CN103254263B - 一种强心苷类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明一种强心苷类化合物及其制备方法和应用，涉及医药技术领域。强心苷类化合物名称为蟾毒灵-3b-丙烯酸酯，分子式为C₂₇H₃₆O₅，结构式如下，是从中药蟾酥中分离制得的一种强心苷类化合物，体外抗肿瘤试验表明，该化合物对A549 人肺癌细胞株和K562 人白血病细胞株有显著的抑制作用，IC₅₀值分别为7.16×10^-3和6.83 ×10^-3μmol/L。本发明可为研制抗肿瘤药物提供新的化学实体或先导化合物，对开发利用中国的传统药物具有重要价值。本发明还公开了从中药蟾酥中分离制备一种强心苷类化合物蟾毒灵-3b-丙烯酸酯的具体方法。

Description

一种强心苷类化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体是一种强心苷类化合物及其制备方法和应用。

背景技术

近年来，随着环境污染的日益严重与人口的老龄化，肿瘤已成为人类死亡的首位因素。调查显示，我国每年因肿瘤死亡的病例为140-150万，发病例数为180-200万。在城市居民中，肿瘤的死因构成为24.4%,在农村居民中达18.3%，而且预期某些常见的肿瘤如肺癌的发病率和死亡率还将明显增加，因此肿瘤的预防及治疗是我国以至全世界疾病防治研究的重大课题，是全社会特别是医学领域急待解决的核心问题之一。药物治疗是肿瘤预防及治疗的主要手段之一，也是全身治疗和防止扩散的唯一手段，高效低毒的新抗肿瘤药物的开发研究是延长患者存活时间、提高生存质量的希望所在。尽管目前已有多种生物技术、药物显示出对肿瘤治疗的有益作用，但其性价比仍然无法满足临床治疗的需要。因此，分子治疗药物在抗肿瘤治疗中的中坚地位依然无法撼动，并将在今后很长一段时间内保持其核心作用。由于源于天然产物的小分子约占抗肿瘤治疗药物的60%，因此以天然产物中有效成分为先导化合物开发抗肿瘤药物是抗肿瘤新药开发研究的主要途径。

蟾酥为蟾蜍科动物中华大蟾蜍 (Bofo bufo andrewsi Schmidt)或黑眶蟾蜍 (Bufo melanostitus Schneider)的干燥分泌物，是名贵中药，性辛、温，有毒，具有解毒、消肿、醒神、开窍、强心和止痛等作用，含蟾蜍毒素类、蟾毒配基类、蟾毒色胺类化合物及肾上腺素、脂肪酸等化学成分，具有强心、升压、镇痛以及抗肿瘤等多种药理活性，临床用于治疗多种癌症、结核病、心脏病、恶性血液病、顽固性呢逆、周期性面神经麻痹、急性咽炎和慢性乙肝等感染病，还可以用于局部麻醉、表面麻醉及慢性牙髓炎的无痛切髓术等。

蟾酥作为一种抗肿瘤药物，本发明人从中分离出一个新的强心苷类成分，化学名为蟾毒灵-3b-丙烯酸酯，其对肿瘤细胞有显著的抑制作用，可用于抗肿瘤药物的研制。

发明内容

本发明公开一种从中药蟾酥中分离得到的强心苷类抗肿瘤化合物蟾毒灵-3b-丙烯酸酯及其制备方法和应用，蟾毒灵-3b-丙烯酸酯的分子式为C₂₇H₃₆O₅，化学结构式为：

                                                 

