CN106674086A - 一种哌啶酮类生物碱化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种哌啶酮类生物碱化合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种哌啶酮类生物碱化合物及其制备方法和应用，先取兴安独活的干燥根进行回流提取和萃取，得到萃取层；将萃取层上样于硅胶柱，以氯仿‑甲醇系统作为洗脱液，进行梯度洗脱，对流出液进行检测，将洗脱液体积比为9:1的流份合并，除去溶剂，得到第一次过柱部分；将第一次过柱部分上样于反相硅胶层析柱，以甲醇‑水系统作为洗脱液，进行梯度洗脱，将洗脱液体积比为70:30的流份合并，除去溶剂，得到第二次过柱部分；将第二次过柱部分上样于高效液相色谱分离柱，用流动相进行等度洗脱，得到哌啶酮类生物碱化合物。本发明中的哌啶酮类生物碱化合物具有抗炎和抗肿瘤作用。

Description

一种哌啶酮类生物碱化合物及其制备方法和应用
【技术领域】
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种哌啶酮类生物碱化合物及其制备方法和应用。
【背景技术】
炎症是机体对于刺激的一种防御性反应，是具有血管系统的活体组织对损伤因子所发生的防御反应。炎症与动脉硬化、心脏病、中风、癌症、糖尿病等多种疾病密切相关，是引起多种疾病的重要因素。因此，抗炎是治疗许多疾病的基础。
目前我国每年新增癌症患者400多万，死亡200多万，虽然发病率与世界平均水平接近，但死亡率却很高。随着现代生活方式的改变和环境污染以及食品安全问题，使罹患癌症人数持续升高。治疗癌症的药物主要分为靶向药和化疗药。虽然靶向药物有效性高，但价格昂贵，同时靶向药物并不是适合所有人，只有特定基因发生突变的患者才能使用；化疗药物毒副作用大，且容易出现继发性耐药现象，使治疗效果随着用药时间的延长而大打折扣。因此，持续不断地寻找高效低毒、不易出现耐药的抗癌药物一直是当今医药学界的难题。
天然产物仍然是新药发现的重要源泉，自然界中存在的生物碱类化合物是一类具有很大成药性的天然产物，如喜树碱，小檗碱，利血平等都已成为临床上频繁使用的治疗药物。具有新结构的新生物碱类化合物的发现对新药研发具有特别的意义，它可能被直接或间接地(以此为先导化合物进行结构修饰和改造)开发成某种药物。
民族药是我国少数民族人民长期与疾病斗争过程中积累的瑰宝，是人类文明的重要组成部分，从民族药中寻找活性好的化合物是新药研发的重要途径之一。兴安独活(Heracleum dissectum)，也称坎库拉，是东北鄂伦春族的民族药，也是当地人们喜爱的一种山野菜，但对其化学成分和药理活性的研究报道极少。
【发明内容】
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种哌啶酮类生物碱化合物及其制备方法和应用，能够从兴安独活中提取分离哌啶酮类生物碱化合物，以用于抗炎和/或抗肿瘤。
本发明是通过以下技术方案来实现：
本发明哌啶酮类生物碱化合物分子式为C15H19NO4。
进一步地，其结构式为：
本发明制备方法，包括以下步骤：
1)取兴安独活的干燥根进行回流提取若干次，将提取液减压浓缩，得到总浸膏或浓缩液；
2)将总浸膏混悬于水中，得到浸膏液，浸膏液或浓缩液经乙酸乙酯萃取若干次后分离出有机层，剩余水层通过正丁醇萃取若干次后合并萃取液，减压除去正丁醇得到正丁醇萃取层；
3)将正丁醇萃取层上样于硅胶柱，以氯仿-甲醇系统作为洗脱液，按体积比(100:0)～(0:100)进行梯度洗脱，对流出液进行检测，将洗脱液体积比为9:1的流份合并，除去溶剂，得到第一次过柱部分；
4)将第一次过柱部分上样于反相硅胶层析柱，以甲醇-水系统作为洗脱液，按体积比(0:100)～(100:0)进行梯度洗脱，将洗脱液体积比为70:30的流份合并，除去溶剂，得到第二次过柱部分；
