CN110305014A - 环新木脂烷型木脂素对映异构体及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及环新木脂烷型木脂素对映异构体及其制备和应用。具体涉及一种从药用植物菘蓝叶中分离得到的一对环新木脂烷型木脂素对映异构体及其制备方法，将菘蓝叶药用部位用乙醇提取，减压浓缩得到粗提物后用水混悬，用不同类型的开放色谱柱并采用醇水系统洗脱，再通过制备HPLC和手性拆分获得对映异构体。本发明提供的对映异构体具备抗PD活性，可以丰富菘蓝叶抗PD的医药新用途。本发明所得到的化合物结构新颖，方法设计合理，具有工艺过程简单、成本低、能耗低和生产过程污染低的特点。

Description

环新木脂烷型木脂素对映异构体及其制备和应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及环新木脂烷型木脂素对映异构体及其制备和应用。具体涉及从药用植物菘蓝叶中分离得到的一对新的环新木脂烷型木脂素对映异构体及其抗PD的医药新用途。

背景技术

帕金森病(Parkinson's disease,PD)是好发于老年人的神经变性病，临床主要特征为运动障碍包括进行性运动迟缓、肌强直、静止性震颤和姿势步态异常等，此外还可伴有大量非运动症状(NMS)，如嗅觉减退、便秘、抑郁、睡眠障碍等。疾病后期患者常因平衡障碍、跌倒、冻结步态、吞咽困难和语言障碍等导致生活无法自理，甚至长期卧床，生活质量严重下降。作为一种典型的老年慢性疾病，帕金森病在老年人群中患病率成倍增加，65岁以上老年人群患病率为1％～2％、85岁以上为3％～5％。因此，研制出强效的抗帕金森病药物具有极大的社会意义。

中药单体以其毒副作用小、疗效持久、和整体调节好等优势，已成为近年来防治PD新药的研究导向。含有环新木脂烷型木脂素骨架的天然产物结构新颖，具有神经保护、抗氧化等生物活性。菘蓝是十字花科菘蓝属二年生草本植物，原产我国，全国各地均有栽培。其干燥叶及根可入药，根入药称“板蓝根”，叶入药称“大青叶”，有清热解毒、凉血消斑的功效，常用于治疗风热感冒、咽喉肿痛、流行性乙型脑炎、肝炎和腮腺炎等多种疾病。本发明所涉及的环新木脂烷型木脂素的对映异构体及其活性，迄今为止尚未见有专利或文献报道。

发明内容

本发明提供一对从菘蓝叶中分离的环新木脂烷型木脂素对映异构体。

本发明又提供所述环新木脂烷型木脂素在制备抗PD药物中的用途。

本发明所述环新木脂烷型木脂素的化学结构如式1a或式1b所示：

本发明的制备技术方案包括如下步骤：

以菘蓝叶干燥药材为原料，以体积分数70-80％乙醇提取，浓缩得到浸膏状乙醇提取物，再以二氯甲烷萃取，将二氯甲烷萃取部分经多种色谱手段进行分离纯化。具体通过以下步骤实现：

1、取干燥的菘蓝叶药材，用2-3倍体积量的乙醇水浸泡过夜，再用5-8倍体积量的乙醇水提取2-3次，乙醇的体积浓度为70-80％，提取采用加热回流提取或超声提取。

2、合并所有提取液，进行减压浓缩，回收溶剂，减压浓缩完成后，干燥得到浸膏。

3、提取物经聚酰胺柱色谱分离，用体积比为30～90％的乙醇-水的混合溶剂进行梯度洗脱。

4、其中30％洗脱部分经HP-20大孔树脂柱色谱进行分离，用体积比为0～90％的乙醇-水的混合溶剂进行梯度洗脱。

5、将60％洗脱部分经ODS柱色谱进行分离，用体积比为10:90-90:0的乙醇-水的混合溶剂进行梯度洗脱，再经硅胶柱色谱进行分离，用体积比为50:1-1:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂进行梯度洗脱。进一步用高效液相色谱进行纯化，得式1化合物。

