CN112870192B - 生物碱类化合物在制备抑制血小板聚集药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于抑制血小板聚集活性化合物应用的技术领域，具体涉及生物碱类化合物在制备抑制血小板聚集药物中的应用，所述生物碱类化合物从香蕉花中提取得到。本发明以香蕉花为原料来提取生物碱类化合物，能够变废为宝，充分利用资源，提高香蕉种植产业的经济价值，且提取得到的碱类化合物具有较佳的抑制血小板聚集活性，为制备抗血小板药物治疗血栓疾病提供更多的选择。

Description

生物碱类化合物在制备抑制血小板聚集药物中的应用

技术领域

本发明属于抑制血小板聚集活性化合物应用的技术领域，具体涉及生物碱类化合物在制备抑制血小板聚集药物中的应用。

背景技术

血栓栓塞可见于多种器官组织，包括心房室腔、动脉、静脉和微血管，常见的并发症有:冠状动脉血栓引起的心肌梗塞或心绞痛；脑血管疾病形成血栓，即中风；肺动脉栓塞引起肺梗塞或急性肺原心脏病；肢体动脉栓塞引起肢端疼痛或坏死；肢体静脉血栓形成引起局部水肿和疼痛；全身毛细血管内发生弥漫性血栓，形成播散性血管内凝血。血栓形成是一个非常复杂的病理过程，涉及到血小板、血管壁、内皮组织、凝血因子和血液流变等诸多方面的因素，其中血小板过度黏附、活化、聚集及释放是栓塞的重要成因。因此，研究和开发抗血小板药物是目前临床治疗血栓性疾病的有效手段之一。

临床上常用的抗血小板药物，按其作用机制可分为以下四类:血小板膜蛋白受体拮抗药物、影响核苷酸系统药物、抑制血小板内含物释放药物及影响花生四烯酸系统药物。阿司匹林、氯吡格雷和阿昔单抗等是具有代表性的抗血小板聚集临床用药，尽管这些西药有悠久的使用历史，但还是存在诸如耐药性、治愈率低、出血风险高以及强烈的胃肠道反应等副作用。

香蕉花是香蕉成熟采摘后产生了几乎与果实等量的废弃物，每株香蕉产生一个重量约为2kg左右的雄花，按180株/亩的种植密度结合我国香蕉面积可知，我国年产香蕉花约为500万吨以上。中医认为香蕉花味甘但、微辛、性凉、具有化痰消痞，平肝化瘀等功效，适用于胸膈饱胀，肮腹痞疼，吞酸反胃，头目昏眩，风湿疼痛等症。在许多亚洲国家如:斯里兰卡、马来群岛、印尼等国将香蕉花作为蔬菜，他们通常会用煮和油炸的方式进行食用。在印度，香蕉花作为提高女性母乳和减缓痛经的药材食用已有上千年的历史。在我国香蕉产区大量的香蕉花作为废料处理，由于其含水量高，腐烂时间长，容易引起虫害如象鼻虫，不仪造成蕉园环境二次污染，也浪费大量的植物资源，现阶段还未得到充分利用。

目前还未见有相关报道对从香蕉花中提取的新生物碱类化合物在制备抑制血小板聚集药物中的应用。因此，开发新型的天然抗血小板药物将为血栓疾病的治疗提供更多的选择。

发明内容

本发明旨在解决上述技术问题，提供生物碱类化合物在制备抑制血小板聚集药物中的应用，该生物碱类化合物化合物具有较好的抑制血小板聚集活性。

本发明的技术方案为：

本发明的生物碱类化合物在制备抑制血小板聚集药物中的应用，所述生物碱类化合物的化学式为：

香蕉花是香蕉成熟采摘后产生了几乎与果实等量的废弃物，现有中香蕉花的应用多为将香蕉花作为蔬菜，用煮和油炸的方式进行食用。而本发明中，以可食用的香蕉花作为原料，用来提取上述碱类化合物，得到的生物碱类化合物具有较好的抑制血小板聚集活性。

本发明从香蕉花提取上述生物碱类化合物的具体步骤为：

(1)将新鲜香蕉花晒干，用乙醇在45℃下浸提3次，每次1天，合并提取液，过滤，减压浓缩，获得乙醇提取物；

(2)将乙醇提取物分散至水中，依次采用石油醚和乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯浸膏；