本发明化合物的制备方法如下：

（1） 制备总浸膏：

取蟾酥药材，剪碎，加入5—30倍量30—95%的甲醇或乙醇回流2—8次，每次3—5h，至提取液无色，合并所有的提取液，减压回收溶剂，干燥，得总浸膏；

（2） 分离纯化：

总浸膏用甲醇溶解，柱层层析用硅胶拌样，正相硅胶柱色谱（300~400目）分离，用体积比为100 : 0 ~ 0 : 100的氯仿/甲醇混合溶剂梯度洗脱，以硅胶预制板跟踪检识，硅胶薄层层析TLC的展开系统为体积比为100 : 10的氯仿/甲醇混合溶剂，收集含有化合物C₂₇H₃₆O₅的流份，回收溶剂浓缩至干；过ODS反相柱，以体积比为30 : 100 ~ 100 : 0的甲醇/水混合溶剂梯度洗脱，根据薄层色谱的监测，收集含有化合物C₂₇H₃₆O₅的流分；过300~400目的正相硅胶柱，以体积比为100 : 0 ~ 0 : 100的氯仿/甲醇混合溶剂梯度洗脱，根据薄层色谱的监测，收集含C₂₇H₃₆O₅的流分；再经正相硅胶柱色谱分离，以体积比为100 : 0 ~ 0 : 100的石油醚/丙酮混合溶剂梯度洗脱，根据薄层色谱的监测，收集含有化合物C₂₇H₃₆O₅的流分并减压浓缩，得纯强心苷类化合物C₂₇H₃₆O₅。

上述步骤步骤（2）分离纯化时，总浸膏用甲醇溶解，最后用正相硅胶柱纯化时，所用的是薄层层析用硅胶。

上述步骤步骤（2）硅胶薄层层析中检测化合物C₂₇H₃₆O₅的方法中的显色剂为体积分数为5-10%硫酸乙醇溶液，加热显色。

本发明一种强心苷类化合物的应用，其特征是：在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明化合物C₂₇H₃₆O₅为无色针晶，mp 204-205℃。高分辨质谱确定其分子式为C₂₇H₃₆O₅，不饱和度Ω=10。紫外光谱显示分子中有α-吡喃酮结构( λ _max : 300 nm )，红外光谱说明分子中含有羟基（3507cm^-1），羰基（1718 cm^-1）。¹H NMR [δ _H: 7.24 (d, J = 2.4 Hz)，7.87 (dd, J = 2.4 Hz, J = 9.6 Hz)，6.28 (d, J = 9.6 Hz)，0.70 ( 3H, s )，0.97 ( 3H, s )]，及¹³C NMR ( δc:162.4，148.5，146.8，115.3，122.7 )数据确定其为蟾蜍二烯内酯类化合物。

¹³C NMR及DEPT谱显示该化合物中有2个甲基，10个亚甲基（九个脂肪族亚甲基和一个烯烃亚甲基），9个次甲基（八个脂肪族次甲基和一个烯烃上的次甲基）和6个季碳（两个羰基，一个烯烃季碳和三个脂肪族季碳），结合质谱数据推测该化合物为蟾蜍毒素类化合物。同时，碳谱数据δc 70.5、85.3说明此化合物母核3、14位上连有含氧取代基团，经与文献数据（乔莉，段文娟，姚遥等，沈阳药科大学学报，2007，24（10）：611-614) 比较，确定该化合物为3位羟基取代的蟾毒灵衍生物。

通过分析化合物的核磁数据可知，化合物C₂₇H₃₆O₅中含有一个丙烯酸基团（表1），并且由HMBC 信号中H-C(2') 和 C(1') 、C(3')， H-C(3') 与C(1') 、C(2') 相关确定。由于δ_H3 5.18 和 δ_C3 70.5数值向低场位移，δ_C2 25.0 和 δ_C4 30.5数值向高场位移，因此确定此丙烯酸基团连接在3位羟基上( 张英, 沈阳药科大学硕士学位论文，2007 )。

综上分析，化合物C₂₇H₃₆O₅的结构鉴定为蟾毒灵-3b-丙烯酸酯，并且通过HSQC, HMBC, ¹H-¹H-COSY, 以及 ROESY 数据验证。该化合物为一新的蟾蜍二烯内酯类化合物。¹H-NMR和¹³C-NMR 数据见表1。

              表1. C₂₇H₃₆O₅的核磁共振数据表（CDCl₃）

  

