CN1927192A - 从何首乌中分离获得的蒽醌类化合物作为放射增敏剂的应用 - Google Patents
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Abstract
从何首乌中分离获得的蒽醌类化合物作为放射增敏剂的应用，其特征是所获得的蒽醌类化合物具有以下通式的分子结构式，其中：R1是OH或OCH3，R2是CH3、COOH或OCH3，R3是H、OH或CH3，R4是OH或OCH3。从何首乌中分离获得的蒽醌类化合物，体外放射增敏效果明显，特别是对放射剂量为2Gy不敏感的人鼻咽癌CNE－1、宫颈癌Hela细胞株作用显著。
Description
技术领域
本发明涉及从何首乌中分离获得的蒽醌类化合物作为放射增敏剂应用的领域。
背景技术
放射治疗是治疗癌症的主要手段之一，从理论上讲，只要给予足够的放射剂量，肿瘤是可以完全控制的，但是在临床实际中，却很难做到这一点，其主要原因是肿瘤周围的正常组织对放射线的低耐受性限制了肿瘤部位的放射剂量。除了放射剂量的限制以外，实体瘤内多为乏氧细胞，肿瘤细胞乏氧对射线的敏感性不高，从而使得放疗照射后仍然得不到满意的效果。例如：单纯放疗鼻咽癌5年生存率仅为50％左右；治疗失败的原因之一为放射抗拒，因此研究肿瘤放射抗拒机制、寻找放射增敏途径是提高治愈率的途径之一。
发明内容
本发明要解决的技术问题是从何首乌中分离纯化得到具有放射增敏效果的蒽醌类化合物。本发明以如下技术方案解决上述技术问题：用作放射增敏剂的从何首乌中分离获得的蒽醌类化合物，其分子结构式为：
其中R1是OH或OCH3，R2是CH3，COOH或OCH3，R3是H，OH或CH3，R4是OH或OCH3。
当R1＝OH，R2＝CH3，R3＝OH，R4＝OH时，所述化合物为大黄素；
当R1＝OH，R2＝OCH3，R3＝CH3，R4＝OH时，所述化合物为大黄素甲醚；
当R1＝OH，R2＝CH3，R3＝H，R4＝OH时，所述化合物为大黄酚；
当R1＝OH，R2＝COOH，R3＝H，R4＝OH时，所述化合物为大黄酸。
上述结构特征的蒽醌类化合物作为有效成分，可制备成胶囊、片剂、颗粒剂和注射剂。
用从何首乌中分离获得的蒽醌类化合物作为放射增敏剂，体外放射增敏效果明显，特别对放射剂量为2Gy不敏感的人鼻咽癌CNE-1、宫颈癌Hela细胞株作用显著。其中大黄素的放射增敏作用是通过下调ATM和HIF-1α基因的表达、抑制Ku70的损伤修复作用而实现的。
附图说明
图1是各组细胞Ku80表达情况。
图2是各组细胞Ku70表达情况。
图3是各组细胞ATM表达情况。
图4是HIF-1mRNA表达情况。
具体实施方式
目前实验证明，放射增敏剂—蒽醌类和泛醌类化合物，是一类具有放射增敏作用且毒性较低的化合物。本发明首先从广西产何首乌制备蒽醌类化合物，然后研究蒽醌类化合物的体外细胞的抑制作用，选择对放射剂量为2Gy不敏感的人鼻咽癌CNE-1、宫颈癌Hela细胞株作为研究对象，观察从何首乌中分离获得的蒽醌类化合物的体外放射增敏效果。
何首乌Radix Polygoni MuItiflori(英)Fleeceflower Root，蓼科植物何首乌PolygonummultiflorumThunb的块根。性微温，味苦、甘、涩。生首乌能解毒、消痈、润肠通便，制首乌能补肝肾、益经血、乌须发、壮胫骨。
将何首乌饮片干燥后粉碎得何首乌粉末，用重量浓度为70％的酒精浸泡一天，然后加热回流提取，每次回流1个小时，连续回流5次，至颜色变浅，得到的提取液过滤后进行薄膜浓缩，浓缩液转入旋转蒸发仪继续浓缩，得到何首乌总浸膏。何首乌总浸膏用乙酸乙脂进行萃取，萃取液经旋转蒸发仪浓缩后，转入小烧杯中干燥，最后得到的乙酸乙脂萃取物，用硅胶柱层析进行分离。
首先用3000ml石油醚洗脱3次，然后分别按照石油醚∶乙酸乙酯为30∶1、10∶1、5∶1、3∶1、1∶1五个梯度进行洗脱，每个梯度各洗脱3个保留体积(石油醚中400g硅胶的保留体积大约是400×2.5＝1000m1)共3000ml，最后用甲醇洗柱。其中第4个组分为大黄素甲醚，第六个组分为大黄素，第11个组分为大黄酚。
实施例1
以化合物大黄素研究对鼻咽癌细胞CNE1的放射增敏活性：
1.采用MTT法确定不同浓度大黄素对鼻咽癌生长抑制作用：
分别取对数生长期的鼻咽癌细胞CNE-1，胰酶消化混悬均匀，调整细胞浓度为1×105/ml，加入96孔板，每孔100μl，37℃5％CO2培养箱培养过夜，分别加入含不同浓度的大黄素及不同浓度的安卡的培养液，各实验组设3个平行孔，空白对照为PBS。继续培养24h后，每孔加入5mg/ml MTT 20μl，37℃，5％CO2培养箱孵育4h后，弃上清，加入200μl二甲基亚砜，在490nm处测定吸光度A值，每浓度平行测定3孔。按下列公式求出生长抑制率(IR)，由IR对浓度作图，求出半数抑制浓度IC50。