6、将式1化合物经高效液相色谱法拆分后得到式1a和式1b化合物。

其手性拆分制备方法为：以大赛璐AD-H手性柱作为色谱柱，流动相为1:1-3:1的正己烷-异丙醇混合溶剂，流速为0.3mL/min，紫外检测器检测波长为254nm。

其流程如图1所示。

所得化合物经过系统结构鉴定结果如下：

主要利用高分辨质谱、二级质谱、核磁共振谱(1D NMR、2D NMR)、计算ECD。

平面结构：黄色固体(甲醇)。[α]² _D ⁰-3.6(c 0.1,MeOH)。HRESIMS给出准分子离子峰m/z499.1575[M+Na]⁺(calcd for C₂₄H₂₈O₁₀Na,499.1580)，结合¹H、¹³C NMR数据确定化合物分子式为C₂₄H₂₈O₁₀，计算其不饱和度为11。

¹H-NMR(600MHz,DMSO-d₆)谱中，δ6.58(4H,s,5/5',9/9'-H)提示为1,3,4,5-位取代的苯环质子信号，δ8.29(2H,br.s,7/7'-OH)提示为羟基信号，δ3.48(2H,dd,J＝3.7,6.0Hz,H-3/3'),3.32(2H,dd,J＝3.7,6.0Hz,H-2/2')提示为次甲基信号，δ3.73(12H,s,6/6',8/8'-OCH₃),3.66(6H,s,1/1'-OCH₃)为甲氧基信号，结合分子式推测化合物可能含有对称结构。¹³C-NMR(100MHz,DMSO-d₆)谱共给出24个碳信号，δ172.4×2(C-1/1')提示为酯羰基碳信号，δ131.2×2(C-4/4'),104.5×4(C-5/5',9/9'),148.0×4(C-6/6',8/8'),134.6×2(C-7/7')为苯环上的碳信号，δ44.0×2(C-2/2'),47.6×2(C-3/3')为次甲基碳信号，δ56.0×4(6/6',8/8'-OCH₃),51.9×2(1/1'-OCH₃)为六个甲氧基的碳信号。根据HSQC谱对该化合物进行了碳氢直接相关归属，并根据HMBC谱对化合物进行进一步的解析。

在HMBC谱中，苯环质子信号δ6.58(4H,s,5/5',9/9'-H)与苯环碳信号δ148.0(C-6/6',8/8'),134.6(C-7/7'),104.5(C-5/5',9/9'),47.6(3/3'-C)存在相关，δ3.32(2H,dd,J＝3.7,6.0Hz,H-2/2')与δ131.2(C-4/4')存在相关，δ3.48(2H,dd,J＝3.7,6.0Hz,H-3/3')与δ172.4(C-1/1'),104.5(C-5/5',9/9')存在相关，甲氧基δ3.73(12H,s,6/6',8/8'-OCH₃)与苯环碳信号δ148.0(C-8)相关,甲氧基δ3.66(6H,s,1/1'-OCH₃)与羰基碳δ172.4(C-1/1')相关，以上相关信号说明化合物含有4”-羟基-3”,5”-二甲氧基苯基和甲氧羰基两种结构片段。在二级质谱中，发现了m/z144.9985和m/z 332.1243的碎片离子峰(图2)，故确定化合物的平面结构如式1所示。

相对构型：通过NOESY谱来确定的。在NOESY谱中，苯环质子H-5和次甲基氢H-2存在相关，说明这两个基团位于同侧，从而确定该化合物的相对构型如图3所示。

绝对构型：利用手性色谱柱对式1化合物进行拆分，得到1a{[α]² _D ⁰+30.3(c 0.1,MeOH)}和1b{[α]² _D ⁰-29.0(c 0.1,MeOH)}，比例约为1:2，它们的ECD谱图呈镜像关系(图4)。它们的绝对构型是通过比较计算和实测ECD来确定的。式1a化合物和式1b化合物的实验CD曲线分别与预设为2S,3R,2'S,3'R和2R,3S,2'R,3'S构型的计算ECD曲线吻合(图4)。因此确定了1a化合物和式1b化合物的绝对构型分别2S,3R,2'S,3'R和2R,3S,2'R,3'S。

