CN105061524B

CN105061524B - 一种何首乌中顺式和反式二苯乙烯苷对照品的制备方法

Info

Publication number: CN105061524B
Application number: CN201510471926.3A
Authority: CN
Inventors: 王岱杰; 王晓; 耿岩玲; 段文娟; 赵恒强; 于金倩; 闫慧娇
Original assignee: Shandong Analysis and Test Center
Current assignee: Shandong Analysis and Test Center
Priority date: 2015-08-04
Filing date: 2015-08-04
Publication date: 2018-06-26
Anticipated expiration: 2035-08-04
Also published as: CN105061524A

Abstract

本发明公开了一种何首乌中顺式和反式二苯乙烯苷对照品的制备方法，包括以下步骤：(1)将何首乌药材干燥，粉碎，加入乙醇溶液提取，提取液过滤，滤液浓缩至无醇味，得浓缩液；(2)向浓缩液中加入石油醚萃取，萃取后的水相调节pH至9‑11，加入乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯相浓缩，得提取物；(3)提取物采用半制备高效液相色谱进行分离纯化，色谱条件为：色谱柱为Shim‑pack PREP‑ODS柱，流动相为乙腈‑水，体积比25:75，检测波长为320nm，收集色谱峰，检测其纯度，合并相同馏分，即分离得到顺式和反式二苯乙烯苷对照品。本发明制备得到高纯度反式‑二苯乙烯苷和顺式‑二苯乙烯苷单体，为研究其生理活性试验提供了纯品。

Description

一种何首乌中顺式和反式二苯乙烯苷对照品的制备方法

技术领域

本发明涉及一种何首乌中顺式和反式二苯乙烯苷对照品的制备方法。

背景技术

何首乌为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb.的干燥块根，解毒，消痈，截疟，润肠通便。用于疮痈，瘰疬，风疹瘙痒，久疟体虚，肠燥便秘。二苯乙烯苷(2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷)是何首乌中的主要活性物质之一，《中国药典》规定其含量生首乌不应低于1％，制首乌不应低于0.7％。二苯乙烯苷存在顺反异构体，光照条件下何首乌中的反式-二苯乙烯苷(如结构式B所示)部分转化成顺式结构(如结构式A所示)，但总含量不变。

在自然条件下，主要以反式-二苯乙烯苷形式存在，对其药理作用研究也较多，具有抗氧化、降血脂、抑制骨质疏松、抑制血管内皮细胞过度增生、神经保护、心肌保护、改善动脉硬化及加速血流等作用。药理研究表明，顺式二苯乙烯苷对正常小鼠和急性高血脂小鼠的降血脂作用与反式基本相同，但对慢性高血脂小鼠血浆中总胆固醇、甘油三酯的降低作用明显强于反式二苯乙烯苷。长期以来，对何首乌中二苯乙烯苷的研究以反式-二苯乙烯苷为主，忽视了何首乌中顺式-二苯乙烯苷的存在及其药理作用，因此，为进一步研究顺式-二苯乙烯苷药理活性，急需建立高纯度顺式-二苯乙烯苷的制备方法。近年来，国内外专家学者对何首乌中THSG的研究颇为关注，相关提取分离方法报道很多，但是精制方法多限制于大孔吸附树脂方法、聚酰胺吸附法等，操作繁琐，周期长。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一种何首乌中顺式和反式二苯乙烯苷对照品的制备方法，通过制备型高效液相色谱法进行分离纯化，得到高纯度反式-二苯乙烯苷和顺式-二苯乙烯苷单体，为研究反式和顺式-二苯乙烯苷的生理活性试验提供纯品，为二者的大量制备生产提供理论依据。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种何首乌中顺式和反式二苯乙烯苷对照品的制备方法，包括以下步骤：

(1)将何首乌药材干燥，粉碎，加入体积浓度为60-80％的乙醇溶液提取，乙醇溶液的加入体积与何首乌药材的质量比为1g:(6-10)ml，提取液过滤，滤液浓缩至无醇味，得浓缩液；

(2)向步骤(1)制得的浓缩液中加入石油醚萃取，萃取后的水相调节pH至9-11，加入乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯相浓缩，得提取物；