 

 本发明使用武汉中国典型培养物保藏中心提供的肿瘤细胞株A549（人肺癌细胞株），K562（人白血病细胞株），对化合物进行体外抗肿瘤试验，表明其具有显著的抑制肿瘤的活性，因此本发明化合物可以用于制备抗肿瘤药物。

具体实施方法：下面结合具体实例对本发明做详细阐述，但保护范围不局限于以下实施例。

实施例1：化合物蟾毒灵-3b-丙烯酸酯的制备：

取蟾酥药材，剪碎，加入10—30倍量30—95 % 的甲醇或乙醇回流2—8次，每次3—5h，至提取液无色，合并所有的提取液，减压回收溶剂，干燥，得总浸膏；总浸膏用甲醇溶解，柱层层析用硅胶拌样，正相硅胶柱色谱（300~400目）分离，用体积比为100 : 0 ~ 0 : 100的氯仿/甲醇混合溶剂梯度洗脱，以硅胶预制板跟踪检识，硅胶薄层层析TLC的展开系统为氯仿/甲醇体积比100 : 10的混合溶剂，收集含有化合物C₂₇H₃₆O₅的流份，回收溶剂浓缩至干；过ODS反相柱，以体积比为30 : 100 ~ 100 : 0的甲醇/水混合溶剂梯度洗脱，根据薄层色谱的监测，收集含有化合物C₂₇H₃₆O₅的流分；过300~400目的正相硅胶柱，以体积比为100 : 0 ~ 0 : 100的氯仿/甲醇混合溶剂梯度洗脱，根据薄层色谱的监测，收集含C₂₇H₃₆O₅的流分；再经正相硅胶色谱分离，以石油醚/丙酮的体积比为100 : 0 ~ 0 : 100的混合溶剂进行梯度洗脱，根据薄层色谱的监测，收集含有化合物C₂₇H₃₆O₅的流分并减压浓缩，得纯强心苷类化合物C₂₇H₃₆O₅。

实施例2：化合物蟾毒灵-3b-丙烯酸酯的结构鉴定：

利用波谱技术，包括紫外、红外、核磁共振、高分辨质谱，对实施例1中的化合物进行鉴定；其波谱数据如下：无色晶体，mp: 204 – 205 ℃；EI-MS m/z: 440[M]⁺, 368, 350, 325, 214。HR-EI-MS: 440.2565 [ M ]⁺, (计算值：440.2563，误差：0.2毫质量单位)；[α]= -5°( c 0.023,CHCl₃ )；UV ( CHCl₃ )λ _max : 300 nm ( 0.563 ); IR( KBr ) ν _max : 3507, 1718, 1540, 1630, 1540, 1451, 1406, 1296, 1201, 1048, 835 cm^-1，¹H-NMR和¹³C-NMR 数据见表1。

实施例3：化合物蟾毒灵-3b-丙烯酸酯体外抗A549人肺癌细胞株活性实验：

实验使用的肿瘤细胞株为武汉中国典型培养物保藏中心提供的A549（人肺癌细胞株）。采用磺酰罗丹明B蛋白染色法（SRB），试验设有空白对照组、标准对照组、阳性对照组（阿霉素）和三个不同浓度（1.00×10^-3 mol/L、1.00×10^-4 mol/L、1.00×10^-5 mol/L）的待测样品，每个浓度设三个平行。其操作步骤如下：将人体肿瘤细胞A549 白血病细胞株在37 ℃、5 % CO₂ 条件下培养72 h，倾去培养液，用10 %冷TCA固定细胞，4 ℃放置1 h。1 h后用蒸馏水洗涤5次，空气中自然干燥，每孔加入由1 %冰醋酸配制的4 mg/mL的SRB溶液(溶于平衡盐溶液PBS)100 μL，室温中染色15min。15 min后，去上清夜，用1 %醋酸洗涤5次，空气干燥，最后每孔加入150 μL的Tris溶液，540 nm波长下用酶标仪测定光密度值（OD值）。按下列公式计算被测物对癌细胞生长的抑制率：