(3)将乙醇乙酯浸膏溶解于甲醇中，通过洗脱液为甲醇的硅胶色谱柱进行洗脱，再通过所述梯度洗脱液为氯仿-甲醇的硅胶色谱柱进行梯度洗脱，梯度洗脱依次以氯仿-甲醇体积比为100:1→60:1→30:1→10:1→5:1进行；

(4)将步骤(3)中60:1梯度洗脱部位的接收液浓缩并通过高效液相色谱依次用体积百分数为20％和体积百分数为26％甲醇进行梯度洗脱，再通过硅胶色谱柱进行梯度洗脱，所述梯度洗脱液为氯仿-甲醇，梯度洗脱依次以氯仿-甲醇体积比为100:1→60:1→30:1→10:1进行；

(5)将步骤(4)中30:1梯度洗脱部位的接收液合浓缩并通过高效液相色谱用体积百分数为43％甲醇恒冲，再通过硅胶色谱柱以氯仿-甲醇体积比为15:1进行恒冲，继续通过高效液相色谱用体积百分数为40％甲醇恒冲，用氯仿-甲醇体积比为5:1作为洗脱剂，收集并浓缩Rf值为0.5的洗脱液，获得化学结构式如下的目标产物：

发明人发现本发明的生物碱类化合物或其药学上可接受的盐具有一定的抑制血小板聚集的活性，从而预防和治疗各种血栓和栓塞性的疾病。

由于采用上述技术方案，本发明的有益效果为：

1、香蕉花是香蕉成熟采摘后产生了几乎与果实等量，而用来食用的很少，基本作为废料处理，非常浪费资源，而本发明以香蕉花作为原料提取，能够变废为宝，充分利用资源，提高香蕉种植产业的经济价值，另外，由于香蕉花可食用，用来制备生物碱类化合物用于药物中安全性高。

2、本发明从香蕉花中提取得到的生物碱类化合物具有抑制血小板聚集的活性，有望用于抑制血小板聚集药物的制备，具有良好的药用前景，为制备抗血小板药物治疗血栓疾病提供更多的选择。

附图说明

图1为本发明实施例获得化合物的IR(KBr)光谱；

图2为本发明实施例获得化合物的ESI-MS图谱；

图3为本发明实施例获得化合物的HR-ESI-MS图谱；

图4为本发明实施例获得化合物的¹H-NMR图谱；

图5为本发明实施例获得化合物的¹³C-NMR图谱；

图6为本发明实施例获得化合物的HSQC图谱；

图7为本发明实施例获得化合物的HMBC图谱。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例

(1)将新鲜香蕉花8kg晒干，用乙醇浸提3次，每次1天，合并提取液，过滤，在真空度-0.05MPa，温度范围45℃条件下减压浓缩，浓缩后终体积为原溶液体积的15％，获得乙醇提取物；

(2)将乙醇提取物分散基本溶解至水中，依次采用石油醚和乙酸乙酯萃取分别萃取3次，得到乙酸乙酯浸膏；

(3)将乙醇乙酯浸膏溶解于甲醇中，加入100目乙醇乙酯浸膏重量2倍的硅胶拌样，待溶剂挥发干后，通过洗脱液为甲醇的硅胶色谱柱进行洗脱，再通过所述梯度洗脱液为氯仿-甲醇的硅胶色谱柱进行梯度洗脱，硅胶色谱柱梯度洗脱依次以氯仿-甲醇体积比为100:1→60:1→30:1→10:1→5:1进行；

(4)将步骤(3)中60:1梯度洗脱部位的接收液浓缩并通过高效液相色谱依次用体积百分数为20％和体积百分数为26％甲醇进行梯度洗脱，再通过硅胶色谱柱进行梯度洗脱，所述梯度洗脱液为氯仿-甲醇，梯度洗脱依次以氯仿-甲醇体积比为100:1→60:1→30:1→10:1进行；

(5)将步骤(4)中30:1梯度洗脱部位的接收液合浓缩并通过高效液相色谱用体积百分数43％甲醇恒冲，再通过硅胶色谱柱以氯仿-甲醇体积比为15:1进行恒冲，继续通过高效液相色谱用体积百分数40％甲醇恒冲，用氯仿-甲醇体积比为5:1作为溶剂溶解，用毛细管将溶解液点至薄层层析(TLC)硅胶板上，收集并浓缩Rf值为0.5的洗脱液，TLC板上显示为橘红色，所得结晶用甲醇重结晶得到36mg白色粉末状的目标产物。

