CN101619054B - 一个香豆素类活性成分及其制备方法与应用 - Google Patents
一个香豆素类活性成分及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种从木豆叶中提取分离新的香豆素类活性成分-木豆内酯及其提取分离方法与应用。该化合物的结构见图1。所采取的技术方案为:以农业废弃物木豆叶为原料,经溶剂提取后,将提取液浓缩并分散于水中,采用超声波振荡絮凝技术、气泡柱式萃取技术以及正相硅胶中压柱层析分离技术,再结合低温析晶和重结晶技术得到所述成分,其纯度达95%以上。该化学成分经DPPH模型、β-胡萝卜素-亚油酸模型,组织中SOD酶模型及体内ADP诱导的血小板聚集模型和对苯肾上腺素诱导主动脉收缩模型检测其抗氧化活性及对心血管疾病作用。结果显示该活性成分具有良好的自由基清除活性、体内外抗氧化活性和体内抑制血小板聚集作用,及一定的扩张血管作用。同时,本发明中木豆内酯的制备方法简单、易行,短周期内即可获得高纯度、高收率和高附加值的产品。适用于产业化生产和应用,可进一步研制开发为新型抗氧化剂,用作药物、食品以及化妆品添加剂等。
Description
技术领域
本发明涉及一种从中药中提取、分离具有生物活性的化合物,具体为从中药木豆[Cajanuscajan L.Millsp.]叶中提取分离的一种具有生物活性的内酯化合物及其提取方法。该化合物为木豆内酯,化学名为:7-羟基-5-O-甲基-8-(3-甲基-2-丁烯)-4-苯基-9,10-二氢-苯并吡喃-2-酮。
背景技术
随着社会生产力的发展,人们越来越追求健康长寿,从天然产物中寻找新的活性成分,是开发研制新药以治疗危害人类健康的临床顽疾、减少药源疾病发生的重要途径之一。本发明应用现代提取、分离和纯化手段,结合先进的物理手段和化学方法,对木豆叶活性成分进行研究,以期为药物或活性先导化合物开发提供科学的依据。
木豆叶作为应用广泛的民间用药,其来源为豆科木豆属一年生或多年生常绿灌木木豆[Cajanus cajan(L.)Millsp.]的植物叶。木豆又名鸽子豆、树黄豆等,是热带和亚热带国家一种主要的豆类作物,我国已有大面积的种植,因此木豆叶资源丰富。关于木豆叶的药用,《陆川本草》和《中华药海》均有记载:“平、淡、有小毒”。木豆叶有清凉、消热、解毒、止痛止血、抑菌消炎等功效,民间用于治疗外伤、烧伤、感染、褥疮和抗菌消炎等(刘中秋等,1998;孙绍美等,1995)。此外,木豆提取物制剂在印度、巴西、古巴、墨西哥、南非等国用于治疗感冒、支气管炎、麻疹、痢疾、肝炎、烧伤、溃疡、肿瘤、膀胱结石、黄疸、女性生殖系统及其他皮肤病等疾病(Abbiw DK.,1990;Duke JA.et al,1994;Milliken W.,1997;Grover J.K.,2002),疗效显著。我国临床组方用于治疗股骨头坏死以及循环系统疾病(袁浩等,2004)。
目前为止,木豆叶作为中草药,其应用越来越广泛,但有效成分、作用机理等研究还不够清晰,影响其临床上的进一步应用。关于木豆叶成分的报道中,尚未涉及到如木豆内酯这样结构的化合物的报道。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种从中国海南产木豆叶中提取分离的生物活性香豆素类成分——7-羟基-5-O-甲基-8-(3-甲基-2-丁烯)-4-苯基-9,10-二氢-苯并吡喃-2-酮,其英文名为:cajanuslactone中文名为:木豆内酯。该成分具有体内体外抗氧化活性。本发明利用丰富的木豆叶生物资源寻找新的抗氧化化合物,为研究开发新药提供先导化合物。
本发明的另一目的是提供该化合物的制备方法:以木豆叶为原料,通过溶剂提取、超声波振荡絮凝、大孔吸附树脂富集、正相硅胶中压柱层析分离及低温析晶和重结晶技术,大量、快速获得该活性内酯类化合物,该方法简单易行、目标化合物损失少。
本发明提供的香豆素类活性成分——木豆内酯是通过以下方案来获得的:
(1)以木豆叶为原料,将木豆叶破碎后用溶剂提取,所采用的提取方法包括浸泡、回流、负压空化和超临界CO2萃取技术,采用的溶剂为丙酮、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、乙醇或醇水混合体系,提取液浓缩回收溶剂至干,得到提取浓缩物。
(2)得到的提取浓缩物,加入8倍质量的25~40℃温水,于35-40℃、50~60KHz条件下超声波振荡25~35min,然后静止30~45min,得到富含该木豆内酯的絮凝物。
(3)以逆向气泡流为动力,以没有吸附作用的固体颗粒为载体进行有机溶剂萃取,将超声波震荡絮凝得到的絮凝物用等2倍体积的石英砂搅拌后装入玻璃柱,然后以10~12mL/g样品量加入体积比为8/1的三氯甲烷-水、二氯甲烷-水或者乙酸乙酯-水体系中的一种,以0.1~0.3L/min流速通入空气,持续25~30min,静止分层后,回收有机溶剂,得到气泡柱萃取后的粗品。
(4)将气泡柱萃取后的粗品用200-800目正相硅胶反复进行正相中压柱层析,流动相为石油醚、乙醚或正己烷中的一种与二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯或者丙酮中的一种按照体积比20∶1~150∶1混合体系。结合结晶和重结晶技术,得到纯度大于95%的目标成分单体。结晶和重结晶所用溶剂溶剂为石油醚、乙醚或者正己烷中的一种与三氯甲烷、二氯甲烷、丙酮、乙腈或者甲醇中的一种按照体积比30∶1~1∶1混合体系,或者体积分数为70~90%甲醇或者乙醇-水体系。
本发明所涉及的成分经过1HNMR、13CNMR,DQCOSY,NOESY,TOCSY,HMBC,HMQC,MS,UV和IR等现代的物理手段和化学方法确定结构,见图1
该化合物名称为:7-羟基-5-O-甲基-8-(3-甲基-2-丁烯)-4-苯基-9,10-二氢-苯并吡喃-2-酮。命名为:木豆内酯。
该化合物为白色细针状结晶。紫外光谱(图)在204、265和351nm的吸收峰表明化合物I含有芳香环。ESI-MS质谱分析得到其分子量为336.5,并确定其分子式为C21H20O4。红外光谱分析中在3382cm-1附近出现的强峰表明该化合物中存在羟基。1600-1700cm-1处出现的吸收表明该化合物中内酯环的存在。
通过2D-NMR,特别是HMQC和HMBC谱,对质子与碳原子的相关性、取代基位置进一步确定,结合二级质谱分析,确切地归属了该化合物的H信号。1H-NMR显示3个甲基(δ1.69,1.85,和3.85),1个亚甲基δ3.52(J=6.8Hz),一个酚羟基质子信号(δ11.30)2个次甲基质子(δ7.27和6.63)和5个芳香环质子,其中2个δ7.91(d,J=7.76Hz),3个为δ7.5(多重峰),由此提示结构该框架中存在单取代基苯环。δ11.30在HMQC谱中没有相关性暗示该分子中羟基存在,在ESIMS谱中m/z 319碎片峰,即H2O[M+1-H2O]+的断裂也证明了该羟基的存在。
结合13C-NMR和COSY谱,相应的19类C原子得以确认。其中1个亚甲基(δC 24.1),6类次甲基(δC 130.9,129.8,126.0,123.7,100.9,99.1)和9类饱和碳原子(1个羰基δC 166.9,2个氧饱和碳δC 165.5和163.4,以及6类烯烃碳δC 153.3,136.8,132.9,132.0,117.1和100.1)。COSY与HMQC谱表明化合物中存在质子序列:(CH3)2C-CH-CH2-R,同时结合红外光谱中1660-1600cm-1处的吸收,可以确定分子中异戊二烯基团的存在。表1为化合物I的具体信号归属。
表1木豆内酯的1H-NMR和13C-NMR数据表
本发明中的木豆内酯可用作预防和治疗与氧化有关的疾病,如早老性痴呆症、动脉粥样硬化、高血压、血栓症、辐射损伤、衰老等的预防药与治疗药。还可用作预防紫外线损伤的化妆品添加剂以及食品添加剂等。