(3)将步骤(2)的提取物采用半制备高效液相色谱进行分离纯化，色谱条件为：色谱柱为Shim-pack PREP-ODS柱(20mm×250mm,15μm)，流动相为乙腈-水，体积比25:75，检测波长为320nm，收集色谱峰，检测其纯度，合并相同馏分，即分离得到顺式和反式二苯乙烯苷对照品。

需要说明的是，由于顺式和反式二苯乙烯苷结构相近，因此顺式和反式二苯乙烯苷的出峰时间比较接近，二者在进行液相分离制备时难度较大，选择合适的色谱柱和色谱分离条件尤为关键，本发明以多个溶剂体系作为流动相进行了考察，发现不同溶剂体系的出峰时间和分离度有明显的区别，即使相同的溶剂体系，体系间不同溶剂的配比关系也会影响制备产物的分离度。经多次试验发现，采用本发明的乙腈-水，体积比25:75，作为流动相，顺式和反式二苯乙烯苷的出峰时间合适，而且分离度较好，能够实现将顺式和反式二苯乙烯苷的有效分离。

优选的，步骤(1)中，提取方式为超声提取，提取次数为2-4次，每次0.5-1小时。

步骤(2)中，石油醚的加入量与浓缩液的体积比为1：(1-2)。加入石油醚的目的是除去何首乌的乙醇提取物中低极性的杂质，石油醚的加入量会影响除杂的效果，加入量过少，则除杂不完全，加入量过多，一是增加了生产成本，二是增加了后续浓缩处理的负担。

步骤(2)中，乙酸乙酯的加入量与浓缩液的体积比为1：(1-2)。加入乙酸乙酯的目的是对何首乌乙醇提取物的中高极性物质进行萃取。

步骤(2)中，萃取后的水相中加入氨水进行pH调节。加入氨水进行pH调节的目的是：与乙酸乙酯萃取物中的蒽醌类化合物进行结合，在碱性环境下，将酸性的蒽醌类化合物中和成盐，使之溶于水相，进而排除蒽醌类化合物的干扰。

二苯乙烯苷类物质为糖苷类化合物，具有较高的极性，易溶于醇类溶剂、丙酮、乙酸乙酯等，难溶于低极性有机溶剂。本发明经多次优选，采用乙醇溶液作为提取溶剂，利用石油醚去除何首乌中低极性杂质；同时何首乌中含有较多中高极性的蒽醌类化合物，当采用乙酸乙酯萃取时，易同时萃取出蒽醌类和二苯乙烯苷类化合物，结合蒽醌类化合物含有酚羟基，具有一定酸性，在碱性环境中成盐溶于水相，乙酸乙酯萃取得到杂质较少的二苯乙烯苷类组分，从而排除蒽醌类化合物的干扰，使制备的二苯乙烯苷类组分纯度相对较高。

步骤(3)中，在采用半制备高效液相色谱进行分离纯化前，将步骤(2)制备的提取物用甲醇溶解，再用微孔滤膜进行过滤，制得样品液。

步骤(3)中，纯度检测采用的方法是高效液相色谱法，色谱条件为：色谱柱为YMC-PackC18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相为乙腈-水，体积比25:75，流速为1.0mL/min，检测波长为320nm。

本发明的有益效果：

本发明考察了甲醇-水、甲醇-乙腈-水、乙腈-水等多个溶剂条件对何首乌中二苯乙烯苷粗提物进行高效液相色谱分析，结果表明乙腈-水体系出峰时间合适，反式和顺式-二苯乙烯苷具有较好的分离度；利用本发明的乙腈-水体系进行半制备液相色谱分离，较为合适，最终制备出顺式-二苯乙烯苷和反式-二苯乙烯苷，纯度分别为98.90％和99.66％，得到高纯度反式-二苯乙烯苷和顺式-二苯乙烯苷单体，为研究反式和顺式-二苯乙烯苷的生理活性试验提供纯品，为二者的大量制备生产提供理论依据。