2、确定大黄素放射增敏比：
选择完全没有细胞毒作用浓度的大黄素为放射增敏实验组，相同浓度的安卡阳性对照组及空白对照组，60Co照射剂量为2Gy。距离80cm，剂量率：146cGy/min，视野面积30cm×30cm。每组细胞平行分为三批，每批细胞每天照射一次，分别在照射后24h、48h、72h采用MTT法测定细胞的存活情况，并计算存活分数SF2和放射增敏比(sensitization enhancementratio.SER)。存活分数SF2＝(实验组平均OD值/空白对照组平均OD值)×100％，放射增敏比SER＝空白对照组SF2/实验组SF2。
3、放射增敏相关基因KU70、KU80、ATM、HIF-1的表达：
分别设立大黄素放射增敏低浓度实验A组、放射增敏高浓度实验B组，放射增敏安卡阳性对照C组，单一放疗D组，其中A、B、C、D组60Co照射剂量为2Gy。单距离80cm，剂量率：146cGy/min，视野面积30cm×30cm。另设单纯大黄素低浓度E组，高浓度F组，安卡阳性对照G组，空白组H组，单一高放射剂量I组，60Co照射剂量为8Gy。上述各组经处理后48h后，提取RNA，并逆转录为cDNA。根据Genebank人类Ku70、Ku80、ATM、HIF-1α的cDNA序列，引物用primer3软件自行设计，由上海生物工程技术有限公司合成，其PCR扩增的条件及产物的片段列于表1。
表1：
| 目的基因 | 退火温度(℃) | 引物序列 | 扩增片段长度(bp) |
| Ku70Ku80ATMHIF-1α | 60605858 | 上游5’-CAAGGGTACGCTGGGCAAGTTCAC-3’下游5’-TGGAAGTGCTTGGTGAGGGCTTC-3’上游5’-TGGCTGAAGGCAGTGTCACCTCTG-3’下游5’-CGGAAGGCTCGGATGCAGTCTATG-3’上游5’-CAGTGCCTTTCAGTGCCAAA-3下游5’-GTTTCATCTTCCGGCCTCTG-3’上游5’-AGCCGCTGGAGACACAAT-3’下游5’-TCGGAAGGACTAGGTGTCTGA-3’ | 117187546302 |
| β-actin | 56 | 上游5’-AACTCCATCATGAAGTGTGA-3’下游5’-ACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3’ | 247 |
PCR扩增条件：94℃5min，94℃45s，退火温度，72℃1min；30个循环，72℃10min。4℃保存。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色后于紫外灯下观察目的基因的表达情况。用凝胶成像系统测定各组内参基因β-actin和目的基因的volume值，计算目的基因与内参基因扩增产物的的体积比值，从而得到各目的基因mRNA的相对表达量。
4、实验结果
①MTT法实验结果表明，当大黄素浓度低于7.80ug/ml时，对鼻咽癌细胞CNE-1完全无细胞毒性，结果见表2。
表2药物作用后对鼻咽癌CNE-1细胞的抑制率
| 药物剂量ug/ml | 大黄素 | 安卡 | ||
| 吸光度A值 | 抑制率％ | 吸光度A值 | 抑制率％ | |
| 3.907.8015.6031.2562.50125.0250.0 | 0.818±0.0730.788±0.1640.766±0.0600.743±0.0900.699±0.0490.558±0.0410.424±0.023 | --0.913.889.5727.8145.14 | 0.743±0.0720.965±0.0910.980±0.0880.925±0.1410.899±0.0620.687±0.0510.673±0.046 | -----11.9012.94 |
| 对照组 | 0.773±0.117 | - | 0.773±0.117 | - |
②大黄素作用不同时间对鼻咽癌细胞CNE-1放射增敏效果：
选取对鼻咽癌细胞CNE-1完全无细胞毒性的大黄素浓度7.80ug/ml，观察不同作用时间各组细胞的存活分数和放射增敏比，结果列于表3。在不同时间点上大黄素均具有放射增敏作用，其中72h后的SER最大，可见大黄素能显著增加CNE-1细胞的放射敏感性。
表3药物作用时间照射后鼻咽癌细胞CNE-1的存活分数
| 组别 | 大黄素存活分数(％) | 安卡存活分数(％) | ||||
