CN104324021A - 银桦酸、银桦酸和对苯二酚及海南裂叶山龙眼活性组分在制备抗肿瘤和抗炎药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种银桦酸、银桦酸和对苯二酚及海南裂叶山龙眼活性组分在制备抗肿瘤和抗炎药物中的应用，属于药物领域。它包括银桦酸在制备抗肿瘤和抗炎药物中的应用、银桦酸和对苯二酚在制备抗肿瘤和抗炎药物中的应用、海南裂叶山龙眼活性组分在制备抗肿瘤和抗炎药物中的应用，所述的肿瘤为起源于人的胃部、肝部、肺部、鼻部、皮肤、头颈部、甲状腺、胰腺、食管、乳腺、肾脏、胆囊、结肠/直肠、卵巢、子宫、子宫颈、前列腺、膀胱、睾丸的原发/继发的癌或肉瘤。本发明在治疗原发/继发的癌或肉瘤有很好的疗效，毒副作用小。
Description
技术领域
本发明属于药物领域，更具体地说，涉及银桦酸、银桦酸和对苯二酚及海南裂叶山龙眼活性组分在制备抗肿瘤和抗炎药物中的应用。
背景技术
众所周知，肿瘤已经成为威胁人类生命和健康最严重的疾病之一，全世界每年约有九百余万人罹患恶性肿瘤。在我国，每年新发病例约为200万，死亡约为140余万人，到了2020年，这些数字可能还会继续增长。在全球，52亿人口中罹患癌症者有2200万人，今后20年新患病人数将持续上涨，因癌症而死亡的人数也将只增不减。因此，找到预防和治疗癌症的有效药物和方法，成为当今社会刻不容缓的任务。目前，国内外抗肿瘤的药物主要为化学合成药物，虽具有一定的疗效，但对肿瘤的远期效果较差，且毒副作用较大，临床应用常受其强烈毒性的制约。与之相比，中草药治疗肿瘤体现多方面的优势，以其疗效独特、毒副作用小、开发潜能巨大引起人们广泛关注，中草药的研究将是抗肿瘤药物开发的有效途径。
抗炎药物是仅次于抗感染药物的第二大类药物，一些中药活性成分如苷类、生物碱类、黄酮类、萜类、挥发油等都具有很好的抗炎作用，而且中药资源丰富，药理作用广泛，具有抗炎作用，免疫调节、清热解毒、活血化淤等药理作用，目前人们越来越重视天然药物中抗炎药物的研究。
海南裂叶山龙眼Heliciopsis lobata(Merr.)Sleum，是山龙眼科假山龙眼属植物，又名调羹树、那托、定朗、大裂叶萝白树，产于海南岛中南部。其叶、茎皮性凉味淡、涩，小毒，具有清热解毒的功效，主治腮腺炎、皮炎等。海南裂叶山龙眼叶在海南民间长期用来治疗恶性肿瘤。目前国内对于裂叶山龙眼的研究主要集中在化学成分的分离提取方面，对于抗肿瘤活性成分没有系统的研究。经文献检索，有研究者(刘明生，何泉泉，靳德军，孔令义，海南裂叶山龙眼的化学成分研究，中国药学杂志，2005，40(12):893-895)研究了海南裂叶山龙眼叶的化学成分，从中分离得到银桦酸等五种化合物，但并没有研究这些化合物的药理活性。中国人民解放军一八七医院(何平，陈艳梅，胡汉杰等，25种海南特有植物抗癌筛选结果初步报告[J]，海南医学，1994，5(2):93-94)曾报道该植物水提取物对小白鼠S180瘤株细胞具有抑制作用，但并未就其具体的抗肿瘤活性组分进行研究，也无法知道什么组分可以起到作用。由于裂叶山龙眼叶子来源广泛，且抗肿瘤药理作用已经得到民间长期的检验，因此，采用简便易行的制备方法，从该植物中提取具有抗肿瘤作用、安全有效的活性组分，确定活性组分的主要组成有助于开发与利用海南裂叶山龙眼药材资源，为制备抗肿瘤天然药物奠定基础，促进中药材产业化，对于发展中药经济具有重要意义。
发明内容
1.要解决的问题
针对现有的抗肿瘤药物远期效果较差，毒副作用较大以及海南裂叶山龙眼活性组分不明确等问题，本发明提供一种银桦酸、银桦酸和对苯二酚及海南裂叶山龙眼活性组分在制备抗肿瘤和抗炎药物中的应用，首次确定了海南裂叶山龙眼活性组分中起到抗肿瘤和抗炎活性的主要成分为银桦酸和对苯二酚。
2.技术方案
为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
银桦酸在制备抗肿瘤和抗炎药物中的应用。
银桦酸和对苯二酚在制备抗肿瘤和抗炎药物中的应用。
海南裂叶山龙眼活性组分在制备抗肿瘤和抗炎药物中的应用。
优选地，上述的在制备抗肿瘤和抗炎药物中的应用，所述的肿瘤为起源于人的胃部、肝部、肺部、鼻部、皮肤、头颈部、甲状腺、胰腺、食管、乳腺、肾脏、胆囊、结肠/直肠、卵巢、子宫、子宫颈、前列腺、膀胱、睾丸的原发/继发的癌或肉瘤。
优选地，所述的海南裂叶山龙眼活性组分为银桦酸和对苯二酚。
上述的海南裂叶山龙眼活性组分的制备方法，其制备步骤如下：
(a)将海南裂叶山龙眼的叶子/茎皮/根皮/花/果实风干，粉碎得到叶子/茎皮/根皮/花/果实的粗粉；
(b)采用水煎煮法对步骤(a)中得到的叶子/茎皮/根皮/花/果实的粗粉进行提取，水的加入量为叶子/茎皮/根皮/花/果实粗粉体积的5～10倍，加热煮沸提取3～4次，每次3～4小时，将提取液过滤后合并，减压浓缩，得到叶子/茎皮/根皮/花/果实的浸膏；
(c)将(b)中得到的叶子/茎皮/根皮/花/果实的浸膏用1:5～1:10倍体积的水进行分散，得到叶子/茎皮/根皮/花/果实的浸膏溶液；
(d)用乙酸乙酯对步骤(c)中得到的叶子/茎皮/根皮/花/果实的浸膏溶液进行萃取，乙酸乙酯与浸膏溶液的体积比为1:1～1:5，萃取3～5次，萃取液合并得到叶子/茎皮/根皮/花/果实的乙酸乙酯的萃取液；
(e)将步骤(d)中得到的叶子/茎皮/根皮/花/果实的乙酸乙酯的萃取液减压浓缩干燥得到活性组分，叶子制备的活性组分定为活性组分Ⅰ-1，茎皮制备的活性组分定为活性组分Ⅰ-2，根皮制备的活性组分定为活性组分Ⅰ-3，花制备的活性组分定为活性组分Ⅰ-4，果实制备的活性组分定为活性组分Ⅰ-5。
上述的海南裂叶山龙眼活性组分的制备方法，其制备步骤如下：
(a)将海南裂叶山龙眼的叶子/茎皮/根皮/花/果实风干，粉碎得到叶子/茎皮/根皮/花/果实的粗粉；
(b)采用水煎煮法对步骤(a)中得到的叶子/茎皮/根皮/花/果实的粗粉进行提取，水的加入量为叶子/茎皮/根皮/花/果实粗粉体积的5～10倍，加热煮沸提取3～4次，每次3～4小时，将提取液过滤后合并，减压浓缩，得叶子/茎皮/根皮/花/果实的浸膏；
(c)将(b)中得到的叶子/茎皮/根皮/花/果实的浸膏用5～20倍质量的水进行分散，得到叶子/茎皮/根皮/花/果实的浸膏溶液；
(d)用大孔吸附树脂色谱柱对步骤(c)中得到的叶子/茎皮/根皮/花/果实的浸膏溶液进行吸附，大孔吸附树脂与浸膏的质量比为1:5～1:20，树脂柱的径高比为1:8～1:15；
(e)用体积浓度为30％～50％乙醇对步骤(d)中得到的吸附了叶子/茎皮/根皮/花/果实浸膏溶液后的大孔吸附树脂柱进行梯度洗脱，乙醇浓度由低到高变换2～5个梯度，每个梯度的洗脱体积为5～10个柱体积，流速为5～15mL/min，收集不同梯度洗脱液，合并所有梯度的洗脱液，经减压浓缩干燥得到活性组分，叶子制备的活性组分定为活性组分Ⅱ-1，茎皮制备的活性组分定为活性组分Ⅱ-2，根皮制备的活性组分定为活性组分Ⅱ-3，花制备的活性组分定为活性组分Ⅱ-4，果实制备的活性组分定为活性组分Ⅱ-5。
优选地，大孔吸附树脂为D101型、AB-8型、HPD450型、DM-130型、YWD O1F型、YWD O1G3型、ADS-17型、D312型、DM301型、HPD750型、LSA-40型、LSA-21型、LSA-10型中的任意一种。
上述的海南裂叶山龙眼活性组分的制备方法，其制备步骤如下：
(a)将海南裂叶山龙眼的叶子/茎皮/根皮/花/果实风干，粉碎得到叶子/茎皮/根皮/花/果实的粗粉；
(b)采用醇提法对步骤(a)中得到的叶子/茎皮/根皮/花/果实的粗粉进行提取，乙醇的体积浓度为30％～70％，乙醇的加入量为叶子/茎皮/根皮/花/果实粗粉体积的5～10倍，回流提取2～4次，每次3～4小时，将提取液过滤后合并，减压浓缩，得叶子/茎皮/根皮/花/果实的浸膏；
(c)将(b)中得到的叶子/茎皮/根皮/花/果实的浸膏用1:5～1:10倍体积的水进行分散，得到叶子/茎皮/根皮/花/果实的浸膏溶液；
(d)用乙酸乙酯对步骤(c)中得到的叶子/茎皮/根皮/花/果实的浸膏溶液进行萃取，乙酸乙酯与浸膏溶液的体积比为1:1～1:5，萃取3～5次，萃取液合并得到叶子/茎皮/根皮/花/果实的乙酸乙酯的萃取液；
(e)将步骤(d)中得到的叶子/茎皮/根皮/花/果实的乙酸乙酯的萃取液减压浓缩干燥得到叶子/茎皮/根皮/花/果实的活性组分。
3.有益效果
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
(1)本发明经过长期的实验摸索，首次发现了银桦酸以及银桦酸和对苯二酚在制备抗肿瘤和抗炎药物中的应用，实验结果表明银桦酸以及银桦酸和对苯二酚对起源于人的胃部、肝部、肺部、鼻部、皮肤、头颈部、甲状腺、胰腺、食管、乳腺、肾脏、胆囊、结肠/直肠、卵巢、子宫、子宫颈、前列腺、膀胱、睾丸的原发/继发的癌或肉瘤有很好的疗效；
(2)本发明中选用不同方法对海南裂叶山龙眼提取了一系列组分，采用MTT法对海南裂叶山龙眼的多种提取组分进行活性检测，找到了一个提取最佳抗肿瘤活性组分的方法，并采用HPLC法对该组分进行分析，然后采用硅胶柱色谱法、凝胶柱色谱法、制备型液相等多种分离手段对该组分进行分离纯化，通过高效液相、质谱、氢谱和碳谱对分离得到化合物的分析，首次确定了海南裂叶山龙眼活性组分中起到抗肿瘤和抗炎活性的主要成分为银桦酸和对苯二酚，并且建立了海南裂叶山龙眼活性组分的制备方法和HPLC同时测定活性组分中银桦酸和对苯二酚含量的方法；