附图说明

图1a为本发明的何首乌药材中二苯乙烯苷提取物的分析液相色谱图；

图1b为顺式二苯乙烯苷的液相色谱图；

图1c为反式二苯乙烯苷的液相色谱图；

图2为二苯乙烯苷提取物的半制备液相色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

实验中所使用的仪器及试剂为：试验用95％乙醇、石油醚、乙酸乙酯、甲醇、盐酸均为分析纯(天津广成化学试剂有限公司)，所用水为蒸馏水；液相色谱用乙腈为色谱纯(美国天地公司)，所用水为纯净水；何首乌药材购自济南建联中药店，经山东中医药大学李佳教授鉴定为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb.的正品药材。

实施例1：液相条件的考察

在高效液相色谱分析中，理论塔板数、分离度、拖尾因子是分离检测效果的重要指标，体现在色谱图中色谱峰之间的相对位置和峰形上。从色谱图的直观分析来看，峰窄而不同峰的峰间距大的分离是令人满意的。

本发明中以分离度为考察指标，对色谱分析中用到的极性和非极性溶剂的种类、溶剂的比例进行了试验筛选。具体过程如下：

将甲醇-水、甲醇-乙腈-水、乙腈-水按不同的体积比配制成一系列流动相溶液。

供试品和对照品溶液的配制：按常规方法用流动相溶解何首乌中二苯乙烯苷粗提物，配制成4mg/ml的供试品溶液；用流动相溶解分别配制成4μg/ml的顺式-二苯乙烯苷和反式-二苯乙烯苷对照品溶液。

色谱条件的选择：色谱柱为YMC-Pack C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；检测波长为320nm(检测波长是根据二苯乙烯苷紫外吸收特征波长在试验中反复微调的结果)；流动相的流速为1.0mL/min，进样量为10μl。

将配制好的一系列流动相溶液，在上述色谱条件下，对供试品进行分离检测，测定分离度，结果见表1。

表1不同流动相及分离度

流动相	体积比	分离度
			甲醇-水	25:75	2.2
甲醇-水	30:70	1.8
			甲醇-水	35:65	1.2
甲醇-乙腈-水	12.5:12.5:75	2.4
			甲醇-乙腈-水	15:15:70	1.9
甲醇-乙腈-水	17.5:17.5:65	1.4
			乙腈-水	25:75	2.6
乙腈-水	30:70	2.1
			乙腈-水	35:65	1.5

从上述试验结果可以看出：以乙腈-水作为流动相，体积比为25:75时，出峰时间合适，分离度好，实现了对二苯乙烯苷顺反异构体很好的分离。(乙腈-水作为流动相的分析液相色谱图见图1a、图1b和图1c)。

实施例2：何首乌中顺式和反式二苯乙烯苷对照品的制备

(1)何首乌中二苯乙烯苷粗提物的制备

何首乌药材500g，粉粹，70％乙醇超声提取2次，每次0.5h，过滤，合并滤液，减压浓缩至无醇味。浓缩液用等体积石油醚萃取3次，萃取后水相用氨水调pH至10，用等体积乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯相减压浓缩，得提取物3g，冰箱中冷藏保存备用。

(2)半制备高效液相色谱分离纯化

将步骤(1)的提取物用甲醇溶解，再用微孔滤膜(0.45μm)进行过滤，制得样品液，采用半制备高效液相色谱进行纯化，色谱条件为：色谱柱为Shim-pack PREP-ODS柱(20mm×250mm,15μm)，流动相为乙腈-水，体积比25:75，流速10mL/min，检测波长为320nm，进样量为200μL，收集色谱峰，采用高效液相色谱法检测其纯度，合并相同馏分，即分离得到顺式和反式二苯乙烯苷对照品，顺式-二苯乙烯苷的纯度为98.90％，反式-二苯乙烯苷的纯度为99.66％。