5)将第二次过柱部分上样于高效液相色谱分离柱，用流动相进行等度洗脱，得到哌啶酮类生物碱化合物。
进一步地，步骤1)的回流提取中采用甲醇、水或体积分数10～95％的乙醇作为提取剂，兴安独活的干燥根与提取剂的质量体积比为1kg：(1～8)L；当提取剂为甲醇或体积分数10～95％的乙醇时，将得到的提取液中溶剂回收得到总浸膏；当提取剂为水时，将提取液的体积浓缩至六分之一到十分之一，得到浓缩液。
进一步地，步骤1)中提取次数为1～6次，每次1～4小时。
进一步地，步骤2)中总浸膏和水的体积比为1:1～1:5。
进一步地，步骤2)中浸膏液或浓缩液直接经过乙酸乙酯萃取；或者先依次经石油醚和氯仿萃取后，再经过乙酸乙酯萃取；每次萃取均是等体积萃取；每种溶剂分别萃取1～6次。
进一步地，步骤3)中梯度洗脱后每300～800mL收集一个流份；步骤4)中梯度洗脱后每200～500mL收集一个流份；步骤3)和步骤4)中对流出液均是进行TLC检测；步骤5)中等度洗脱的流速为3～6mL/min。
进一步地，步骤5)中流动相是甲醇-0.5％醋酸水系统或乙腈-0.5％醋酸水系统，甲醇-0.5％醋酸水系统中甲醇、水和醋酸的体积比为14：86：0.5；乙腈-0.5％醋酸水系统中乙腈、水和醋酸的体积比为11：89：0.5。
如上所述的哌啶酮生物碱类化合物在制备抗炎或抗肿瘤药物和/或保健品方面的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明中的哌啶酮类生物碱化合物具有抗炎和抗肿瘤作用，本发明通过对小鼠RAW264.7细胞实验，验证了哌啶酮类新生物碱能非常有效地抑制细胞中一氧化氮的产生，且呈剂量依赖关系。本发明采用MTT法进行细胞毒实验，结果显示哌啶酮类新生物碱化合物在药物浓度为100μM时对小鼠RAW264.7细胞没有毒性，这证明该类化合物是安全的。本发明通过对肝癌组织HepG2细胞克隆形成的影响实验，验证了该哌啶酮类新生物碱化合物具有抑制肝癌细胞生长的作用。
本发明公开了一种哌啶酮类新生物碱的制备及其在抗炎和抗肿瘤方面的应用，用该哌啶酮类新生物碱类化合物制备的药物具有药理活性强、安全性高、毒副作用小的特点。尽管该新生物碱的活性较好，但其在植物中的含量较低，并且与其他极性相似的化合物混杂在一起，难以分离纯化，用本发明中的一系列色谱方法能够简单顺利地将该化合物分离纯化出来，尤其是最后一步采用亲水色谱柱，是分离纯化该化合物的最重要环节，因为采用普通ODS色谱柱无法得到分离，同时采用本发明中的方法得到的化合物纯度较高(＞98％)。本发明为制备抗炎和抗肿瘤药物开拓了新的应用领域。
【附图说明】
图1为本发明化合物1的1H-NMR图谱；
图2为本发明化合物1的13C-NMR图谱；
图3为本发明化合物1的DEPT图谱；
图4为本发明化合物1的1H-1H COSY图谱；
图5为本发明化合物1的HMQC图谱；
图6为本发明化合物1的HMBC图谱；
图7为本发明化合物1的HR-ESIMS图谱；
图8为本发明中化合物1对RAW264.7细胞毒作用；
图9为本发明中化合物1对肝癌细胞克隆形成的影响。
【具体实施方式】
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
本发明新的哌啶酮类生物碱化合物的结构式如下：
本发明的制备方法，包括以下步骤：
1)取一定质量(kg)的兴安独活干燥根，用体积为兴安独活干燥根质量1～8倍量的甲醇、体积分数为10～95％的乙醇或水(L)在各自沸点附近加热回流提取1～6次，每次1～4小时，当提取剂为甲醇或体积分数10～95％的乙醇时，合并提取液减压回收除去溶剂，得到总浸膏，当提取剂为水时，合并提取液并将其体积浓缩至六分之一到十分之一，得到浓缩液；