| 24h | 48h | 72h | 24h | 48h | 72h | |
| 7.80ug/ml+2Gy2Gy照射 | 89.9590.02 | 76.1881.82 | 42.2175.66 | 89.52 | 78.92 | 64.96 |
| 放射增敏比SER | 1.11 | 1.31 | 2.37 | 1.05 | 1.16 | 1.44 |
③大黄素放射增敏过程鼻咽癌细胞CNE-1放射敏感相关基因的表达情况：
选取对鼻咽癌细胞CNE-1完全无细胞毒性的大黄素低浓度和高浓度两个剂量作为实验组(即A组＝3.90ug/ml、B组＝7.80ug/ml)及C、D、E、F、G、H组，RT-PCR法测定放射敏感相关基因HIF-1α、ATM、Ku70、Ku80在鼻咽癌细胞CNE-1中的表达情况，结果见图1-4及表3。
图1和图2中M为分子量标志，1-9分别为Ku80(261bp)、Ku70(117bp)的目的条带；10-18为β-acting的目的条带(247bp)，其中1，10为A组，2，11为B组，3，12为C组，4，13为D组。5，14为E组，6，15为F组，7，16为G组，8，17为H组，9，18为I组。
图3和图4中M为分子量标志，其中A～I条带分别代表A～I组ATM、HIF-1α、β-Actin的表达条带。
从图1-4结果可见，2Gy、8Gy单纯照射组，基因ATM、Ku70表达上调；单纯大黄素加药组，基因Ku70、Ku80表达没有明显改变；高浓度组基因HIF-1α、ATM发生不同程度的下调，而当加药与放射治疗联合使用时，高浓度组各基因HIF-1α、ATM、Ku70、Ku80表达均下调。推测大黄素的放射增敏的作用可能是通过下调ATM和HIF-1α基因的表达、抑制Ku70的损伤修复作用而实现的。
实施例2
以化合物大黄素甲醚研究对宫颈癌Hela细胞放射增敏作用：
取对数生长期的宫颈癌Hela细胞，以0.25％胰蛋白酶消化并制成单细胞悬液，根据不同的照射剂量接种不同细胞数(细胞密度)于培养皿中，培养24h后更换含不同浓度(0.125、0.250、0.500nmol/L)的大黄素甲醚的培养液继续培养24h和48h(0.125、0.250nmol/L)后，在室温下用Co60源照射，照射剂量为0、2、4、6、8、10Gy照射后，用药组更换为不含药物的培养液与单纯照射组一起继续培养9d，9d后细胞用95％乙醇固定，姬姆萨染色，计数/50个细胞的克隆数，每个测量点实验均重复3次，克隆实验结果被换算成存活分数，以单纯加药组的存活分数(SF)为基准，对加药照射组的SF进行校正，以多靶单击数学模型拟合细胞存活曲线，放射增敏比定义为单纯放射与放射加药组的Dq值之比。
大黄素甲醚对放射敏感性的影响：不同浓度大黄素甲醚作用24h和48h后均能提高宫颈癌Hela细胞的放射敏感性，并呈现剂量时间依赖效应，用药0.125、0.250、0.500nmol/L24h加照射其放射增敏比分别为1.12、1.19、1.43，用药0.125、0.250nmol/L48h加照射的放射增敏比分别为1.37、1.48。
Claims (3)
1.从何首乌中分离获得的蒽醌类化合物作为放射增敏剂的应用，其特征是所获得的蒽醌类化合物具有以下通式的分子结构式：
其中R1是OH或OCH3，R2是CH3、COOH或OCH3，R3是H、OH或CH3，R4是OH或OCH3。
2.如权利要求1所述的从何首乌中分离获得的蒽醌类化合物作为放射增敏剂的应用，其特征是：当R1＝OH，R2＝CH3，R3＝OH，R4＝OH时，所述化合物为大黄素；当R1＝OH，R2＝OCH3，R3＝CH3，R4＝OH时，所述化合物为大黄素甲醚；当R1＝OH，R2＝CH3，R3＝H，R4＝OH时，所述化合物为大黄酚；当R1＝OH，R2＝COOH，R3＝H，R4＝OH时，所述化合物为大黄酸。
3.如权利要求1或2所述的从何首乌中分离获得的蒽醌类化合物作为放射增敏剂的应用，其特征是将所述的蒽醌类化合物作为有效成分用于制备胶囊、片剂、颗粒剂和注射剂。
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|---|---|---|---|---|
| CN105061524A (zh) * | 2015-08-04 | 2015-11-18 | 山东省分析测试中心 | 一种何首乌中顺式和反式二苯乙烯苷对照品的制备方法 |
| CN116650453A (zh) * | 2023-05-25 | 2023-08-29 | 河北医科大学第四医院 | 大黄素在制备治疗食管癌及食管癌放疗增敏药物中的应用 |
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