(3)本发明结合发明人的各种知识以及通过大量的数据测试，得出水或有机溶剂萃取以及大孔树脂技术能从海南裂叶山龙眼的叶子/茎皮/根皮/花/果实中提取最佳抗肿瘤活性组分，减少或去除与抗肿瘤和抗炎活性无关的组分，纯化后的组分具有更强的抗肿瘤和抗炎活性，活性更确切，安全性更高，并且副作用少，成本低，具有显著的社会价值和市场价值，具有良好的开发应用前景；
(4)本发明结合文献资料及发明人大量数据测试，发现对苯二酚具有一定的毒性，单独用于制备抗肿瘤和抗炎药物时存在潜在危险性，而银桦酸与对苯二酚混合后用于制备抗肿瘤和抗炎药物能大大削弱对苯二酚的毒性，小鼠体内实验显示两者的混合物具有更高的抗肿瘤活性，且无毒副作用，在抗肿瘤药物中具有更好的应用。
附图说明
图1为海南裂叶山龙眼活性组分的HPLC色谱图，图中1号峰和2号峰的峰面积较大，提示本发明的活性组分主要这两种化合物，其中化合物1(1号峰)的出峰时间为6.3min，化合物2(2号峰)的出峰时间为4.7min；
图2为纯银桦酸的HPLC色谱图，银桦酸的出峰时间为6.3min，对比图1中的HPLC色谱图可以推断化合物1为银桦酸；
图3为银桦酸的质谱图，由质谱可知：ESI-MS m/z179.2[M-H]-.化合物的分子式为C9H8O4，由碎片离子135，可知里面有-COOH；
图4为银桦酸的氢谱图，分析1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)图谱可知：图中的δ7.75(1H,d,J＝16.1Hz)和δ6.35(1H,d,J＝16.1Hz)表明化合物分子中有一组反式双键质子偶合系统，图中苯环上的氢信号为δ6.88(1H,d,2.31Hz)、δ6.72(1H,M,2.31Hz,8.64Hz)和δ6.65(1H,d，8.64Hz)，表明苯环上为三取代，图中活泼氢信号为δ8.84(1H,brs)和δ9.42(1H,brs)，表明化合物分子中有酚羟基。δ12.14(1H，brs)表明分子中有羧基；
图5为银桦酸的碳谱图，由13C-NMR(300MHz，DMSO-d6)谱图结合附图2和附图3可以得知：167.9(C-1)处信号表明化合物分子中羧基与碳碳双键相连，139.6(C-3)处信号表明化合物分子中双键碳与苯环相连，149.8(C’-2)与149.4(C’-5)处信号表明化合物分子中存在苯环连氧的碳；
综合附图1-5的数据分析结果可以确定化合物1为银桦酸；
图6为对苯二酚的HPLC色谱图，对苯二酚的出峰时间为4.7min，对比图1中的HPLC色谱图可以推断化合物2为对苯二酚；
图7为纯对苯二酚的氢谱图，1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)谱图中的δ6.56(4H,s，H-2,3,4,5)和δ8.58(2H,s，-OH)表明化合物分子为对称的苯环结构，结合附图6中的数据查找文献与文献数据对照后，鉴定化合物2为对苯二酚。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
实施例1
水提-乙酸乙酯萃取法制备海南裂叶山龙眼活性组分
采用水煎煮法对海南裂叶山龙眼叶子/茎皮/根皮/花/果实粗粉进行提取，提取液浓缩得到水提物浸膏，浸膏溶解后采用乙酸乙酯萃取，得到活性组分。具体步骤如下：
(a)将海南裂叶山龙眼的叶子/茎皮/根皮/花/果实阴干，粉碎得到250g叶子/茎皮/根皮/花/果实的粗粉；
(b)采用水煎煮法对步骤(a)中得到的叶子/茎皮/根皮/花/果实的粗粉进行提取，水的加入量为叶子/茎皮/根皮/花/果实粗粉体积的10倍，加热煮沸提取3次，每次3小时，将提取液过滤后合并，减压浓缩，得到叶子/茎皮/根皮/花/果实的浸膏；
(c)将(b)中得到的叶子/茎皮/根皮/花/果实的浸膏用1:5倍体积的水进行分散，得到叶子/茎皮/根皮/花/果实的浸膏溶液；
(d)用乙酸乙酯对步骤(c)中得到的叶子/茎皮/根皮/花/果实的浸膏溶液进行萃取，乙酸乙酯与浸膏溶液的体积比为1:3，萃取3次，萃取液合并得到叶子/茎皮/根皮/花/果实的乙酸乙酯的萃取液；
(e)将步骤(d)中得到的叶子/茎皮/根皮/花/果实的乙酸乙酯的萃取液减压浓缩干燥得到活性组分，叶子制备的活性组分定为活性组分Ⅰ-1，茎皮制备的活性组分定为活性组分Ⅰ-2，根皮制备的活性组分定为活性组分Ⅰ-3，花制备的活性组分定为活性组分Ⅰ-4，果实制备的活性组分定为活性组分Ⅰ-5。结果如表1所示。
表1水提-乙酸乙酯萃取法制备海南裂叶山龙眼活性组分
实施例2
水提-大孔吸附树脂法制备海南裂叶山龙眼活性组分
采用水煎煮法对海南裂叶山龙眼叶子/茎皮/根皮/花/果实粗粉进行提取，提取液浓缩得到水提物浸膏，浸膏用水溶解，过大孔吸附树脂色谱柱，采用浓度为30％～50％的乙醇进行梯度洗脱，不同梯度洗脱液合并后减压浓缩，得到活性组分。具体步骤如下：
(a)将海南裂叶山龙眼的叶子/茎皮/根皮/花/果实阴干，粉碎得到250g叶子/茎皮/根皮/花/果实的粗粉；
(b)采用水煎煮法对步骤(a)中得到的叶子/茎皮/根皮/花/果实的粗粉进行提取，水的加入量为叶子/茎皮/根皮/花/果实粗粉体积的10倍，加热煮沸提取3次，每次3小时，将提取液过滤后合并，减压浓缩，得叶子/茎皮/根皮/花/果实的浸膏；
(c)将(b)中得到的叶子/茎皮/根皮/花/果实的浸膏用10倍质量的水进行分散，得到叶子/茎皮/根皮/花/果实的浸膏溶液；
(d)用D101型大孔吸附树脂色谱柱对步骤(c)中得到的叶子/茎皮/根皮/花/果实的浸膏溶液进行吸附，大孔吸附树脂与浸膏的质量比为1:10，树脂柱的径高比为1:8；
(e)依次用体积浓度为30％、40％和50％的乙醇对步骤(d)中得到的吸附了叶子/茎皮/根皮/花/果实浸膏溶液后的大孔吸附树脂柱进行梯度洗脱，乙醇浓度由低到高变换3个梯度，每个梯度的洗脱体积为5个柱体积，流速为10mL/min，收集不同梯度洗脱液，合并所有梯度的洗脱液，经减压浓缩干燥得到活性组分，叶子制备的活性组分定为活性组分Ⅱ-1，茎皮制备的活性组分定为活性组分Ⅱ-2，根皮制备的活性组分定为活性组分Ⅱ-3，花制备的活性组分定为活性组分Ⅱ-4，果实制备的活性组分定为活性组分Ⅱ-5。结果如表2所示。
表2水提-大孔吸附树脂法制备海南裂叶山龙眼活性组分
实施例3
30％醇提-乙酸乙酯萃取法制备海南裂叶山龙眼活性组分
采用30％乙醇溶液对海南裂叶山龙眼叶子/茎皮/根皮/花/果实粗粉进行回流提取，提取液浓缩得到浸膏，浸膏溶解后依次乙酸乙酯萃取，得到活性组分。具体步骤如下：
(a)将海南裂叶山龙眼的叶子/茎皮/根皮/花/果实阴干，粉碎得到250g叶子/茎皮/根皮/花/果实的粗粉；
(b)采用醇提法对步骤(a)中得到的叶子/茎皮/根皮/花/果实的粗粉进行提取，乙醇的体积浓度为30％，乙醇的加入量为叶子/茎皮/根皮/花/果实粗粉体积的10倍，回流提取3次，每次3小时，将提取液过滤后合并，减压浓缩，得叶子/茎皮/根皮/花/果实的浸膏；
(c)将(b)中得到的叶子/茎皮/根皮/花/果实的浸膏用1:5倍体积的水进行分散，得到叶子/茎皮/根皮/花/果实的浸膏溶液；
(d)用乙酸乙酯对步骤(c)中得到的叶子/茎皮/根皮/花/果实的浸膏溶液进行萃取，乙酸乙酯与浸膏溶液的体积比为1:3，萃取3次，萃取液合并得到叶子/茎皮/根皮/花/果实的乙酸乙酯的萃取液；
(e)将步骤(d)中得到的叶子/茎皮/根皮/花/果实的乙酸乙酯的萃取液减压浓缩干燥得到叶子/茎皮/根皮/花/果实的活性组分。结果如表3所示。
表3 30％醇提-乙酸乙酯萃取法制备海南裂叶山龙眼活性组分
实施例4
50％醇提-乙酸乙酯萃取法制备海南裂叶山龙眼活性组分
具体步骤同实施例3，所不同的是步骤(b)中乙醇的体积浓度为50％，结果如表4所示。
表4 50％醇提-乙酸乙酯萃取法制备海南裂叶山龙眼活性组分
实施例5
70％醇提-乙酸乙酯萃取法制备海南裂叶山龙眼活性组分
具体步骤同实施例3，所不同的是步骤(b)中乙醇的体积浓度为70％，结果如表5所示。
表5 70％醇提-乙酸乙酯萃取法制备海南裂叶山龙眼活性组分
实施例6
采用MTT法评价海南裂叶山龙眼活性组分体外抗肿瘤活性
(1)肿瘤细胞株：人宫颈癌Hela细胞
(2)阳性对照药：紫杉醇10μg/mL
(3)海南裂叶山龙眼活性组分：用空白培养基配制成1mg/mL的储备液置于-20℃保存。临用前，用空白培养基稀释配制成终浓度为10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL和100μg/mL的溶液。
(4)试验方法：MTT法检测