2)将总浸膏混悬于水中，总浸膏和水的体积比为1:1～1:5，得到浸膏液，浸膏液或浓缩液分别依次用等体积的有机溶剂萃取，其中，第一次萃取时用石油醚对浸膏液或浓缩液进行等体积萃取，之后每次萃取均是分离出上一次萃取后的有机层，将剩余的水层用有机溶剂等体积进行下一次萃取；每种溶剂各萃取1～6次，合并萃取液，常压或减压蒸馏除去有机溶剂，分别得到各萃取层和水层。有机溶剂包括石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇等，且萃取次序为先用极性小的溶剂，再用极性大的有机溶剂，石油醚和氯仿可以省去。
3)取正丁醇萃取层，通过采用柱层析纯化等分离方法，得到本发明的哌啶酮类生物碱类化合物。
柱层析包括以下三个阶段：
第一阶段：将正丁醇萃取层上样于硅胶柱，以氯仿-甲醇系统作为洗脱液，按体积比为(100:0)～(0:100)进行梯度洗脱，每300～800mL收集一个流份，对流出液进行TLC检测，合并相同流份，常压或减压蒸干溶剂，共得到30个流份，分别命名为FrB1-FrB30，取其中的FrB23流份，即洗脱液体积比为9:1的流份，作为第一次过柱部分；
第二阶段：将第一次过柱部分，上样于反相硅胶层析柱，以甲醇-水系统作为洗脱液，按体积比(1:100)～(100:1)进行梯度洗脱，每200～500mL收集一个流份，对流出液进行TLC检测，合并相同流份，减压除去溶剂，得到2个亚流份，分别命名为FrB23.1-FrB23.2，将FrB23.2流份，即洗脱液体积比为7:3的流份，作为第二次过柱部分；
第三阶段：将第二次过柱部分FrB23.2流份，上样于高效液相色谱分离柱，分离得到哌啶酮类生物碱化合物。
所述的高效液相色谱分离柱为江苏汉邦的Megres C18柱，高效液相色谱分离是用示差折光检测器，以甲醇-0.5％醋酸水系统或乙腈-0.5％醋酸水系统作为流动相，按3～6mL/min进行等度洗脱。其中，甲醇-0.5％醋酸水系统中甲醇、水和醋酸的体积比为14：86：0.5；乙腈-0.5％醋酸水系统中乙腈、水和醋酸的体积比为11：89：0.5。
本发明首次从兴安独活中发现了一个未见文献报道过的新生物碱类化合物，并且具有较好的抗炎和抗肿瘤活性，有望直接或间接开发成具有抗炎或抗肿瘤的药物；本发明哌啶酮类生物碱化合物可用于制备抗炎药物和/或保健品，可用于制备抗肿瘤药物和/或保健品。
一种具有抗炎和抗肿瘤作用的药物，将哌啶酮类生物碱化合物与药用辅料制成药用剂型；所述的药用辅料为缓释剂、聚乙烯吡咯烷酮或微晶纤维素；所述的剂型为片剂、胶囊剂或丸剂。所述的缓释剂为羟丙甲基纤维素和/或乳糖。
实施例1
一、哌啶酮类新生物碱的提取和萃取、分离
1)取坎库拉干燥根6kg，用体积量为坎库拉干燥根质量5倍的甲醇加热回流提取3次，每次2小时，合并甲醇提取液减压回收溶剂，得总浸膏；
2)将总浸膏混悬于3倍量水中，用石油醚等体积萃取4次，然后依次经氯仿，乙酸乙酯和正丁醇等体积萃取，每种有机溶剂萃取4次，将有机层常压或减压蒸馏除去溶剂后分别得到石油醚层、氯仿层、乙酸乙酯层、正丁醇层和余下的水层。
3)取正丁醇萃取层100g，上样于硅胶柱色谱，以氯仿-甲醇按体积比为100:0～0:100进行梯度洗脱，每500mL收集一次，常压蒸馏回收溶剂，TLC检识合并相同流份，共得到30个流份(FrB1-FrB30)。
4)FrB23流份，即洗脱液体积比为9:1的流份，经反相硅胶柱色谱，用甲醇-水按体积比为100:0～0:100进行梯度洗脱，每200mL收集一次，减压除去溶剂，TLC检识合并相同流份，得到2个亚流份(FrB23.1-FrB23.2)。
5)然后FrB23.2流份，即洗脱液体积比为7:3的流份，用半制备高效液相色谱仪，使用Megres C18色谱柱，以甲醇和0.5％的醋酸水作为流动相等度洗脱(14:86)，流速为3mL/min，得到哌啶酮类新生物碱(保留时间为25min)。