半数有效抑制浓度IC₅₀值采用Logit法计算（实验结果见表2）。

实施例4：化合物蟾毒灵-3b-丙烯酸酯体外抗K562人白血病细胞株活性实验：

实验使用的肿瘤细胞株为武汉中国典型培养物保藏中心提供的K562（人白血病细胞株）。采用四甲基偶氮唑盐( MTT )比色法，实验分3组：空白对照组、阳性对照组（阿霉素）和三个不同浓度（1.00×10^-3 mol/L、1.00×10^-4 mol/L、1.00×10^-5 mol/L）的待测样品，每个浓度设三个平行。操作步骤如下：将肿瘤细胞在37℃、5 % CO₂条件下培养48 h后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液(溶于平衡盐溶液PBS) 20 μL，继续培养4 h后每孔加入三联液（ 10 % SDS - 5 %异丁醇 0.01 mol/HCl ）50 μL，于CO₂培养箱中过夜。在570 纳米波长下用酶标仪测光密度值（OD值），按下列公式计算被测物对肿瘤细胞生长的抑制率：

半数有效抑制浓度IC₅₀值采用Logit法计算（实验结果见表2）。

 上述实验结果表明：化合物蟾毒灵-3b-丙烯酸酯对两种不同的肿瘤细胞株均显示显著的抑制作用，因此可以用于制备抗肿瘤药物。本发明为研制抗肿瘤药物提供了新的化学实体或先导化合物，为开发利用中国的传统药物具有重要意义。

Claims (5)

1.一种强心苷类化合物，化学名为蟾毒灵-3b-丙烯酸酯，分子式为C₂₇H₃₆O₅，具有以下结构式：

。

2.如权利要求1所述一种强心苷类化合物的制备方法，步骤如下：

（1）制备总浸膏：

取蟾酥药材，剪碎，加入5—30倍量30—95%的甲醇或乙醇回流2—8次，每次3—5h，至提取液无色，合并所有的提取液，减压回收溶剂，干燥，得总浸膏；

（2）分离纯化：

总浸膏用甲醇溶解，柱层层析用硅胶拌样，300-400目正相硅胶柱色谱分离，用体积比为100 : 0 ～ 0 : 100的氯仿/甲醇混合溶剂梯度洗脱，以硅胶预制板跟踪检识，硅胶薄层层析TLC的展开系统为体积比为100 : 10的氯仿/甲醇混合溶剂，收集含有化合物C₂₇H₃₆O₅的流份，回收溶剂浓缩至干；过ODS反相柱，以体积比为30 : 100 ～ 100 : 0的甲醇/水混合溶剂梯度洗脱，根据薄层色谱的监测，收集含有化合物C₂₇H₃₆O₅的流分；过300~400目的正相硅胶柱，以体积比为100 : 0 ～ 0 : 100的氯仿/甲醇混合溶剂梯度洗脱，根据薄层色谱的监测，收集含C₂₇H₃₆O₅的流分；再经正相硅胶柱色谱分离，以体积比为100 : 0 ～ 0 : 100的石油醚/丙酮混合溶剂梯度洗脱，根据薄层色谱的监测，收集含有化合物C₂₇H₃₆O₅的流分并减压浓缩，得纯强心苷类化合物C₂₇H₃₆O₅。

3.根据权利要求2所述的一种强心苷类的化合物的制备方法，其特征在于：步骤（2）分离纯化时，总浸膏用甲醇溶解，最后用正相硅胶柱纯化时，所用的是薄层层析用硅胶。

4.根据权利要求2所述的一种强心苷类化合物的制备方法，其特征在于：硅胶薄层层析中检测化合物C₂₇H₃₆O₅的方法中的显色剂为体积分数为5-10%硫酸乙醇溶液，加热显色。

5.权利要求1所述一种强心苷类化合物的应用，其特征是：在制备抗肿瘤药物中的应用。