人宫颈癌Hela细胞在37℃、5％CO2的培养箱中培养至90％以上的汇合度时用胰蛋白酶消化收集，用培养液重悬细胞并在显微镜下计数，将细胞浓度调整为3×104个/mL，将细胞悬液接种到96孔板中，100μL/孔，并于37℃，5％CO2培养箱中培养过夜。紫杉醇和活性组分用空白培养液稀释到各个预定浓度。待细胞完全贴壁后，将各个稀释液分别加入96孔板中(100μL/孔)。以加入海南裂叶山龙眼活性组分稀释液的作为给药组，以加入紫杉醇作为阳性对照组，以不加任何药物的培养液作为阴性对照组。在37℃，5％CO2培养箱孵育48h。向96孔板中加入5mg/mL的MTT，每孔20μL，继续培养4h。吸掉培养基，每孔加入100μLDMSO溶解。用酶标仪在测定波长为570nm，参比波长为630nm处测定吸光值，并计算生长抑制率(proliferation inhibition,PI)，公式如下：
PI(％)＝1－给药组/阴性组
试验得到的结果以mean±SD表示，并进行统计T检验，*P<0.05为显著性差异，**P<0.01为极显著性差异。根据生长抑制率，采用spss软件计算各药物对肿瘤细胞的IC50值，结果如表6所示。
根据活性测定结果，发现活性组分Ⅰ-2(即茎皮经水提-乙酸乙酯萃取后的活性组分)的体外抗肿瘤活性最高，用HPLC法对该活性组分进行分析，色谱条件为：仪器为高效液相色谱仪为岛津LC-2010A；色谱柱为COSMOSIL(4.6×250mm，5μm)C18ODS柱；流动相：A相：乙腈；B相：水+0.1％乙酸(体积分数)
流速：1mL/min；波长：287nm；柱温：25℃；进样量：20μL。结果如附图1所示。随后采用硅胶柱、凝胶柱、半制备型液相对活性组分Ⅰ-2进行进一步分离纯化，得到化合物1和化合物2。采用HPLC法对化合物1分析，结果如附图2所示。对化合物1分别进行质谱、氢谱和碳谱分析，结果如附图3、附图4、附图5所示，通过解谱得出化合物1为银桦酸。采用HPLC法对化合物2分析，结果如附图6所示，氢谱分析结果如图7所示，通过解谱得出化合物2为对苯二酚。HPLC法分析活性组分Ⅰ-2显示该组分中主要成分为银桦酸和对苯二酚，提示该活性组分中起到抗肿瘤和抗炎活性的主要成分为银桦酸和对苯二酚。
采用HPLC的方法测定海南裂叶山龙眼活性组分中银桦酸和对苯二酚的含量。
(1)色谱条件
仪器：高效液相色谱仪为岛津LC-2010A
色谱柱：COSMOSIL(4.6×250mm，5μm)C18ODS
流动相：A相：乙腈；B相：水+0.1％乙酸
流速：1mL/min；波长：287nm；柱温：25℃；进样量：20μL。
(2)对照品溶液配制
精密称取银桦酸和对苯二酚对照品各100mg，分别转移至50mL容量瓶中，用20％的甲醇溶解，定容，配成2mg/mL的标准品溶液，冷藏保存备用。
(3)银桦酸和对苯二酚标准曲线绘制
分别精密吸取银桦酸标准溶液100μL、200μL、300μL、400μL、500μL至1mL容量瓶中，加20％的甲醇定容至刻度，分别稀释成0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL的标准溶液。在色谱条件下各浓度溶液分别进样三次，记录色谱图。以银桦酸的峰面积为纵坐标，以标准溶液的浓度为横坐标，进行线性回归拟合，得回归方程：y＝6.12×107x-109068，R2＝0.99，表明浓度在0.2mg/mL-1.0mg/mL时，线性良好。
分别精密吸取对苯二酚标准溶液100μL、200μL、300μL、400μL、500μL至1mL容量瓶中，加20％的甲醇定容至刻度。分别稀释成0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL的标准溶液。在色谱条件下各浓度溶液分别进样三次，记录色谱图。以对苯二酚的峰面积为纵坐标，以标准溶液的浓度为横坐标，进行线性回归拟合，得回归方程：y＝1.91×107x-63628，R2＝0.99，表明浓度在0.2mg/mL-1.0mg/mL时，线性良好。
(4)样品溶液配制
精密称取制备的海南裂叶山龙眼活性组分50mg，转移至50mL容量瓶中，用20％的甲醇溶解，定容，配成1mg/mL的待测样品溶液，冷藏保存备用。
(5)样品含量测定方法
对待测样品溶液在色谱条件下进行分析，记录银桦酸和对苯二酚的峰面积。由标准曲线求得活性组分中银桦酸和对苯二酚的浓度并计算含量。结果如表6所示。
表6海南裂叶山龙眼活性组分主药的含量测定及活性测定
根据MTT法活性测定的结果，发现活性组分Ⅰ-2(即茎皮经水提-乙酸乙酯萃取后的活性组分)的体外抗肿瘤活性最高，后面的实施例中均对活性组分Ⅰ-2的体内抗肿瘤活性进行考察。
实施例7
海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2对人胃癌MGC-803裸鼠异种移植肿瘤生长抑制作用
取对数生长期的人胃癌MGC-803细胞株，在无菌条件下制备成5×107/ml细胞悬液，以0.1ml接种于裸鼠右侧腋窝皮下。用游标卡尺测量裸鼠移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm3后动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试活性组分的抗肿瘤效果。肿瘤直径的测量次数为每2天1次，每次测量同时还需称量鼠重。给药方式均采用皮下注射。阴性对照组注射等量生理盐水，每天1次；紫杉醇组10mg/kg，每周给药1次；海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2高中低组分别以200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg，每天给药1次。肿瘤体积计算公式：
TV＝0.52×a×b2
其中a、b分别表示长宽。根据测量的结果计算出相对肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/C(％)，计算公式如下：
T/C(％)＝TRTV/CRTV×100％
TRTV：治疗组RTV；CRTV：阴性对照组RTV
表7.海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2对人胃癌MGC-803裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用
结果：见表7，紫杉醇10mg/kg组对人胃癌MGC-803裸鼠移植瘤的抑瘤率为70.4％；海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2高、中、低剂量组对人胃癌MGC-803裸鼠移植瘤的抑瘤率分别为65.5％，51.9％，40.3％。但紫杉醇毒性较大，动物体重下降明显，实验过程中动物有死亡。而海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2对实验动物体重无显著性影响。
实施例8
海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2对人肝癌Bel-7402裸鼠异种移植肿瘤生长抑制作用
取对数生长期的人肝癌Bel-7402细胞株，在无菌条件下制备成5×107/ml细胞悬液，以0.1ml接种于裸鼠右侧腋窝皮下。用游标卡尺测量裸鼠移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm3后动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试活性组分的抗肿瘤效果。肿瘤直径的测量次数为每2天1次，每次测量同时还需称量鼠重。给药方式均采用皮下注射。阴性对照组注射等量生理盐水，每天1次；紫杉醇组10mg/kg，每周给药1次；海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2高中低组分别以200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg，每天给药1次。试验结束后，小鼠处死，手术剥取瘤块称重。
表8.海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2对人肝癌Bel-7402裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用
结果：见表8，紫杉醇10mg/kg组对人肝癌Bel-7402裸鼠移植瘤的抑瘤率为72.8％；活性组分Ⅰ-2高、中、低剂量组对人肝癌Bel-7402裸鼠移植瘤的抑瘤率分别达69.7％，62.6％，58.3％。但紫杉醇毒性较大，动物体重下降，实验过程中动物有死亡。而活性组分Ⅰ-2对裸鼠体重没有显著性影响。
实施例9
海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2对人肺癌H460裸鼠异种移植肿瘤生长抑制作用