本发明通过理化常数和现代波谱学技术手段(HR-ESI-MS，1D-NMR，2D-NMR)鉴定化合物的结构，化合物1为(S,E)-3-(4-(3-hydroxyprop-1-en-1-yl)-2-methoxyphenoxy)piperidin-2-one，我们将其命名为dissectumide A。化合物1的结构鉴定过程如下所述。
二、哌啶酮类新生物碱的结构鉴定
参见图1至图7，在图1的1H NMR谱中，质子δH 6.69(1H,d,J＝7.9Hz),6.84(1H,d,J＝7.9Hz),6.98(1H,s)是三取代苯环的特征信号，分子中还存在一个甲氧基信号δH 3.80(3H,3)和它的碳信号δC 56.4。在图1的1H谱和图2的13C NMR谱中，质子δH 6.70(1H,d,J＝15.2Hz)和δH 6.06(1H,m)和他们相应的碳信号δC 140.8andδC 115.9表明有一个E构型的双键连接在苯环上，这在图6的HMBC谱中也得到了证实：δH 6.84(1H,d,J＝7.9Hz,H-9)和6.98(1H,s,H-11)的两个质子与δC 140.8(C-13)的碳信号相关，δH 6.70(1H,d,J＝15.2Hz,H-13)的质子与δC 128.9(C-10)的碳信号相关。
图3的DEPT谱和图5的HMQC谱显示有4个亚甲基，在图4的1H-1H COSY谱中，连氧亚甲基δH 3.85(2H,m)与双键质子(δH 6.06)相连，三个依次相连的亚甲基δH 2.37(1H,m)and2.08(1H,m),δH 2.02(1H,m)and 1.91(1H,m),δH 3.62(1H,m)and 3.11(1H,m)连接在含氧次甲基上(δH 3.83,δC 69.4)，而亚甲基δH 3.62(1H,m)and 3.11(1H,m)和它相应的碳δC 55.1应该连接在氮原子上。除了苯环、一个双键和一个羰基共6个不饱和度外，还有一个不饱和度，它应该是一个环，这个环应该是3-O-哌啶-2-酮的结构。其它位置的连接通过综合解析HMBC谱得到确定，因此化合物1的结构鉴定为3-(4-(3-hydroxyprop-1-en-1-yl)-2-methoxyphenoxy)piperidin-2-one，即3-(2-甲氧-4-羟丙烯基)苯氧基哌啶-2-酮，这是一个未见文献报道的新化合物，我们将其命名为dissectumide A。
化合物1为无色油状物，其图7的HR-ESIMS显示准分子离子峰为[M+Na]+at m/z300.1211(calcd 300.1206)，因此确定分子式为C15H19NO4。分子式显示有7个不饱和度。红外光谱显示有芳香环吸收峰(1602,1512,1457,1417cm-1)和氨基吸收峰(3410cm-1)，以及酰胺羰基吸收峰(1685cm-1)。其结构式如下所示，其1H NMR和13C NMR的数据见表1。
表1本发明中化合物1的1H NMR和13C NMR数据
No. δH δC
2 — 173.3
3 3.83(1H,m) 69.4
4 2.37(1H,m),2.08(1H,m) 30.3
5 2.02(1H,m),1.91(1H,m) 24.4
6 3.62(1H,m),3.11(1H,m) 55.1
7 — 148.8
8 6.69(1H,d,J＝7.9Hz) 116.3
9 6.84(1H,d,J＝7.9Hz) 122.0
10 — 128.9
11 6.98(1H,s) 110.9
12 — 149.2
13 6.70(1H,d,J＝15.2Hz) 140.8
14 6.06(1H,m) 115.9
15 3.85(1H,m) 58.1
OCH3 3.80(1H,s) 56.4
药物制备实施例1
片剂的制备
称取1克化合物1，90克羟丙甲基纤维素，100克聚乙烯吡咯烷酮，85克乳糖，90克微粉硅胶，将化合物1与处方量的缓释剂混合均匀，加入粘合剂聚乙烯比咯烷酮制粒，在40-70℃下烘干颗粒，在干颗粒中加入处方量的润滑剂微粉硅胶，混匀，压片即可。