本发明中的木豆内酯通过体外DPPH模型、β-胡萝卜素-亚油酸模型,组织中SOD酶模型及体内ADP诱导的血小板聚集模型和对苯肾上腺素诱导主动脉收缩模型检测抗氧化活性及对心血管疾病的作用。结果显示本化合物具有良好的自由基清除活性、体内外抗氧化活性和体内抑制血小板聚集作用,及一定的扩张血管作用。其中,木豆内酯在DPPH模型中的活性(IC50195.33±3.12μg/ml)比阳性对照药物抗坏血酸强,且具有提高抗氧化酶的活性,木豆内酯对ADP诱导大鼠的血小板聚集具有很好的抑制作用,对苯肾上腺素诱引兔主动脉收缩具有舒张作用,表明其有扩张血管作用。
附图说明
图1:化合物(I)的结构式
图2:化合物(I)的紫外光谱
图3:化合物(I)的ESI-MS谱
其中,A为正离子扫描模式下化合物(I)的一级质谱TIC图,337.5[M+H]+为分子离子峰;B为正离子扫描模式下化合物(I)的二级质谱图,图中显示了该化合物相应的分子碎片
图4:化合物(I)的红外光谱。
图5:化合物(I)的1H-NMR谱
图6:化合物(I)的13C-NMR谱
图7:化合物(I)的DEPT谱
图8:化合物(I)的HMBC谱
图9:化合物(I)的HMQC谱
图10:化合物(I)的COSY谱
本发明的优点是:
1.提供一种具有生物活性的新化合物。
2.该方法简单易行,周期短,可实现大规模的产业化生产。
3.产品得率高、纯度高。
具体实施方案
实施例1.木豆叶中香豆素类活性化合物的分离
称取木豆干枝叶的5kg,用80%超临界CO2提取3次,每次2小时。提取液浓缩后,加入40℃温水(4L)中,于超声波提取器中50KHz条件下振荡絮凝30min,静止30min,取絮凝物,加入用等2倍体积的石英砂搅拌后装入玻璃柱,然后以12mL/g样品量加入8/1(v/v)的三氯甲烷-水,以0.25L/min流速通入空气,持续30min,静止分层后,回收有机溶剂,得到目标物粗品的用少量甲醇溶解,加入等质量的目数为300-400的层析硅胶拌匀、40℃减压蒸干。预先称取提取物质量4倍的300-400目硅胶,采用石油醚湿法装柱,将拌好样品的硅胶装入中压柱内,以石油醚∶三氯甲烷(10∶1)中压洗脱,TLC监测收集流份,浓缩得到富含化合物I的流份,浓缩后再次用500-800目硅胶中压柱层析,所得流份回收溶剂后,经低温析晶得到产品,重结晶后得到化合物29.37mg,纯度为95%.
实施例2.DPPH自由基清除活性测试
试管中加入待测样液100μl,DPPH溶液3.5ml,30℃恒温水浴中保温20min,取出后于520nm处测定其吸光度,以空白溶剂作对照。每个样品做5个浓度,每个浓度做3个平行,以抗血酸作阳性对照。实验结果统计处理计算自由基清除活性的IC50值。
实施例3.β-胡萝卜素-亚油酸抗氧化活性测试
试管中加入待测样液100μl,β-胡萝卜素-亚油酸乳化液4.9ml,以溶剂做空白对照,于470nm处测其吸光度,即为0min时的值,备50℃恒温水浴,测好0min时的吸光度立即将试液倒回试管放入水浴中,计时,每隔15min测定一次,直至空白对照管的β-胡萝卜素褪色,以BHT溶液为阳性对照。每个样品做5个浓度,每个浓度做4个平行。计算抗氧化活性IC50值。
表2是体外抗氧化活性结果。
表2木豆内酯抗化氧化活性IC50
实施例4.组织中SOD酶(超氧化物歧化酶)活性测定
取健康小鼠进行分组,通过灌胃的方式给药30天,对照组给以相等剂量的生理盐水,每日一次,第31天各组小鼠同时取肝组织制备10%肝组织匀浆液,冷冻离心后取上层清液待用。配成0.1%的组织液。550nm处比色。
表3木豆内酯对小鼠组织中SOD酶的影响
实施例5.抗ADP诱导的血小板聚集作用
取健康大鼠,雌雄不拘,随机分为四组,即模型组、阿司匹林组及木豆内酯低、高剂量组。颈动脉插管取血9ml,置于已加入1ml 3.8%枸橼酸钠溶液的试管中,以800rpm离心10min,取富血小板血浆(PRP):剩余部分以300rpm离心,取贫血小板血浆(PPP)。以ADP为诱导剂,用PAPER-1型血小板聚集及血凝测定仪测定血小板聚集率,记录聚集率,并计算抑制率。
表4木豆内酯对ADP诱导大鼠血小板聚集的作用
实施例6抗苯肾上腺素诱导的兔主动脉收缩作用