取对数生长期的人肺癌H460细胞株，在无菌条件下制备成5×107/ml细胞悬液，以0.1ml接种于裸鼠右侧腋窝皮下。用游标卡尺测量裸鼠移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm3后动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试活性组分的抗肿瘤效果。肿瘤直径的测量次数为每2天1次，每次测量同时还需称量鼠重。给药方式均采用皮下注射。阴性对照组注射等量生理盐水，每天1次；紫杉醇组10mg/kg，每周给药1次；海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2高中低组分别以200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg，每天给药1次。试验结束后，小鼠处死，手术剥取瘤块称重。
表9.海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2对人肺癌H460裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用
结果：见表9，紫杉醇10mg/kg组对人肺癌H460裸鼠移植瘤的抑瘤率为70.1％；活性组分Ⅰ-2高、中、低剂量组对人肺癌H460裸鼠移植瘤的抑瘤率分别达67.7％，57.1％，41.2％。但紫杉醇毒性较大，动物体重下降，实验过程中动物有死亡。而活性组分Ⅰ-2对裸鼠体重没有显著性影响。
实施例10
海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2对人鼻咽癌CNE裸鼠异种移植肿瘤生长抑制作用
取对数生长期的人鼻咽癌CNE细胞株，在无菌条件下制备成5×107/ml细胞悬液，以0.1ml接种于裸鼠右侧腋窝皮下。用游标卡尺测量裸鼠移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm3后动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试活性组分的抗肿瘤效果。肿瘤直径的测量次数为每2天1次，每次测量同时还需称量鼠重。给药方式均采用皮下注射。阴性对照组注射等量生理盐水，每天1次；紫杉醇组10mg/kg，每周给药1次；海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2高中低组分别以200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg，每天给药1次。试验结束后，小鼠处死，手术剥取瘤块称重。
表10.海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2对人鼻咽癌CNE裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用
结果：见表10，紫杉醇10mg/kg组对人鼻咽癌CNE裸鼠移植瘤的抑瘤率为73.8％；活性组分Ⅰ-2高、中、低剂量组对人鼻咽癌CNE裸鼠移植瘤的抑瘤率分别达68.8％，58.5％，46.3％。但紫杉醇毒性较大，动物体重下降，实验过程中动物有死亡。而活性组分Ⅰ-2对裸鼠体重没有显著性影响。
实施例11
海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2对人食管癌Ec109裸鼠异种移植肿瘤生长抑制作用
取对数生长期的人食管癌Ec109细胞株，在无菌条件下制备成5×107/ml细胞悬液，以0.1ml接种于裸鼠右侧腋窝皮下。用游标卡尺测量裸鼠移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm3后动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试活性组分的抗肿瘤效果。肿瘤直径的测量次数为每2天1次，每次测量同时还需称量鼠重。给药方式均采用皮下注射。阴性对照组注射等量生理盐水，每天1次；紫杉醇组10mg/kg，每周给药1次；海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2高中低组分别以200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg，每天给药1次。试验结束后，小鼠处死，手术剥取瘤块称重。
表11.海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2对人食管癌Ec109裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用
结果：见表11，紫杉醇10mg/kg组对人食管癌Ec109裸鼠移植瘤的抑瘤率为72.8％；活性组分Ⅰ-2高、中、低剂量组对人食管癌Ec109裸鼠移植瘤的抑瘤率分别达65.5％，54.7％，43.5％。但紫杉醇毒性较大，动物体重下降，实验过程中动物有死亡。而活性组分Ⅰ-2对裸鼠体重没有显著性影响。
实施例12
海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2对人甲状腺癌SW-579裸鼠异种移植肿瘤生长抑制作用
取对数生长期的人甲状腺癌SW-579细胞株，在无菌条件下制备成5×107/ml细胞悬液，以0.1ml接种于裸鼠右侧腋窝皮下。用游标卡尺测量裸鼠移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm3后动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试活性组分的抗肿瘤效果。肿瘤直径的测量次数为每2天1次，每次测量同时还需称量鼠重。给药方式均采用皮下注射。阴性对照组注射等量生理盐水，每天1次；紫杉醇组10mg/kg，每周给药1次；海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2高中低组分别以200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg，每天给药1次。试验结束后，小鼠处死，手术剥取瘤块称重。
表12.海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2对人甲状腺癌SW-579裸鼠异种移植肿瘤生长抑制作用
结果：见表12，紫杉醇10mg/kg组对人甲状腺癌SW-579裸鼠移植瘤的抑瘤率为70.1％；活性组分Ⅰ-2高、中、低剂量组对人甲状腺癌SW-579裸鼠移植瘤的抑瘤率分别达65.4％，60.0％，55.5％。但紫杉醇毒性较大，动物体重下降，实验过程中动物有死亡。而活性组分Ⅰ-2对裸鼠体重没有显著性影响。
实施例13
海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2对人胰腺癌SW-1990裸鼠异种移植肿瘤生长抑制作用
取对数生长期的人胰腺癌SW-1990细胞株，在无菌条件下制备成5×107/ml细胞悬液，以0.1ml接种于裸鼠右侧腋窝皮下。用游标卡尺测量裸鼠移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm3后动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试活性组分的抗肿瘤效果。肿瘤直径的测量次数为每2天1次，每次测量同时还需称量鼠重。给药方式均采用皮下注射。阴性对照组注射等量生理盐水，每天1次；紫杉醇组10mg/kg，每周给药1次；海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2高中低组分别以200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg，每天给药1次。试验结束后，小鼠处死，手术剥取瘤块称重。
表13.海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2对人胰腺癌SW-1990裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用
结果：见表13，紫杉醇10mg/kg组对人胰腺癌SW-1990裸鼠移植瘤的抑瘤率为70.9％；活性组分Ⅰ-2高、中、低剂量组对人胰腺癌SW-1990裸鼠移植瘤的抑瘤率分别达68.2％，59.2％，50.6％。但紫杉醇毒性较大，动物体重下降，实验过程中动物有死亡。而活性组分Ⅰ-2对裸鼠体重没有显著性影响。
实施例14
海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2对人乳腺癌MDA-MB-231裸鼠异种移植肿瘤生长抑制作用
