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一种海参生物碱及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种海参生物碱及其制备方法和应用，该海参生物碱为6‑OH刺桐碱，其分子式为C14H18N2O3，其结构式如下：

Description

一种海参生物碱及其制备方法和应用
技术领域
本发明具体涉及一种海参生物碱及其制备方法和应用。
背景技术
海洋中蕴藏着极为丰富的资源和能源，而我国海区拥有的物种也十分多样，随着海洋产业不断的快速发展，越来越多的企业家都把目光投向了海洋这块市场，因此近十几年来我国海洋制药行业发展得十分迅猛，而国内对棘皮动物门中海参的研究也是一大热门的领域。
海参为棘皮动物门(Echinodenmata)海参纲(Holothunoider)生物，全世界的海参有1200多种，我国海域约有140多种。根据触手的形状、管足和呼吸树的有无可将其分为6目：枝手目(Dendrochirotida)、指手目(Dactylochirotida)、无足目(Apodida)、芋参目(Molpadiida)、平足目(Elasipodida)和楯手目(Aspidochirotida)。海参含有海参皂苷、胶原蛋白、海参多糖、脑苷酯、神经节苷酯、甾醇等多种生物活性成分，这些活性成分具有抗肿瘤、抗凝血、抗病毒及增加免疫力等作用。
而有关生物碱，1983年派勒蒂埃(Pelletier)[107]对生物碱给出了比较合理的定义，其认为生物碱(alkaloids)是含有负氧化态氮原子的存在于生物有机体内的环状化合物。广义上说，生物界中所有含氮的有机化合物都可称为生物碱。生物碱是海洋生物的第二大类次生代谢产物，海洋生物碱的主要来源包括藻类、被囊动物、海绵动物和腔肠动物等海洋生物以及微生物，大多具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗炎等活性。1983年，Kirkap等首次从红藻Martensia fragilis中分离出吲哚类生物碱fragilamide，在这之后，越来越多的研究者从海洋生物中发现了生物碱，得到了更多的特殊的化学结构和生理活性。由氨基酸衍化而来的生物碱是海洋来源生物碱的主要组成部分。作为生物碱前体的氨基酸有芳香族氨基酸(酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸)和鸟氨酸、赖氨酸、邻氨基苯甲酸等。
海参生物碱方面，目前的研究仍较少。刘平等在2013年9月4日公开的CN103271934A发明专利申请公开了“一种含有生物碱类活性成分的海参提取物及其提取方法和应用”，其从海参提取物中分离出5个生物碱类活性成分H2a、H2b、H2c、H2d、H2e，实验证明该发明的海参提取物及所含的生物碱类化合物具有治疗贫血、免疫功能低下、创伤及疲劳修复、放化疗后的免疫修复等潜在用途。而有关海参生物碱类化合物的抗肿瘤活性未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种海参生物碱。
本发明的另一目的在于提供上述海参生物碱的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述海参生物碱的应用。
本发明的具体技术方案如下：
一种海参生物碱，为6-OH刺桐碱，其分子式为C14H18N2O3，其结构式如下：
一种上述海参生物碱的制备方法，包括如下步骤：
(1)将新鲜海参去除内脏后，放入沸水中煮20～40min，捞出海参，得海参水煮液；
(2)将海参水煮液调pH为10～11，离心取上清，将上清液上样于大孔吸附树脂柱，吸附饱和后，分别用去离子水和17～23％乙醇溶液洗柱；
(3)用70～75％乙醇溶液冲洗上述大孔树脂柱，收集洗脱液，减压浓缩至浸膏状，得海参浸膏；
(4)将海参浸膏用去离子水复溶后，离心取上清，上清液经石油醚萃取取水层，再用水饱和正丁醇萃取，合并正丁醇层，再减压浓缩至浸膏状，冷冻干燥即得海参提取物；
(5)将海参提取物经中高压制备液相色谱仪，用乙腈-水洗脱体系进行洗脱，203nm处紫外检测，对15.34min的峰进行收集，冷冻干燥即得所述海参生物碱，乙腈-水洗脱体系为：0～3min采用10％乙腈洗脱，3～33min用10％～100％的乙腈进行梯度洗脱，33～43min用100％乙腈洗脱。
在本发明的一个优选实施方案中，所述海参为刺参。
在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(1)为：将新鲜海参去除内脏后，放入沸水中煮20～30min，捞出海参，得海参水煮液。
在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(2)为：将海参水煮液调pH为10，离心取上清，将上清液上样于大孔吸附树脂柱，吸附饱和后，分别用去离子水和20％乙醇溶液洗柱。
进一步优选的，所述大孔吸附树脂柱的型号为AB-8。
在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(3)为：用70％乙醇溶液冲洗上述大孔树脂柱，收集洗脱液，减压浓缩至浸膏状，得海参浸膏。
一种上述海参生物碱在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明的有益效果是：
1、本发明制备的海参生物碱对肺癌细胞A-549、NCI-H1299，前列腺癌细胞PC-3和乳腺癌细胞均显示明显抑制作用，而对肝癌细胞HepG2的抑制作用较弱，为研制新的抗肿瘤药物提供基础，对开发海洋药物具有重要价值。
2、本发明的制备方法简单，成本低廉。
附图说明
图1为本发明实施例2中6-OH刺桐碱对各种癌细胞的抑制作用结果图。
图2为本发明实施例1中海参提取物高压液相色谱图。
图3为本发明实施例1中提取的6-OH刺桐碱纯品的高压液相色谱图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1
(1)将100kg的新鲜刺参取出内脏后，放入沸腾的开水中煮20-30min，100kg的海参产生约50kg的海参水煮液；
(2)取海参水煮液20L，调节pH值为10，8000r/min离心40min得到上清液，将所得的上清液分批过AB-8型大孔树脂柱(每次5L)，流速为2BV/h，吸附饱和后，用2L的去离子水冲洗，再用2L 20％的乙醇溶液冲洗；
(3)用6L 70％的乙醇溶液洗脱上述大孔树脂柱，收集洗脱液，减压浓缩至浸膏状，得海参浸膏；
(4)用500mL的去离子水复溶上述海参浸膏，8000r/min离心40min取上清，上清液经石油醚萃取脱脂，取水层再用水饱和正丁醇萃取三次，合并正丁醇层，减压浓缩至浸膏状，冷冻干燥即得海参提取物约1.5g；
(5)采用HPLC对海参提取物进行检测，在25℃用水(A)-乙腈(B)进行梯度洗脱，洗脱流速为1mL/min，检测波长为203nm，洗脱条件见表1，结果见图2。而后将海参提取物1.5g用甲醇溶解，采用中高压制备液相色谱仪，色谱柱C18(4.6×250mm，5μm)，检测波长203nm，柱温25℃，流速为1mL/min，流动相为水(A)-乙腈(B)，洗脱程序如前，收集15.33min的洗脱峰，制备出6-OH刺桐碱纯品20mg(HPLC图谱如图3所示)。
表1 HPLC流动相配比
上述制得的6-OH刺桐碱分子式为C14H18N2O3，其结构式如下：
从刺参分离出的6-OH刺桐碱为白色无定形粉末。1H和13C核磁共振数据见表2。
表2 6-OH刺桐碱的1H和13C核磁共振数据
实施例2
对实施例1制备的6-OH刺桐碱进行体外抗肿瘤试验，表明其具有中等强度的抗肿瘤作用。试验所用细胞株为国际通用的肿瘤细胞株，即：肺癌细胞A-549、NCI-H1299，肝癌细胞HepG2，前列腺癌细胞PC-3和乳腺癌细胞MCF-7。
6-OH刺桐碱用DMSO配成标准浓度50μg/mL，用0.45μL的微孔滤膜过滤，使用时依次倍比稀释为25，12.5，6.25和3.125μg/mL加入到待测细胞中。抗肿瘤活性的测定采用MTT法：
a)收集对数生长期的肿瘤细胞以1×105/mL的浓度接种于96孔板，100μl/孔，于37℃，5％CO2培养箱中培养24h使细胞贴壁；
b)吸去上清液，加入含实验所需浓度样品液的维持液，于37℃，5％CO2培养箱中培养48h；
c)弃药液，每孔加含5mg/mL的MTT 20μl，继续培养4h；
d)终止培养，弃孔内培养液，加DMSO 150μl/孔，置于摇床上震荡10min，使结晶充分溶解，于酶标仪570nm处测各孔吸光值。实验同时设置调零孔(培养基，MTT，DMSO)，对照孔(细胞，相同浓度的药物溶解介质DMSO，培养液，MTT，DMSO)
e)计算：细胞抑制率＝[(对照-本底)-(给药-本底)]/(对照-本底)×100％，试验结果见图1和下表3：
表3 6-OH刺桐碱对各种癌细胞抑制作用的IC50值
注：“/”表示IC50值超过50μg/mL
上述实验结果表明，6-OH刺桐碱对肺癌细胞A-549、NCI-H1299，前列腺癌细胞PC-3和乳腺癌细胞均显示明显抑制作用，而对肝癌细胞HepG2的抑制作用较弱。本发明为研制新的抗肿瘤药物提供基础，对开发海洋药物具有重要价值。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (8)

