的添加剂，可与相应药用载体结合制备成各种剂型。应用于皮肤、粘膜的炎症溃疡，贫血及白细胞降低，免疫功能下降，运动后的体力恢复，放化疗后的免疫修复。见表11。

表11.海参提取物药物剂型品种、使用途径

Claims (5)

1.一种含有生物碱类活性成分的海参提取物，其特征在于，含有以下结构的化合物；

其中“*”所处的N-H、C-OH或N-C健为未定义的立体键。

2.如权利要求1所述的含有生物碱类活性成分的海参提取物的提取方法，包括如下步骤：

（1）取海参粉，按1.25-5%（g/v）加蒸馏水，56℃搅拌4小时，置冰箱冷藏过夜，浸出液经6000rpm离心40分钟，弃沉渣；

（2）浸出液上清过0.8～1.2μ滤膜过滤，滤液过3KD～10KD超滤膜超滤，超滤外液再过纳滤膜纳滤浓缩，得纳滤浓缩内液；

（3）纳滤浓缩液经56℃旋转蒸发浓缩，得浓缩液；

（4）将步骤（3）的浓缩液过D101大孔树脂柱层析，洗脱液为蒸馏水，弃洗脱峰，换30%乙醇洗脱，收集洗脱峰；56℃经旋转蒸发浓缩，浓缩液经DEAE-葡聚糖凝胶A25阴离子柱层析，洗脱液为蒸馏水,收集洗脱峰；56℃经旋转蒸发浓缩，冷冻干燥，得含有H2a、H2b、H2c、H2d和H2e的海参提取物冻干粉。

3.根据权利要求2所述的海参提取物的提取方法，其特征在于，在所述步骤（2）中，浸出液上清过0.8μ滤膜过滤，滤液过10KD超滤膜超滤，超滤外液再过纳滤膜纳滤浓缩。

4.权利要求1所述的海参提取物的应用，其特征在于，所述海参提取物在制备治疗贫血、皮肤和粘膜的创伤及疲劳的恢复、免疫功能低下、放化疗后的免疫修复药物中的应用。

5.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述海参提取物有如下医药剂型：

（1）注射剂，0.075mg/只，敷料为注射用水，用于肌肉或静脉注射；

（2）片剂，0.075mg/片，敷料为药用淀粉，用于内服；

（3）胶囊剂，0.075mg/粒，用药用胶囊装入，用于内服；

（4）栓剂，0.050mg/枚，辅料为水溶性基质，用于肛门及阴道；

（5）气雾剂，0.010mg/mL，辅料为抛射剂，用于呼吸道；

（6）滴眼剂，0.010mg/mL，辅料为缓冲液，用于眼部疾患的水剂和软膏；

（7）微球，0.075mg/粒，辅料为包衣材料，用于消化道疾患；

（8）贴剂，0.020mg/片，辅料为沾合剂，用于口腔粘膜疾患。