取对数生长期的人乳腺癌MDA-MB-231细胞株，在无菌条件下制备成5×107/ml细胞悬液，以0.1ml接种于裸鼠右侧腋窝皮下。用游标卡尺测量裸鼠移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm3后动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试活性组分的抗肿瘤效果。肿瘤直径的测量次数为每2天1次，每次测量同时还需称量鼠重。给药方式均采用皮下注射。阴性对照组注射等量生理盐水，每天1次；紫杉醇组10mg/kg，每周给药1次；海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2高中低组分别以200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg，每天给药1次。试验结束后，小鼠处死，手术剥取瘤块称重。
表14.海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2对人乳腺癌MDA-MB-231裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用
结果：见表14，紫杉醇10mg/kg组对人乳腺癌MDA-MB-231裸鼠移植瘤的抑瘤率为72.5％；活性组分Ⅰ-2高、中、低剂量组对人乳腺癌MDA-MB-231裸鼠移植瘤的抑瘤率分别达67.7％，64.6％，51.2％。但紫杉醇毒性较大，动物体重下降，实验过程中动物有死亡。而活性组分Ⅰ-2对裸鼠体重没有显著性影响。
实施例15
海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2对人肾癌A498裸鼠异种移植肿瘤生长抑制作用
取对数生长期的人肾癌A498细胞株，在无菌条件下制备成5×107/ml细胞悬液，以0.1ml接种于裸鼠右侧腋窝皮下。用游标卡尺测量裸鼠移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm3后动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试活性组分的抗肿瘤效果。肿瘤直径的测量次数为每2天1次，每次测量同时还需称量鼠重。给药方式均采用皮下注射。阴性对照组注射等量生理盐水，每天1次；紫杉醇组10mg/kg，每周给药1次；海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2高中低组分别以200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg，每天给药1次。试验结束后，小鼠处死，手术剥取瘤块称重。
表15.海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2对人肾癌A498裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用
结果：见表15，紫杉醇10mg/kg组对人肾癌A498裸鼠移植瘤的抑瘤率为76.7％；活性组分Ⅰ-2高、中、低剂量组对人肾癌A498裸鼠移植瘤的抑瘤率分别达62.1％，56.7％，46.7％。但紫杉醇毒性较大，动物体重下降，实验过程中动物有死亡。而活性组分Ⅰ-2对裸鼠体重没有显著性影响。
实施例16
海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2对人胆囊癌GBC-SD裸鼠异种移植肿瘤生长抑制作用
取对数生长期的人胆囊癌GBC-SD细胞株，在无菌条件下制备成5×107/ml细胞悬液，以0.1ml接种于裸鼠右侧腋窝皮下。用游标卡尺测量裸鼠移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm3后动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试活性组分的抗肿瘤效果。肿瘤直径的测量次数为每2天1次，每次测量同时还需称量鼠重。给药方式均采用皮下注射。阴性对照组注射等量生理盐水，每天1次；紫杉醇组10mg/kg，每周给药1次；海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2高中低组分别以200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg，每天给药1次。试验结束后，小鼠处死，手术剥取瘤块称重。
表16.海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2对人胆囊癌GBC-SD裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用
结果：见表16，紫杉醇10mg/kg组对人胆囊癌GBC-SD裸鼠移植瘤的抑瘤率为74.0％；活性组分Ⅰ-2高、中、低剂量组对人胆囊癌GBC-SD裸鼠移植瘤的抑瘤率分别达65.9％，58.7％，49.0％。但紫杉醇毒性较大，动物体重下降，实验过程中动物有死亡。而活性组分Ⅰ-2对裸鼠体重没有显著性影响。
实施例17
海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2对人结肠癌HT-29裸鼠异种移植肿瘤生长抑制作用
取对数生长期的人结肠癌HT-29细胞株，在无菌条件下制备成5×107/ml细胞悬液，以0.1ml接种于裸鼠右侧腋窝皮下。用游标卡尺测量裸鼠移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm3后动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试活性组分的抗肿瘤效果。肿瘤直径的测量次数为每2天1次，每次测量同时还需称量鼠重。给药方式均采用皮下注射。阴性对照组注射等量生理盐水，每天1次；紫杉醇组10mg/kg，每周给药1次；海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2高中低组分别以200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg，每天给药1次。试验结束后，小鼠处死，手术剥取瘤块称重。
表17.海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2对人结肠癌HT-29裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用
结果：见表17，紫杉醇10mg/kg组对人结肠癌HT-29裸鼠移植瘤的抑瘤率为72.3％；活性组分Ⅰ-2高、中、低剂量组对人结肠癌HT-29裸鼠移植瘤的抑瘤率分别达63.7％，60.8％，39.7％。但紫杉醇毒性较大，动物体重下降，实验过程中动物有死亡。而活性组分Ⅰ-2对裸鼠体重没有显著性影响。
实施例18
海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2对人卵巢癌SK-OV-3裸鼠异种移植肿瘤生长抑制作用
取对数生长期的人卵巢癌SK-OV-3细胞株，在无菌条件下制备成5×107/ml细胞悬液，以0.1ml接种于裸鼠右侧腋窝皮下。用游标卡尺测量裸鼠移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm3后动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试活性组分的抗肿瘤效果。肿瘤直径的测量次数为每2天1次，每次测量同时还需称量鼠重。给药方式均采用皮下注射。阴性对照组注射等量生理盐水，每天1次；紫杉醇组10mg/kg，每周给药1次；海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2高中低组分别以200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg，每天给药1次。试验结束后，小鼠处死，手术剥取瘤块称重。
表18.海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2对人卵巢癌SK-OV-3裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用
结果：见表18，紫杉醇10mg/kg组对人卵巢癌SK-OV-3裸鼠移植瘤的抑瘤率为74.9％；活性组分Ⅰ-2高、中、低剂量组对人卵巢癌SK-OV-3裸鼠移植瘤的抑瘤率分别达69.6％，56.6％，50.6％。但紫杉醇毒性较大，动物体重下降，实验过程中动物有死亡。而活性组分Ⅰ-2对裸鼠体重没有显著性影响。
实施例19
海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2对人子宫内膜癌HHUA裸鼠异种移植肿瘤生长抑制作用