通过上述解析，最终确定结构式1a和1b即为本发明环新木脂烷型木脂素对映异构体。

表1式1化合物¹H NMR(600MHz)和¹³C NMR(100MHz)的化学位移值(溶剂为DMSO-d₆)

通过MTT法证实，式1a化合物和1b化合物对MPP⁺诱导的SH-SY5Y细胞损伤具有保护作用。用12.5μM的式1a化合物和1b化合物处理后，细胞存活率比MPP⁺处理组分别提高了7.4％和9.4％。然后采用Annexin V-FITC/PI双染法检测凋亡细胞百分率。单用1mM MPP⁺处理时，与对照组(2.84％)相比，凋亡率高达21.78％。而用12.5μM式1a化合物或1b化合物进行预处理后，MPP⁺诱导的SH-SY5Y细胞凋亡率降低，分别为10.99％和9.31％。因此，本发明所述的环新木脂烷型木脂素具有制备临床治疗抗PD药物的潜力。

本发明的优点在于，所得到的化合物结构新颖，且具有神经细胞保护活性，具备作为开发新型抗PD药物的活性先导化合物的潜力。

附图说明

图1：式1a化合物和式1b化合物的制备流程图

图2：式1化合物的二级质谱图

图3：式1化合物的相对构型

图4：式1a化合物和式1b化合物的实测和计算ECD谱图

图5：式1化合物的HR-ESIMS谱图

图6：式1化合物的氢谱

图7：式1化合物的碳谱

图8：式1化合物的HMBC

图9：式1化合物的HSQC

图10：式1化合物的NOESY

图11：式1a化合物的CD谱图

图12：式1b化合物的CD谱图

图13：式1a化合物和式1b化合物对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞活力的影响与空白组比较，###为P<0.001；与模型组相比，*为P<0.05

图14：式1a化合物和式1b化合物对MPP⁺诱导的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞凋亡的影响与空白组比较，###为P<0.001；与模型组相比，**为P<0.01。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明进行详细说明，但这些例举性实施方式的用途和目的仅用来例举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护范围局限于此。

实施例1：式1a化合物和式1b化合物的制备：

取干燥的菘蓝叶药材，用2倍体积量的乙醇水浸泡过夜，再用5-8倍体积量的乙醇水提取2-3次，乙醇的体积浓度为70-80％，提取采用加热回流提取或超声提取。合并所有提取液，进行减压浓缩，回收溶剂，减压浓缩完成后，干燥得到浸膏。提取物经聚酰胺柱色谱分离，用体积比为30～90％的乙醇-水的混合溶剂进行梯度洗脱。其中30％洗脱部分经HP-20大孔树脂柱色谱进行分离，用体积比为0～90％的乙醇-水的混合溶剂进行梯度洗脱。将60％洗脱部分经ODS柱色谱进行分离，用体积比为10:90-90:0的乙醇-水的混合溶剂进行梯度洗脱，再经硅胶柱色谱进行分离，用体积比为50:1-1:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂进行梯度洗脱。进一步用高效液相色谱进行纯化，得式1化合物(13.2mg)。将式1化合物经高效液相手性拆分后得到式1a化合物(4.4mg)和式1b化合物(8.0mg)。

实施例2：MTT法检测式1a化合物和式1b化合物对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞活力的影响：

1、细胞培养

神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞系(购自美国模式培养物集存库ATCC,Manassas,USA)以含10％FBS的DMEM培养基(购自美国洛根海克龙Hyclone,Logan,USA)，在37℃，5％CO₂的培养箱中培养，24h后细胞贴壁，弃掉旧培养液。

2、细胞分组

空白组：不含任何药物，仅用DMEM完全培养液培养。

模型组：细胞于DMEM完全培养液培养4h后，加入1mM MPP⁺，继续培养36小时。

1a组：细胞于DMEM完全培养液培养4h后，加入不同浓度(12.5μM、25μM、50μM)式1a化合物培养1小时，再加入1mM MPP⁺，继续培养36小时。

1b组：细胞于DMEM完全培养液培养4h后，加入不同浓度(12.5μM、25μM、50μM)式1b化合物培养1小时，再加入1mM MPP⁺，继续培养36小时。

3、MTT检测

1)加入MTT溶液(0.5mg/mL)20μL孔，37℃继续孵育4h。2)弃掉废液，加入DMSO150μL/孔，恒温振荡器上振荡10min。

3)酶标仪(Thermo Scientific Multiskan MK3,Shanghai,China)。490nm处检测各孔吸光度值。

4、统计学处理

所有的结果和数据在至少三个独立的实验中得到证实。所有得出的数据结果均表示为平均值±标准差使用GraphPad Prism 6(加利福尼亚，美国)软件对各组数据进行单因素方差分析，P<0.05被认为具有统计学意义。