上述目标产物化学结构式如下：

上述化合物重要HMBC

关系：

上述目标产物的结构分析，其波普特性如下：

UV(MeOH)λmax:221(sh),298nm；IR(KBr)光谱(见图1)中显示含芳香醛基(1641cm^-1)和苯环(1525,1467和1451cm^-1)的特征吸收峰；ESI-MS m/z 298[M+Na]+(见图2)；HR-ESI-MS m/z 298.1051[M+Na]+(计算值C₁₅H₁₇NO₄Na,298.1050)(见图3)，结合¹H-NMR(见图4)和¹³C-NMR(见图5)谱确定分子式为C₁₅H₁₇NO₄，不饱和度为8。

¹H-NMR谱(acetone-d6,500MHz)显示17个质子信号，其中δH 2.83(2H,br.t,J＝7.7Hz)与4.42(2H,br.t,J＝7.7Hz)为一组互相偶合的亚甲基质子信号，推测结构中也含有-CH2-CH2片段。在低场区也可以观察到醛基质子信号δH 9.56(1H,s)和2组互相偶合的芳香质子信号：一组为苯环上ABX偶合质子信号δH 6.52(1H,dd,J＝8.0,2.0Hz),6.72(1H,d,J＝8.0Hz)和6.71(1H,d,J＝2.0)；一组为吡咯环上质子信号δH 6.96(1H,d,J＝4.0Hz)和6.21(1H,d,J＝4.0Hz)。

¹³C-NMR(acetone-d6,125MHz)显示15个碳信号，分别为：1个醛基碳；1组苯环碳信号；1组吡咯环碳信号，1个连氧的甲基碳信号和3个饱和的亚甲基碳信号。结合HSQC(见图6)可以得到C-3/C-4相连，C-5"/C-6"相连以及C-1′/C-2′相连。

上述NMR特征与上述NMR特征与化合物pyrrolezanthine(见Y.P.Yang,M.J.Chen,C.M.Teng,Y.L.Chang,I.L.Tsai,I.S.Chen,Phytochemistry,2002,61(5),567–572.)很相似，其主要区别在于：pyrrolezanthine中苯环为1",4"-对位二取代，而本化合物中苯环为1",3",4"-三取代。上述苯环取代基位置进一步由HMBC(图7)确认：H-2"与C-4"相关，H-5"与C-3"相关以及H-6"与C-2"和C-4"相关，另外，本化合物中羟甲基中的碳信号δC为66.0，低场位移3.7ppm；本实施例化合物的碳谱多出了一个连氧的甲基碳信号δC 57.9，上述2点推测本化合物的羟甲基(CH₂OH)被甲基化CH₂OCH₃，上述推断在HMBC(见图7)得到确认：OMe-6与C-6相关。

综上所述，上述化合物的结构得以确定，命名为3"-hydroxypyrrolezanthine-6-methylether，为一个生物碱类化合物。上述化合物的¹H-NMR和¹³C-NMR信号全归属见表1。

表1上述化合物的¹H-NMR和¹³C-NMR谱数据(acetone-d6,δH 2.04,δC 29.8ppm)

No.	δ<sub>H</sub>	δ<sub>C</sub>
			2		133.3(s)
	6.96(d,4.0)	124.4(d)
			4	6.21(d,4.0)	111.7(d)
5		140.0(s)
			6	4.28(br.s)	66.0(t)
7	9.56(s)	179.8(d)
			1′	4.42(br.t,7.7)	48.5(t)
2′	2.83(br.t,7.7)	37.7(t)
			1″		131.1(s)
2″	6.71(d,2.0)	116.8(d)
			3″		145.9(s)
4″		144.6(s)
			5″	6.72(d,8.0)	116.0(d)
6″	6.52(dd,8.0,2.0)	121.0(d)
			6-OH
6-OMe	3.30(s)	57.9(q)
			3″-OH	7.80(s)
4″-OH	7.70(s)