取对数生长期的人子宫内膜癌HHUA细胞株，在无菌条件下制备成5×107/ml细胞悬液，以0.1ml接种于裸鼠右侧腋窝皮下。用游标卡尺测量裸鼠移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm3后动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试活性组分的抗肿瘤效果。肿瘤直径的测量次数为每2天1次，每次测量同时还需称量鼠重。给药方式均采用皮下注射。阴性对照组注射等量生理盐水，每天1次；紫杉醇组10mg/kg，每周给药1次；海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2高中低组分别以200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg，每天给药1次。试验结束后，小鼠处死，手术剥取瘤块称重。
表19.海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2对人子宫内膜癌HHUA裸鼠异种移植肿瘤生长抑制作用
结果：见表19，紫杉醇10mg/kg组对人子宫内膜癌HHUA裸鼠移植瘤的抑瘤率为74.2％；活性组分Ⅰ-2高、中、低剂量组对人子宫内膜癌HHUA裸鼠移植瘤的抑瘤率分别达70.2％，56.0％，49.6％。但紫杉醇毒性较大，动物体重下降，实验过程中动物有死亡。而活性组分Ⅰ-2对裸鼠体重没有显著性影响。
实施例20
海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2对人宫颈癌HeLa裸鼠异种移植肿瘤生长抑制作用
取对数生长期的人宫颈癌HeLa细胞株，在无菌条件下制备成5×107/ml细胞悬液，以0.1ml接种于裸鼠右侧腋窝皮下。用游标卡尺测量裸鼠移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm3后动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试活性组分的抗肿瘤效果。肿瘤直径的测量次数为每2天1次，每次测量同时还需称量鼠重。给药方式均采用皮下注射。阴性对照组注射等量生理盐水，每天1次；紫杉醇组10mg/kg，每周给药1次；海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2高中低组分别以200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg，每天给药1次。试验结束后，小鼠处死，手术剥取瘤块称重。
表20.海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2对人宫颈癌HeLa裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用
结果：见表20，紫杉醇10mg/kg组对人宫颈癌HeLa裸鼠移植瘤的抑瘤率为76.3％；活性组分Ⅰ-2高、中、低剂量组对人宫颈癌HeLa裸鼠移植瘤的抑瘤率分别达71.5％，55.9％，35.5％。但紫杉醇毒性较大，动物体重下降，实验过程中动物有死亡。而活性组分Ⅰ-2对裸鼠体重没有显著性影响。
实施例21
海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2对人前列腺癌DU-145裸鼠异种移植肿瘤生长抑制作用
取对数生长期的人前列腺癌DU-145细胞株，在无菌条件下制备成5×107/ml细胞悬液，以0.1ml接种于裸鼠右侧腋窝皮下。用游标卡尺测量裸鼠移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm3后动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试活性组分的抗肿瘤效果。肿瘤直径的测量次数为每2天1次，每次测量同时还需称量鼠重。给药方式均采用皮下注射。阴性对照组注射等量生理盐水，每天1次；紫杉醇组10mg/kg，每周给药1次；海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2高中低组分别以200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg，每天给药1次。试验结束后，小鼠处死，手术剥取瘤块称重。
表21.海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2对人前列腺癌DU-145裸鼠异种移植肿瘤生长抑制作用
结果：见表21，紫杉醇10mg/kg组对人前列腺癌DU-145裸鼠移植瘤的抑瘤率为71.1％；活性组分Ⅰ-2高、中、低剂量组对人前列腺癌DU-145裸鼠移植瘤的抑瘤率分别达67.9％，56.1％，36.2％。但紫杉醇毒性较大，动物体重下降，实验过程中动物有死亡。而活性组分Ⅰ-2对裸鼠体重没有显著性影响。
实施例22
海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2对人膀胱癌HT1376裸鼠异种移植肿瘤生长抑制作用
取对数生长期的人膀胱癌HT1376细胞株，在无菌条件下制备成5×107/ml细胞悬液，以0.1ml接种于裸鼠右侧腋窝皮下。用游标卡尺测量裸鼠移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm3后动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试活性组分的抗肿瘤效果。肿瘤直径的测量次数为每2天1次，每次测量同时还需称量鼠重。给药方式均采用皮下注射。阴性对照组注射等量生理盐水，每天1次；紫杉醇组10mg/kg，每周给药1次；海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2高中低组分别以200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg，每天给药1次。试验结束后，小鼠处死，手术剥取瘤块称重。
表22.海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2对人膀胱癌HT1376裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用
结果：见表22，紫杉醇10mg/kg组对人膀胱癌HT1376裸鼠移植瘤的抑瘤率为75.5％；活性组分Ⅰ-2高、中、低剂量组对人膀胱癌HT1376裸鼠移植瘤的抑瘤率分别达71.9％，62.3％，45.4％。但紫杉醇毒性较大，动物体重下降，实验过程中动物有死亡。而活性组分Ⅰ-2对裸鼠体重没有显著性影响。
实施例23
海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2对人睾丸癌5637裸鼠异种移植肿瘤生长抑制作用
取对数生长期的人睾丸癌5637细胞株，在无菌条件下制备成5×107/ml细胞悬液，以0.1ml接种于裸鼠右侧腋窝皮下。用游标卡尺测量裸鼠移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm3后动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试活性组分的抗肿瘤效果。肿瘤直径的测量次数为每2天1次，每次测量同时还需称量鼠重。给药方式均采用皮下注射。阴性对照组注射等量生理盐水，每天1次；紫杉醇组10mg/kg，每周给药1次；海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2高中低组分别以200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg，每天给药1次。试验结束后，小鼠处死，手术剥取瘤块称重。
表23.海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2对人睾丸癌5637裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用
结果：见表23，紫杉醇10mg/kg组对人睾丸癌5637裸鼠移植瘤的抑瘤率为74.0％；活性组分Ⅰ-2高、中、低剂量组对人睾丸癌5637裸鼠移植瘤的抑瘤率分别达70.9％，60.6％，47.4％。但紫杉醇毒性较大，动物体重下降，实验过程中动物有死亡。而活性组分Ⅰ-2对裸鼠体重没有显著性影响。
实施例24
海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2对人肉瘤HT-1080裸鼠异种移植肿瘤生长抑制作用
取对数生长期的人肉瘤HT-1080细胞株，在无菌条件下制备成5×107/ml细胞悬液，以0.1ml接种于裸鼠右侧腋窝皮下。用游标卡尺测量裸鼠移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm3后动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试活性组分的抗肿瘤效果。肿瘤直径的测量次数为每2天1次，每次测量同时还需称量鼠重。给药方式均采用皮下注射。阴性对照组注射等量生理盐水，每天1次；紫杉醇组10mg/kg，每周给药1次；海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2高中低组分别以200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg，每天给药1次。试验结束后，小鼠处死，手术剥取瘤块称重。