1.一种海参生物碱，其特征在于：为6-OH刺桐碱，其分子式为C14H18N2O3，其结构式如下：
2.一种权利要求1所述的海参生物碱的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)将新鲜海参去除内脏后，放入沸水中煮20～40min，捞出海参，得海参水煮液；
(2)将海参水煮液调pH为10～11，离心取上清，将上清液上样于大孔吸附树脂柱，吸附饱和后，分别用去离子水和17～23％乙醇溶液洗柱；
(3)用70～75％乙醇溶液冲洗上述大孔树脂柱，收集洗脱液，减压浓缩至浸膏状，得海参浸膏；
(4)将海参浸膏用去离子水复溶后，离心取上清，上清液经石油醚萃取取水层，再用水饱和正丁醇萃取，合并正丁醇层，再减压浓缩至浸膏状，冷冻干燥即得海参提取物；
(5)将海参提取物经中高压制备液相色谱仪，用乙腈-水洗脱体系进行洗脱，203nm处紫外检测，对15.34min的峰进行收集，冷冻干燥即得所述海参生物碱，乙腈-水洗脱体系为：0～3min采用10％乙腈洗脱，3～33min用10％～100％的乙腈进行梯度洗脱，33～43min用100％乙腈洗脱。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述海参为刺参。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)为：将新鲜海参去除内脏后，放入沸水中煮20～30min，捞出海参，得海参水煮液。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)为：将海参水煮液调pH为10，离心取上清，将上清液上样于大孔吸附树脂柱，吸附饱和后，分别用去离子水和20％乙醇溶液洗柱。
6.如权利要求2或5所述的制备方法，其特征在于：所述大孔吸附树脂柱的型号为AB-8。
7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)为：用70％乙醇溶液冲洗上述大孔树脂柱，收集洗脱液，减压浓缩至浸膏状，得海参浸膏。
8.一种权利要求1所述的海参生物碱在制备抗肿瘤药物中的应用。
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