5、实验结果

实验结果如图13所示，与空白组相比，MPP⁺处理的细胞存活率降低(P<0.001)。与模型组相比，12.5μM式1a化合物和式1b化合物对MPP⁺诱导的SH-SY5Y细胞损伤均有保护作用，细胞存活率分别提高了7.4％和9.3％。因此选择12.5μM作为阳性药物浓度进行后续实验。

实施例3：Annexin V-FITC/PI双染法检测式1a化合物和式1b化合物对MPP⁺诱导的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞凋亡的影响。

1、细胞培养步骤同实施例1

2、细胞分组

具体步骤同实施例2，其中，式1a化合物和式1b化合物的浓度均为12.5μM。

3、Annexin V-FITC/PI双染

应用Annexin V-FITC和PI凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡率。在室温下先用AnnexinV-FITC染色，再用PI染色15分钟。采用流式细胞仪(Becton Dickinson，FranklinLakes，USA)进行凋亡率定量。

4、统计学处理同实施例2

5、实验结果

实验结果如图14所示，与对照组相比，单用1mM MPP⁺处理时，细胞凋亡率明显升高(P<0.001)，达21.78％。而用12.5μM的1a化合物和式1b化合物预处理后，MPP⁺诱导的SH-SY5Y细胞凋亡率降低(P<0.01)，分别为10.99％和9.31％。以上结果表明，式1a化合物和式1b化合物对MPP⁺诱导的SH-SY5Y细胞凋亡具有抑制作用。

Claims (8)

1.一对环新木脂烷型木脂素对映异构体，其特征在于：该化合物具有式1a和式1b的结构。

2.权利要求1所述的环新木脂烷型木脂素对映异构体的制备方法，其特征是，通过以下步骤实现：

(1)取干燥的菘蓝叶药材，用体积浓度为70-80％的乙醇提取；

(2)合并提取液，减压浓缩，回收溶剂，干燥得到浸膏；

(3)步骤(2)的浸膏经聚酰胺柱色谱分离，用体积比为30～90％的乙醇-水的混合溶剂进行梯度洗脱；

(4)30％洗脱部分经HP-20大孔树脂柱色谱进行分离，用体积比为0～90％的乙醇-水的混合溶剂进行梯度洗脱；

(5)将60％洗脱部分经ODS柱色谱进行分离，用体积比为10:90-90:0的乙醇-水的混合溶剂进行梯度洗脱，再经硅胶柱色谱进行分离，用体积比为50:1-1:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂进行梯度洗脱；进一步用高效液相色谱进行纯化，得式1化合物；

(6)将式1化合物经高效液相手性拆分后得到式1a和式1b化合物。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，

步骤(1)中，先用2-3倍体积量的乙醇水浸泡过夜，再用5-8倍体积量的乙醇水提取2-3次，所述的提取为加热回流提取或超声提取。

4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，

步骤(6)中的手性拆分方法为：以大赛璐AD-H手性柱作为色谱柱，流动相为1:1-3:1的正己烷-异丙醇混合溶剂，流速为0.3mL/min，紫外检测器检测波长为254nm。

5.药物组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的环新木脂烷型木脂素对映异构体和药学上可接受的载体。

6.权利要求1所述的环新木脂烷型木脂素对映异构体或权利要求5所述的药物组合物在制备神经细胞保护药物中的应用。

7.权利要求1所述的环新木脂烷型木脂素对映异构体或权利要求5所述的药物组合物在制备保护MPP⁺诱导SH-SY5Y细胞损伤的药物中的应用。

8.权利要求1所述的环新木脂烷型木脂素对映异构体或权利要求5所述的药物组合物在制备治疗帕金森病药物中的应用。