表24.海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2对人肉瘤HT-1080裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用
结果：见表24，紫杉醇10mg/kg组对人肉瘤HT-1080裸鼠移植瘤的抑瘤率为76.7％；活性组分Ⅰ-2高、中、低剂量组对人肉瘤HT-1080裸鼠移植瘤的抑瘤率分别达72.1％，64.4％，58.3％。但紫杉醇毒性较大，动物体重下降，实验过程中动物有死亡。而活性组分Ⅰ-2对裸鼠体重没有显著性影响。
实施例25
海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2对冰醋酸所致小白鼠腹腔毛细管通透性增加的影响
本实验通过给小鼠腹腔注射冰醋酸致使小鼠腹腔毛细管的通透性增加，通过考察不同组分对小鼠腹腔毛细管通透性影响，来评价各组分抗急性炎症的活性。
取昆明小白鼠50只，随机将其分为5组，每组10只，分别为模型组，地塞米松阳性组(10mg/kg)，活性组分Ⅰ-2高、中、低给药组(剂量分别为100、50、25mg/kg)为实验组。每日腹腔注射给药1次，模型组给予同体积生理盐水，连续5d，正常饲喂。于末次给药后第1小时，尾静脉注射5g/L伊文思蓝生理盐水溶液10mL/kg，随即腹腔注射10mL/kg HAc溶液(6mL/L)致炎。20min后颈椎脱臼处死小鼠，腹腔注射5mL生理盐水，轻揉腹部2min，剪开腹腔，收集腹腔洗液，4000r/min离心10min,取上清液1mL，加入3mL生理盐水得到4mL的稀释液，用紫外分光光度计于590nm波长测定稀释液的吸收度OD值，以OD590nm值表示色素渗出量，考察小白鼠腹腔毛细血管通透性。
表25海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2对冰醋酸所致小白鼠腹腔毛细管通透性增加的影响
注：与空白对照组比较*P<0.05为显著性差异，**P<0.01为极显著性差异。
结果表明：海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2能显著抑制醋酸所致小鼠腹腔毛细血管透性的增加，且具有剂量依赖效应，剂量越大，作用越强。
实施例26
海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2对二甲苯所致小白鼠耳肿胀的影响
本实验通过给小鼠耳朵涂抹二甲苯致使小鼠耳肿胀，通过考察不同组分对小鼠耳肿胀的影响，来评价各组分抗急性炎症的活性。
取昆明小鼠50只，分为5组，每组10只，编号。以生理盐水组为空白对照组，以阿司匹林组(200mg/kg)为阳性对照组，活性组分Ⅰ-2高、中、低剂量(100、50、25mg/kg)为实验组。小鼠灌胃，每日1次，连续5天。空白对照组给予等体积生理盐水。末次给药1h后，于小鼠右耳两面涂二甲苯0.05mL致炎，左耳不涂为正常耳。2h后脱臼处死小鼠，沿耳廓剪下两耳，用打孔器取耳片、称重、计算肿胀度及肿胀率。肿胀度＝右耳片重-左耳片重，肿胀率＝(肿胀度/左耳片重)×100％。
表26海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2对二甲苯所致小白鼠耳肿胀的影响
注：与空白对照组比较*P<0.05为显著性差异，**P<0.01为极显著性差异。
结果表明，海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2高、中、低3个剂量组均对二甲苯致小鼠耳肿胀有明显的抑制作用，且具有剂量依赖效应，剂量越大，作用越强。
实施例27
海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2对棉球所致小白鼠肉芽肿的影响
本实验通过给小鼠皮下植入棉球致使小鼠出现肉芽肿，通过考察各组分对小鼠肉芽肿的影响，来评价各组分抗慢性炎症的活性。
用分析天平精确称取脱脂棉50份，每份5mg，团成形状和大小基本相同的球形。1.5kpa高压灭菌30min，50℃烘干，备用。
取昆明小白鼠50只，将其随机分为5组，每组10只。分别为模型组，地塞米松阳性组(10mg/kg)，活性组分Ⅰ-2高、中、低剂量组(100、50、25mg/kg)为实验组。于给药前将小白鼠用乙醚麻醉，于腹部切口，从切口向两侧腹股沟下各植入一枚5mg的灭菌棉球，缝合切口，切口处用750mL/L酒精消毒。术后当天起按组别每日腹腔注射给药1次，连续7d。在末次给药后第24小时颈椎脱臼处死小白鼠，切开腹股沟皮肤，将棉球同周围肉芽组织一起取出，剔除周围组织。置60℃烘箱中连续干燥48h后，精密称取重量。并计算肉芽肿净重量：肉芽肿净重＝棉球肉芽肿的重量-5mg棉球重量)。
表27海南裂叶山龙眼活性组分对棉球所致小白鼠肉芽肿的影响
注：与空白对照组比较*P<0.05为显著性差异，**P<0.01为极显著性差异。
结果表明，海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2高、中、低3个剂量组均对棉球致小鼠肉芽肿有明显的抑制作用，且具有剂量依赖效应，剂量越大，作用越强。
实施例28
海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2对角叉菜胶诱导的大鼠足趾肿胀的影响
本实验通过给大鼠后足趾皮注射角叉菜胶致使大鼠出现足趾肿胀，通过考察各组分对大鼠后趾肿胀的影响，来评价各组分抗急性炎症的活性。
取SD大白鼠50只，将其随机分为5组，每组10只，分别为模型组，地塞米松阳性组(5mg/kg)和活性组分Ⅰ-2高、中、低剂量组(100、50、25mg/kg)为实验组。每日腹腔注射给药1次，模型组给予同体积生理盐水，连续3d，正常饲喂。末次给药后第1小时，于大鼠右后足跖皮下注射1％角叉菜胶0.1mL致炎，分别于致炎后1h，3h，5h，7h测量足容积。按照下列公式计算足肿胀度：足肿胀度(mL)＝致炎后足容积—致炎前容积。记录溢出液体的毫升数(方法：右关节的突出点处用圆珠笔划圈作为测量标志，依次将各鼠右后足放入容积测量器内，使后肢暴露在筒外，浸入的深度以划圈处与液面重合为度。该足进入液体后，液面升高，溢出液体的体积即为该鼠的右后足的体积，依次测定各鼠右后足的正常体积)。
表28海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2对角叉菜胶诱导的大鼠足趾肿胀的影响
注：与空白对照组比较*P<0.05为显著性差异，**P<0.01为极显著性差异。
结果表明，海南裂叶山龙眼活性组分Ⅰ-2高、中、低3个剂量组均对角叉菜胶诱导的大鼠足趾肿胀有明显的抑制作用。
实施例29
银桦酸对Hela细胞的体外抗肿瘤作用
人宫颈癌Hela细胞在37℃、5％CO2的培养箱中培养至90％以上的汇合度时用胰蛋白酶消化收集，用培养液重悬细胞并在显微镜下计数，将细胞浓度调整为3×104个/mL，将细胞悬液接种到96孔板中，100μL/孔，并于37℃，5％CO2培养箱中培养过夜。紫杉醇和活性组分用空白培养液稀释到各个预定浓度。待细胞完全贴壁后，将各个稀释液分别加入96孔板中(100μL/孔)。以银桦酸作为给药组，以加入紫杉醇作为阳性对照组，以不加任何药物的培养液作为阴性对照组。在37℃，5％CO2培养箱孵育48h。向96孔板中加入5mg/mL的MTT，每孔20μL，继续培养4h。吸掉培养基，每孔加入100μL DMSO溶解。用酶标仪在测定波长为570nm，参比波长为630nm处测定吸光值，并计算生长抑制率(proliferation inhibition,PI)，公式如下：
PI(％)＝1－给药组/阴性组
试验得到的结果以mean±SD表示，并进行统计T检验，*P<0.05为显著性差异，**P<0.01为极显著性差异。实验结果如表29所示。
表29银桦酸抑制Hela细胞的增殖抑制作用
结果显示与阴性对照相比，银桦酸能显著抑制Hela细胞的增殖，并且呈现明显的剂量依赖关系。
实施例30
银桦酸对人宫颈癌HeLa裸鼠异种移植肿瘤生长抑制作用
本实验通过给小鼠腹腔注射冰醋酸致使小鼠腹腔毛细管的通透性增加，通过考察对小鼠腹腔毛细管通透性影响，来评价银桦酸抗急性炎症的活性。
取对数生长期的人宫颈癌HeLa细胞株，在无菌条件下制备成5×107/ml细胞悬液，以0.1ml接种于裸鼠右侧腋窝皮下。用游标卡尺测量裸鼠移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm3后动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试活性组分的抗肿瘤效果。肿瘤直径的测量次数为每2天1次，每次测量同时还需称量鼠重。给药方式均采用皮下注射。阴性对照组注射等量生理盐水，每天1次；紫杉醇组10mg/kg，每周给药1次；银桦酸高中低组分别以100mg/kg、50mg/kg、25mg/kg，每天给药1次。试验结束后，小鼠处死，手术剥取瘤块称重。