重复进样，连续制备，制备液相色谱图见图2，图2中I为顺式-二苯乙烯苷，II为反式-二苯乙烯苷。

对制备的产物进行结构分析，结果如下：

峰1(图2中I):ESI-MS m/z 405[M-H]^-.¹H-NMR(DMSO,101MHz)δ_H 7.73(1H,d,J＝12.4Hz,H-α),7.03(2H,d,J＝8.4Hz,H-2’,6’),6.61(2H,d,J＝8.4Hz,H-3’,5’),6.40(1H,d,J＝12.4Hz,H-β),6.15(1H,d,J＝2.4Hz,H-6),6.02(1H,d,J＝2.4Hz,H-4),4.40(1H,d,J＝8.0Hz,H-1”),3.23-3.70(6H,m,H-2”,6”).¹³C-NMR(DMSO,400MHz)δ_C 157.0(C-4’),154.4(C-3),150.6(C-5),136.8(C-2),132.6(C-β),130.5(C-2’,6’),130.0(C-1’),128.0(C-α),125.2(C-1),115.4(C-3’,5’),106.8(C-1”),106.5(C-6),103.2(C-4),77.7(C-5”),76.7(C-3”),74.5(C-2”),70.2(C-4”),61.3(C-6”)。通过与文献(董丽华,郭盼盼,郭栋,闫文英,王春英.顺式二苯乙烯苷的制备及结构鉴定,河北医科大学学报,2014,35(2):166-169)比较，鉴定为顺式-二苯乙烯苷(Cis-2,3,5,4'-tetrahydroxy stilbene-2-O-β-D-glycoside)。

峰2(图2中II):ESI-MS m/z 405[M-H]^-.¹H-NMR(DMSO,101MHz)δ_H 7.67(1H,d,J＝16.4Hz,H-α),7.44(2H,d,J＝8.4Hz,H-2’,6’),6.88(1H,d,J＝16.4Hz,H-β),6.74(2H,d,J＝8.4Hz,H-3’,5’),6.54(1H,d,J＝2.8Hz,H-6),6.18(1H,d,J＝2.8Hz,H-4),4.40(1H,d,J＝8.0Hz,H-1”),3.68(1H,d,J＝11.2Hz,H-6”),3.55(1H,dd,J＝11.2,4.4Hz,H-6”),3.23-3.35(4H,m,H-2”,5”).¹³C NMR(DMSO,400MHz)δ_C 157.6(C-4’),155.1(C-5),151.1(C-3),136.8(C-2),132.4(C-1),129.0(C-1’),128.9(C-),128.6(C-2’,6’),121.0(C-),115.9(C-3’,5’),107.2(C-1”),103.1(C-4),101.5(C-6),77.6(C-5”),76.6(C-3”),74.5(C-2”),69.8(C-4”),61.2(C-6”)。通过与文献(万近福,杨昌红,董明,韦建荣.珍珠菜的化学成分研究,天然产物研究与开发,2011,23:59-62)比较，鉴定为反式-二苯乙烯苷(Trans-2,3,5,4'-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glycoside)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种何首乌中顺式和反式二苯乙烯苷对照品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(3)将步骤(2)的提取物采用半制备高效液相色谱进行分离纯化，色谱条件为：色谱柱为Shim-pack PREP-ODS柱，流动相为乙腈-水，体积比25:75，收集色谱峰，检测其纯度，合并相同馏分，即分离得到顺式和反式二苯乙烯苷对照品；

顺式-二苯乙烯苷的结构式为反式-二苯乙烯苷的结构式为

2.如权利要求1所述的何首乌中顺式和反式二苯乙烯苷对照品的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，加入乙醇溶液进行超声提取，提取次数为2-4次，每次0.5-1小时。

3.如权利要求1所述的何首乌中顺式和反式二苯乙烯苷对照品的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，石油醚的加入量与浓缩液的体积比为1：(1-2)。

4.如权利要求1所述的何首乌中顺式和反式二苯乙烯苷对照品的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，乙酸乙酯的加入量与浓缩液的体积比为1：(1-2)。

5.如权利要求1所述的何首乌中顺式和反式二苯乙烯苷对照品的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，萃取后的水相中加入氨水进行pH调节。

6.如权利要求1所述的何首乌中顺式和反式二苯乙烯苷对照品的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，在采用半制备高效液相色谱进行分离纯化前，将步骤(2)制备的提取物用甲醇溶解，再用微孔滤膜进行过滤，制得样品液。

7.如权利要求1所述的何首乌中顺式和反式二苯乙烯苷对照品的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，纯度检测采用的方法是高效液相色谱法，色谱条件为：色谱柱为YMC-PackC18色谱柱，流动相为乙腈-水，体积比25:75，流速为1.0mL/min，检测波长为320nm。