试验例：生物碱类化合物在制备抑制血小板聚集药物中的应用

1、实验材料

SD大鼠：雄性，SPF级，重量300±20g，购买自广西医科大学动物中心。

试剂与仪器：化合物为实施例分离得到；二磷酸腺苷(ADP)、花生四烯酸(AA)(北京索莱宝科技有限公司)；阿司匹林(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；氯吡格雷(乐普药业股份有限公司)；Agg RAM^TM型血小板聚集仪(美国Helena公司)。

2、实验方法

(1)化合物对二磷酸腺苷(ADP)诱导血小板聚集的作用

SD大鼠经腹主动脉取血，129mmol/L枸橼酸钠抗凝，800r/min离心10min制备富血小板血浆(PRP)；吸取上清PRP后，3500r/min离心10min制备贫血小板血浆(PPP)，用PPP调整PRP至血小板计数为200×10⁹个/L备用。将PRP随机分组，分别为：溶剂对照组(0.9％氯化钠溶液)，阳性对照组(氯吡格雷，1.6mM)，实施例1低浓度组(0.05mM)，实施例1中浓度组(0.1mM)，实施例1高浓度组(0.2mM)。

于血小板聚集仪(37℃)检测石英杯中，分别将相应药物加入调整好浓度的各组PRP中温育5min，再加入终浓度为10μM的ADP诱导血小板聚集，记录3min血小板聚集曲线，测定各组血小板的最大聚集率，并按下式计算受试品对血小板聚集的抑制率：

抑制率＝[(溶剂对照组血小板最大聚集率-受试品血小板最大聚集率)/溶剂对照组血小板最大聚集率]×100％。

(2)化合物对花生四烯酸(AA)诱导血小板聚集的作用

按上述方法制备PRP和PPP，调整PRP至血小板计数为500×10⁹个/L，将PRP随机分组，分别为：溶剂对照组(0.9％氯化钠溶液)，阳性对照组(阿司匹林，0.4mM)，实施例1低剂量组(0.05mM)、实施例1中剂量组(0.1mM)、实施例1高剂量组(0.2mM)。药物孵育PRP后加入终浓度为0.5mM的AA诱导血小板聚集3min，记录血小板的最大聚集率，并计算药物对血小板聚集的抑制率。

(3)化合物对正常血小板的作用

制备PRP和PPP，调整PRP至血小板数目为200×10⁹个/L，将PRP随机分为4组:溶剂对照(生理盐水)组，实施例1低浓度组(0.25g/L)、实施例1中浓度组(0.5g/L)、实施例1高浓度组(1g/L)。用药物孵育PRP后，直接记录血小板聚集曲线和血小板最大聚集率，观察化合物对正常血小板的作用。

3、实验结果

表2化合物对ADP诱导血小板聚集的影响

从表2可知，本发明的化合物对ADP诱导的血小板聚集具有显著的抑制作用且呈剂量效应，剂量高，聚集抑制率就高，化合物的浓度达到0.2mM时，对ADP诱导血小板聚集的抑制作用接近阳性对照氯吡格雷组。

表3化合物对AA诱导血小板聚集的影响

处理	浓度(g/L)	血小板最大聚集(％)	聚集抑制率(％)
				溶剂对照组	/	57.1±4.1	/
阿司匹林组	0.4	17.5±1.3	69.35
				实施例1高浓度组	1	7.8±1.6	86.34
实施例1中浓度组	0.5	16.2±2.0	71.63
				实施例1低浓度组	0.25	27.4±5.7	52.01

从表3可知，本发明的化合物对AA诱导的血小板聚集具有显著的抑制作用且呈剂量效应，剂量高，聚集抑制率就高，当化合物的浓度达到0.5g/L时，对AA诱导血小板聚集的抑制作用就大于阳性对照阿司匹林组，当化合物的浓度达到1g/L时，对AA诱导血小板聚集的抑制作用就远大于阳性对照阿司匹林组。

从表2和表3结果表明本发明的生物碱类化合物具有抑制血小板聚集的活性，有望用于抑制血小板聚集药物的制备。

上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。

Claims (2)

1.生物碱类化合物在制备抑制血小板聚集药物中的应用，其特征在于：所述生物碱类化合物的化学式为：

2.如权利要求1所述生物碱类化合物在制备抑制血小板聚集药物中的应用，其特征在于：所述生物碱类化合物从香蕉花中提取得到。

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