表30银桦酸对人宫颈癌HeLa裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用
结果：见表30，紫杉醇10mg/kg组对人宫颈癌HeLa裸鼠移植瘤的抑瘤率为76.6％；银桦酸高、中、低剂量组对人宫颈癌HeLa裸鼠移植瘤的抑瘤率分别为52.0％，41.9％，29.0％。但紫杉醇毒性较大，动物体重下降，实验过程中动物有死亡。而银桦酸对裸鼠体重没有显著性影响。
实施例31
银桦酸对冰醋酸所致小白鼠腹腔毛细管通透性增加的影响
取昆明小白鼠50只，随机将其分为5组，每组10只，分别为模型组，地塞米松阳性组(10mg/kg)，银桦酸高、中、低给药组(剂量分别为50、25、12.5mg/kg)为实验组。每日腹腔注射给药1次，模型组给予同体积生理盐水，连续5d，正常饲喂。于末次给药后第1小时，尾静脉注射5g/L伊文思蓝生理盐水溶液10mL/kg，随即腹腔注射10mL/kg HAc溶液(6mL/L)致炎。20min后颈椎脱臼处死小鼠，腹腔注射5mL生理盐水，轻揉腹部2min，剪开腹腔，收集腹腔洗液，4000r/min离心10min，取上清液1mL，加入3mL生理盐水得到4mL的稀释液，用紫外分光光度计于590nm波长测定稀释液的吸收度OD值，以OD590nm值表示色素渗出量，考察小白鼠腹腔毛细血管通透性。
表31银桦酸对冰醋酸所致小白鼠腹腔毛细管通透性增加的影响
注：与空白对照组比较*P<0.05为显著性差异，**P<0.01为极显著性差异。
结果表明：银桦酸能显著抑制醋酸所致小鼠腹腔毛细血管透性的增加，且具有剂量依赖效应，剂量越大，作用越强。
实施例32
银桦酸对棉球所致小白鼠肉芽肿的影响
本实验通过给小鼠皮下植入棉球致使小鼠出现肉芽肿，通过考察对小鼠肉芽肿的影响，来评价银桦酸抗慢性炎症的活性。
用分析天平精确称取脱脂棉50份，每份5mg，团成形状和大小基本相同的球形。1.5kpa高压灭菌30min，50℃烘干，备用。
取昆明小白鼠50只，将其随机分为5组，每组10只。分别为模型组，地塞米松阳性组(10mg/kg)，银桦酸高、中、低剂量组(50、25、12.5mg/kg)为实验组。于给药前将小白鼠用乙醚麻醉，于腹部切口，从切口向两侧腹股沟下各植入一枚5mg的灭菌棉球，缝合切口，切口处用750mL/L酒精消毒。术后当天起按组别每日腹腔注射给药1次，连续7d。在末次给药后第24小时颈椎脱臼处死小白鼠，切开腹股沟皮肤，将棉球同周围肉芽组织一起取出，剔除周围组织，置60℃烘箱中连续干燥48h后，精密称取重量，并计算肉芽肿净重量：肉芽肿净重＝棉球肉芽肿的重量-5mg棉球重量)。
表32银桦酸对棉球所致小白鼠肉芽肿的影响
注：与空白对照组比较*P<0.05为显著性差异，**P<0.01为极显著性差异。
结果表明，银桦酸高、中、低3个剂量组均对棉球致小鼠肉芽肿有明显的抑制作用，且具有剂量依赖效应，剂量越大，作用越强。
通过以上实施例本领域技术人员可以发现银桦酸可以在制备抗肿瘤和抗炎药物中应用。尤其是起源于人的胃部、肝部、肺部、鼻部、皮肤、头颈部、甲状腺、胰腺、食管、乳腺、肾脏、胆囊、结肠/直肠、卵巢、子宫、子宫颈、前列腺、膀胱、睾丸的原发/继发的癌或肉瘤。而且使用时银桦酸和对苯二酚共同使用效果更好。因为海南裂叶山龙眼活性组分在制备抗肿瘤和抗炎药物中的应用就是利用银桦酸和对苯二酚共同使用，所以不再一一举例。
Claims (9)
1.银桦酸在制备抗肿瘤和抗炎药物中的应用。
2.银桦酸和对苯二酚在制备抗肿瘤和抗炎药物中的应用。
3.海南裂叶山龙眼活性组分在制备抗肿瘤和抗炎药物中的应用。
4.根据权利要求1或2或3中所述的在制备抗肿瘤和抗炎药物中的应用，其特征在于：所述的肿瘤为起源于人的胃部、肝部、肺部、鼻部、皮肤、头颈部、甲状腺、胰腺、食管、乳腺、肾脏、胆囊、结肠/直肠、卵巢、子宫、子宫颈、前列腺、膀胱、睾丸的原发/继发的癌或肉瘤。
5.根据权利要求3所述的海南裂叶山龙眼活性组分在制备抗肿瘤和抗炎药物中的应用，其特征在于：所述的海南裂叶山龙眼活性组分为银桦酸和对苯二酚。
6.权利要求3所述的海南裂叶山龙眼活性组分的制备方法，其制备步骤如下：
(a)将海南裂叶山龙眼的叶子/茎皮/根皮/花/果实阴干，粉碎得到叶子/茎皮/根皮/花/果实的粗粉；
(b)采用水煎煮法对步骤(a)中得到的叶子/茎皮/根皮/花/果实的粗粉进行提取，水的加入量为叶子/茎皮/根皮/花/果实粗粉体积的5～10倍，加热煮沸提取3～4次，每次3～4小时，将提取液过滤后合并，减压浓缩，得到叶子/茎皮/根皮/花/果实的浸膏；
(c)将(b)中得到的叶子/茎皮/根皮/花/果实的浸膏用1:5～1:10倍体积的水进行分散，得到叶子/茎皮/根皮/花/果实的浸膏溶液；
(d)用乙酸乙酯对步骤(c)中得到的叶子/茎皮/根皮/花/果实的浸膏溶液进行萃取，乙酸乙酯与浸膏溶液的体积比为1:1～1:5，萃取3～5次，萃取液合并得到叶子/茎皮/根皮/花/果实的乙酸乙酯的萃取液；
(e)将步骤(d)中得到的叶子/茎皮/根皮/花/果实的乙酸乙酯的萃取液减压浓缩干燥得到活性组分，叶子制备的活性组分定为活性组分Ⅰ-1，茎皮制备的活性组分定为活性组分Ⅰ-2，根皮制备的活性组分定为活性组分Ⅰ-3，花制备的活性组分定为活性组分Ⅰ-4，果实制备的活性组分定为活性组分Ⅰ-5。
7.权利要求3所述的海南裂叶山龙眼活性组分的制备方法，其制备步骤如下：
(a)将海南裂叶山龙眼的叶子/茎皮/根皮/花/果实阴干，粉碎得到叶子/茎皮/根皮/花/果实的粗粉；
(b)采用水煎煮法对步骤(a)中得到的叶子/茎皮/根皮/花/果实的粗粉进行提取，水的加入量为叶子/茎皮/根皮/花/果实粗粉体积的5～10倍，加热煮沸提取3～4次，每次3～4小时，将提取液过滤后合并，减压浓缩，得叶子/茎皮/根皮/花/果实的浸膏；
(c)将(b)中得到的叶子/茎皮/根皮/花/果实的浸膏用5～20倍质量的水进行分散，得到叶子/茎皮/根皮/花/果实的浸膏溶液；
(d)用大孔吸附树脂色谱柱对步骤(c)中得到的叶子/茎皮/根皮/花/果实的浸膏溶液进行吸附，大孔吸附树脂与浸膏的质量比为1:5～1:20，树脂柱的径高比为1:8～1:15；
(e)用体积浓度为30％～50％乙醇对步骤(d)中得到的吸附了叶子/茎皮/根皮/花/果实浸膏溶液后的大孔吸附树脂柱进行梯度洗脱，乙醇浓度由低到高变换2～5个梯度，每个梯度的洗脱体积为5～10个柱体积，流速为5～15mL/min，收集不同梯度洗脱液，合并所有梯度的洗脱液，经减压浓缩干燥得到活性组分，叶子制备的活性组分定为活性组分Ⅱ-1，茎皮制备的活性组分定为活性组分Ⅱ-2，根皮制备的活性组分定为活性组分Ⅱ-3，花制备的活性组分定为活性组分Ⅱ-4，果实制备的活性组分定为活性组分Ⅱ-5。
8.根据权利要求7所述的海南裂叶山龙眼活性组分的制备方法，其特征在于：大孔吸附树脂为D101型、AB-8型、HPD450型、DM-130型、YWD O1F型、YWD O1G3型、ADS-17型、D312型、DM301型、HPD750型、LSA-40型、LSA-21型、LSA-10型中的任意一种。
9.权利要求3所述的海南裂叶山龙眼活性组分的制备方法，其制备步骤如下：
(a)将海南裂叶山龙眼的叶子/茎皮/根皮/花/果实阴干，粉碎得到叶子/茎皮/根皮/花/果实的粗粉；
(b)采用醇提法对步骤(a)中得到的叶子/茎皮/根皮/花/果实的粗粉进行提取，乙醇的体积浓度为30％～70％，乙醇的加入量为叶子/茎皮/根皮/花/果实粗粉体积的5～10倍，回流提取2～4次，每次3～4小时，将提取液过滤后合并，减压浓缩，得叶子/茎皮/根皮/花/果实的浸膏；
(c)将(b)中得到的叶子/茎皮/根皮/花/果实的浸膏用1:5～1:10倍体积的水进行分散，得到叶子/茎皮/根皮/花/果实的浸膏溶液；
(d)用乙酸乙酯对步骤(c)中得到的叶子/茎皮/根皮/花/果实的浸膏溶液进行萃取，乙酸乙酯与浸膏溶液的体积比为1:1～1:5，萃取3～5次，萃取液合并得到叶子/茎皮/根皮/花/果实的乙酸乙酯的萃取液；
(e)将步骤(d)中得到的叶子/茎皮/根皮/花/果实的乙酸乙酯的萃取液减压浓缩干燥得到叶子/茎皮/根皮/花/果实的活性组分。
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| CN106511409A (zh) * | 2016-12-20 | 2017-03-22 | 海南医学院 | 一种复方番木瓜籽醇提物及其在增强免疫力中的应用 |
| CN106692674A (zh) * | 2017-02-22 | 2017-05-24 | 红河州丰茂农业科技发展有限公司 | 治疗食道癌和喉癌的中药组合物 |
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