药物制备实施例2
胶囊剂的制备
30克化合物1，加入糊精适量，混匀，85％乙醇制成颗粒，干燥，整粒，加微粉硅胶5g，混匀，装入胶囊，制成1000粒，即得本发明胶囊剂，每粒0.035g。
三、本发明的哌啶酮类生物碱的药效实验
1、体外抗炎实验
实验方法：将RAW264.7细胞接种于96孔板中，培养24h后加入LPS(脂多糖)。接着不同组分别加入不同浓度的样品(本发明化合物1和2、阳性药物吲哚美辛)，空白组加入等体积vehicle。50μL细胞培养液混合等体积Griess试剂I加入上述96孔板中，接着加入Griess试剂II。酶标仪测定各组样品在546nm波长下的OD值，利用下列公式计算NO产生抑制率，并用SPSS软件计算被测试样品的半数抑制浓度(IC50值，μM)。
NO抑制率(％)＝[1–(样品组/空白组)]×100％。
结果如表2所示：
表2本发明化合物1对LPS刺激的细胞RAW264.7产生NO的抑制作用
实验结果：表2的数据表明，本发明中的化合物1具有很好的体外抗炎作用，对脂多糖LPS刺激小鼠RAW264.7细胞产生NO具有较好的抑制作用，其半数抑制浓度IC50为18.1±0.6μM，均优于阳性对照药物吲哚美辛的31.1±1.2μM。说明本发明中的哌啶酮类生物碱化合物1具有较好的抗炎作用。
2、细胞毒实验
化合物的细胞毒活性采用MTT法在RAW264.7细胞系测定，具体做法如下：细胞悬浮于培养基中，接种于96孔板中，接种密度为5×104细胞/孔。溶于DMSO的不同浓度的样品加入孔中，在37℃含有5％二氧化碳的培养箱中培养24或48小时后，吸掉培养基，每孔加入10μL MTT(4mg/mL)，培养4小时，培养完毕后每孔加入DMSO溶解形成的甲臜，与570nm处测定吸光度。结果见图8所示。
从化合物1的细胞毒活性结果来看，该化合物在100μM时对RAW264.7没有细胞毒性，这说明该化合物是安全的，且对RAW264.7细胞产生NO的抑制作用不是通过灭活细胞进行的。
3、对肝癌细胞克隆形成的影响
细胞克隆是指单个细胞通过有丝分裂形成的细胞群体，其形成能力与肿瘤细胞的群体依赖性和增殖能力密切相关。克隆形成能力的大小可反映肿瘤细胞的成瘤能力和恶性程度，也是评价单细胞存活和增殖的良好指标。
实验方法：分别把HepG2细胞用胰酶消化并吹打成单个细胞，悬浮于完全培养基中，将细胞悬液进行梯度稀释，接种于24孔板中，接种密度分别为150μL/孔，各设3个平行孔，每孔加化合物1，终浓度为50μM，将细胞于CO2培养箱中培养4天后弃培养液，用PBS洗2次，4％多聚甲醛固定后用1％结晶紫染色，流水缓慢洗去染色液，空气干燥，扫描细胞培养板。实验结果：结果见图9。
结果分析：
参见图9，可以看出，利用哌啶酮类生物碱化合物dissectumide A作用4天后的肝癌细胞克隆形成率为零，而对照组克隆形成率为100％，故dissectumide A可有效抑制HepG2细胞克隆形成的能力，进一步证实该新生物碱化合物对肝癌细胞增殖的抑制作用。
实施例2
1)取坎库拉干燥根6kg，用体积量为坎库拉干燥根质量4倍的70％乙醇加热回流提取3次，每次2小时，合并甲醇提取液减压回收溶剂，得总浸膏；
2)将总浸膏混悬于4倍量水中，用乙酸乙酯等体积萃取3次，然后经正丁醇等体积萃取4次，将有机层常压或减压蒸馏除去溶剂后分别得到乙酸乙酯层、正丁醇层和余下的水层。
3)取正丁醇萃取层100g，上样于硅胶柱色谱，以氯仿-甲醇按体积比为100:0～0:100进行梯度洗脱，每500mL收集一次，常压蒸馏回收溶剂，TLC检识合并相同流份，共得到30个流份(FrB1-FrB30)。
4)取FrB23流份，即洗脱液体积比为9:1的流份，经反相硅胶柱色谱，用甲醇-水按体积比为100:0～0:100进行梯度洗脱，每200mL收集一次，减压除去溶剂，TLC检识合并相同流份，得到2个亚流份(FrB23.1-FrB23.2)。