取清洁级大耳白兔,将其击昏,迅速游离其胸主动脉,剪成3~4mm的血管环。据实验需要,采用棉签磨擦血管环内表面的方法制备去内皮血管环。在持续通95%O2和5%CO2混合气体的状态下,调节其基础张力至2.0g,并在37℃下稳定60min,每15min换液1次。以苯肾上腺素1μmol·L-1诱发的最大收缩幅度为100%,以加入药物后的血管张力幅度与苯肾上腺素诱发的最大收缩幅度之间的比率反映血管张力的变化。
表5木豆内酯对苯肾上腺素诱导兔主动脉收缩的影响
由上述结果可知,木豆内酯具有体内外抗氧化活性,其在DPPH模型中的活性(IC50195.33±3.12μg/ml)比阳性对照药物抗坏血酸强,β-胡萝卜素-亚油酸模型中的活性比BHT稍弱,且木豆内酯具有提高抗氧化酶的活性。体内实验还证明,木豆内酯对ADP诱导大鼠的血小板聚集具有很好的抑制作用,高剂量组作用明显强于阿斯匹林。对苯肾上腺素诱引兔主动脉收缩具有舒张作用,表明其有扩张血管作用,作用与哌唑嗪相当。以上结果证明,木豆内酯在制备抗氧化活性药物及心脑血管疾病的药物中的用途及其在制备预防紫外线损伤的化妆品添加剂和食品添加剂中的广泛前景。
Claims (10)
1.一个香豆素类生物活性成分,其特征在于:以木豆叶为原料,提取后经气泡柱式萃取、结合多种柱层析技术分离得到,采用紫外、质谱、红外和核磁共振等光谱分析技术,确定该化合物为木豆内酯:7-羟基-5-O-甲基-8-(3-甲基-2-丁烯)-4-苯基-9,10-二氢-苯并吡喃-2-酮。
2.按照权利要求1所述的香豆素类活性成分的制备方法,其特征在于:以木豆叶为原料,将木豆叶破碎后用溶剂提取,提取液浓缩至干,再经过超声波振荡絮凝,得到的絮凝物进行气泡柱式萃取和多次正相硅胶中压柱层析,结合结晶和重结晶技术得到所述单体化合物。
3.按照权利要求2所述的香豆素类活性成分的制备方法,其特征在于:所述的提取方法包括浸泡、回流、负压空化和超临界CO2萃取提取技术,所述溶剂为丙酮、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、乙醇或醇-水混合体系。
4.按照权利要求2所述的香豆素类活性成分的制备方法,其特征在于:所述的超声波振荡絮凝为提取物浓缩物中加入25~40℃温水的体积为浓缩物质量的8倍,超声波振荡时间为25~35min,频率为50~60KHz,静止时间为30~45min。
5.按照权利要求2所述的香豆素类活性成分的制备方法,其特征在于:所述的气泡柱式萃取技术是以逆向气泡流为动力,以没有吸附作用的固体颗粒为载体进行有机溶剂萃取,将超声波震荡絮凝得到的絮凝物加入用等2倍体积的石英砂搅拌后装入玻璃柱,然后以10~12mL/g样品量加入体积比为8/1的三氯甲烷-水、二氯甲烷-水或者乙酸乙酯-水体系中的一种,以0.1~0.3L/min流速通入空气,持续25~30min,静止分层后,回收有机溶剂,所得固形物为目标物粗品。
6.按照权利要求2所述的香豆素类活性成分的制备方法,其特征在于:所述的中压正相硅胶柱层析是以气泡柱萃取后粗品为分离样品,所用硅胶为200~800目,流动相为石油醚、乙醚或正己烷中的一种与二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯或者丙酮中的一种按照体积比20∶1~150∶1混合体系。
7.按照权利要求2所述香豆素类活性成分的制备方法,其特征在于:所述的重结晶技术所用的溶剂为石油醚、乙醚或者正己烷中的一种与三氯甲烷、二氯甲烷、丙酮、乙腈或者甲醇中的一种按照体积比30∶1~1∶1混合体系,或者体积分数为70~90%甲醇或者乙醇-水体系。
8.权利要求1中所述的香豆素类化学成分在制备抗氧化活性药物中的用途。
9.权利要求1中所述的香豆素类化学成分在制备抑制血小板聚集及扩张血管药物中的用途。
10.权利要求1中所述的香豆素类化学成分在制备预防紫外线损伤的化妆品添加剂和食品添加剂中的用途。
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