5)然后取FrB23.2流份，即洗脱液体积比为7:3的流份，用半制备高效液相色谱仪，使用Megres C18色谱柱，以甲醇和0.5％的醋酸水作为流动相等度洗脱(14:86)，流速为3mL/min，得到哌啶酮类新生物碱(保留时间为25min)。
实施例3
1)取坎库拉干燥根6kg，用体积量为坎库拉干燥根质量6倍的水加热回流提取1次，每次4小时，合并甲醇提取液减压回收溶剂，得总浸膏；
2)将总浸膏混悬于2倍量水中，用乙酸乙酯等体积萃取3次，然后经正丁醇等体积萃取6次，将有机层常压或减压蒸馏除去溶剂后分别得到乙酸乙酯层、正丁醇层和余下的水层。
3)取正丁醇萃取层100g，上样于硅胶柱色谱，以氯仿-甲醇按体积比为100:0～0:100进行梯度洗脱，每800mL收集一次，常压蒸馏回收溶剂，TLC检识合并相同流份，共得到30个流份(FrB1-FrB30)。
4)取FrB23流份，即洗脱液体积比为9:1的流份，经反相硅胶柱色谱，用甲醇-水按体积比为100:0～0:100进行梯度洗脱，每500mL收集一次，减压除去溶剂，TLC检识合并相同流份，得到2个亚流份(FrB23.1-FrB23.2)。
5)然后取FrB23.2流份，即洗脱液体积比为7:3的流份，用半制备高效液相色谱仪，使用Megres C18色谱柱，以甲醇和0.5％的醋酸水作为流动相等度洗脱(14:86)，流速为3mL/min，得到哌啶酮类新生物碱(保留时间为25min)。
实施例4
1)取坎库拉干燥根6kg，用体积量为坎库拉干燥根质量8倍的10％乙醇加热回流提取6次，每次1小时，合并甲醇提取液减压回收溶剂，得总浸膏；
2)将总浸膏混悬于5倍量水中，用石油醚等体积萃取2次，然后依次经氯仿，乙酸乙酯和正丁醇等体积萃取2次，将有机层常压或减压蒸馏除去溶剂后分别得到石油醚层、氯仿层、乙酸乙酯层、正丁醇层和余下的水层。
3)取正丁醇萃取层100g，上样于硅胶柱色谱，以氯仿-甲醇按体积比为100:0～0:100进行梯度洗脱，每300mL收集一次，常压蒸馏回收溶剂，TLC检识合并相同流份，共得到30个流份(FrB1-FrB30)。
4)取FrB23流份，即洗脱液体积比为9:1的流份，经反相硅胶柱色谱，用甲醇-水按体积比为100:0～0:100进行梯度洗脱，每400mL收集一次，减压除去溶剂，TLC检识合并相同流份，得到2个亚流份(FrB23.1-FrB23.2)。
5)然后取FrB23.2流份，即洗脱液体积比为7:3的流份，用半制备高效液相色谱仪，使用制备型Megres C18色谱柱，以乙腈-0.5％醋酸水系统作为流动相等度洗脱(11:89)，流速为6mL/min，得到哌啶酮类新生物碱(保留时间为23min)。
实施例5
1)取坎库拉干燥根6kg，用体积量为坎库拉干燥根质量5倍的95％乙醇加热回流提取4次，每次3小时，合并甲醇提取液减压回收溶剂，得总浸膏；
2)将总浸膏混悬于1倍量水中，用石油醚等体积萃取1次，然后依次经氯仿，乙酸乙酯和正丁醇等体积萃取2次，将有机层常压或减压蒸馏除去溶剂后分别得到石油醚层、氯仿层、乙酸乙酯层、正丁醇层和余下的水层。
3)取正丁醇萃取层100g，上样于硅胶柱色谱，以氯仿-甲醇按体积比为100:0～0:100进行梯度洗脱，每600mL收集一次，常压蒸馏回收溶剂，TLC检识合并相同流份，共得到30个流份(FrB1-FrB30)。
4)取FrB23流份，即洗脱液体积比为9:1的流份，经反相硅胶柱色谱，用甲醇-水按体积比为100:0～0:100进行梯度洗脱，每300mL收集一次，减压除去溶剂，TLC检识合并相同流份，得到2个亚流份(FrB23.1-FrB23.2)。
5)然后取FrB23.2流份，即洗脱液体积比为7:3的流份，用半制备高效液相色谱仪，使用制备型Megres C18色谱柱，以乙腈-0.5％醋酸水系统作为流动相等度洗脱(11:89)，流速为6mL/min，得到哌啶酮类新生物碱(保留时间为23min)。
对比例1
将步骤5)中的流动相换成其它流动相或不同比例的相同流动相(或者色谱柱替换成普通反相色谱柱)，其它步骤和条件与实施例1相同。发现无法分离出哌啶酮类生物碱化合物。
本发明公开了一种新的哌啶酮类生物碱化合物及其在抗炎和抗肿瘤药物中的应用。所述的新哌啶酮类生物碱化合物具有显著地抑制细胞中NO的产生，并能明显地抑制肿瘤细胞的生长，因此可应用于抗炎和抗肿瘤药物的制备。所述的新的哌啶酮类生物碱化合物可制成药学上可接受的任何一种制剂。本发明发现了一种新的哌啶酮类生物碱化合物，该化合物具有药理作用强、安全性高的特点，为广大炎症和肿瘤患者提供了一种新的有效的、安全的药物选择。

Claims (10)

1.一种哌啶酮类生物碱化合物，其特征在于：其分子式为C15H19NO4。
2.根据权利要求1所述的一种哌啶酮类生物碱化合物，其特征在于：其结构式为：
3.一种哌啶酮类生物碱化合物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)取兴安独活的干燥根进行回流提取若干次，将提取液减压浓缩，得到总浸膏或浓缩液；
2)将总浸膏混悬于水中，得到浸膏液，浸膏液或浓缩液经乙酸乙酯萃取若干次后分离出有机层，剩余水层通过正丁醇萃取若干次后合并萃取液，减压除去正丁醇得到正丁醇萃取层；
3)将正丁醇萃取层上样于硅胶柱，以氯仿-甲醇系统作为洗脱液，按体积比(100:0)～(0:100)进行梯度洗脱，对流出液进行检测，将洗脱液体积比为9:1的流份合并，除去溶剂，得到第一次过柱部分；
4)将第一次过柱部分上样于反相硅胶层析柱，以甲醇-水系统作为洗脱液，按体积比(0:100)～(100:0)进行梯度洗脱，将洗脱液体积比为70:30的流份合并，除去溶剂，得到第二次过柱部分；
5)将第二次过柱部分上样于高效液相色谱分离柱，用流动相进行等度洗脱，得到哌啶酮类生物碱化合物。
4.根据权利要求3所述的一种哌啶酮类生物碱化合物的制备方法，其特征在于：步骤1)的回流提取中采用甲醇、水或体积分数10～95％的乙醇作为提取剂，兴安独活的干燥根与提取剂的质量体积比为1kg：(1～8)L；当提取剂为甲醇或体积分数10～95％的乙醇时，将得到的提取液中溶剂回收得到总浸膏；当提取剂为水时，将提取液的体积浓缩至六分之一到十分之一，得到浓缩液。
5.根据权利要求3所述的一种哌啶酮类生物碱化合物的制备方法，其特征在于：步骤1)中提取次数为1～6次，每次1～4小时。
6.根据权利要求3所述的一种哌啶酮类生物碱化合物的制备方法，其特征在于：步骤2)中总浸膏和水的体积比为1:1～1:5。
7.根据权利要求3所述的一种哌啶酮类生物碱化合物的制备方法，其特征在于：步骤2)中浸膏液或浓缩液直接经过乙酸乙酯萃取；或者先依次经石油醚和氯仿萃取后，再经过乙酸乙酯萃取；每次萃取均是等体积萃取；每种溶剂分别萃取1～6次。
8.根据权利要求2所述的一种哌啶酮类生物碱化合物的制备方法，其特征在于：步骤3)中梯度洗脱后每300～800mL收集一个流份；步骤4)中梯度洗脱后每200～500mL收集一个流份；步骤3)和步骤4)中对流出液均是进行TLC检测；步骤5)中等度洗脱的流速为3～6mL/min。
9.根据权利要求3所述的一种哌啶酮类生物碱化合物的制备方法，其特征在于：步骤5)中流动相是甲醇-0.5％醋酸水系统或乙腈-0.5％醋酸水系统，甲醇-0.5％醋酸水系统中甲醇、水和醋酸的体积比为14：86：0.5；乙腈-0.5％醋酸水系统中乙腈、水和醋酸的体积比为11：89：0.5。
10.如权利要求1所述的哌啶酮生物碱类化合物在制备抗炎或抗肿瘤药物和/或保健品方面的应用。
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