CN116650453B

CN116650453B - 大黄素在制备治疗食管癌及食管癌放疗增敏药物中的应用

Info

Publication number: CN116650453B
Application number: CN202310601118.9A
Authority: CN
Inventors: 贺宇彤; 宿歆; 靳晶; 郭冬利; 郝志华; 刘江惠; 王莹莹
Original assignee: Fourth Hospital of Hebei Medical University Hebei Cancer Hospital
Current assignee: Fourth Hospital of Hebei Medical University Hebei Cancer Hospital
Priority date: 2023-05-25
Filing date: 2023-05-25
Publication date: 2024-03-08
Anticipated expiration: 2043-05-25
Also published as: CN116650453A

Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体公开了大黄素在制备治疗食管癌及食管癌放疗增敏药物中的应用。本发明首次提供了大黄素在制备治疗食管癌及食管癌放疗增敏药物中的应用，经研究发现大黄素治疗食管癌或增强食管癌放疗敏感性的主要作用机制是：其可以通过诱导食管鳞状细胞癌KYSE150及其抗性细胞系KYSE150R发生G2/M期细胞周期阻滞，增强食管癌放疗敏感性，进而降低KYSE150和KYSE150R的增殖能力，抑制其迁移侵袭能力，并诱导细胞凋亡，同时显著抑制裸鼠移植瘤模型中肿瘤的生长。本发明提供的大黄素和放疗联合治疗，有望为食管鳞状细胞癌患者提供一种极具前景的治疗方案，对突破食管癌治疗瓶颈具有重大临床意义。

Description

大黄素在制备治疗食管癌及食管癌放疗增敏药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及大黄素在制备治疗食管癌和食管癌放疗增敏药物中的应用。

背景技术

食管癌(Esophageal Cancer)是常见的消化道恶性肿瘤，根据Gl obalCancer2020数据显示，全球食管癌新发病例高达60.4万，死亡病例高达54.4万。发病率和死亡率居全球肿瘤的第7位和第6位，是癌症相关死亡的主要原因之一。尽管随着治疗水平的不断提高，食管癌年龄标化5年生存率从20.9％上升到30.3％，有了较大的改善，但总体5年生存率仍然偏低，严重危害着高发区居民的生命健康。

食管癌的病理组织分型为食管鳞状细胞癌(ESCC)和食管腺癌(EAC)，以ESCC为主，占所有病例的85％以上。早期食管癌通常无明显特异性体征，大多数食管癌患者在确诊时已为局部晚期或存在远处转移。手术是早期食管癌的主要治疗方法，但对于无法实施根治性手术或中晚期食管癌患者，放射治疗则是其主要的治疗手段。

肿瘤放射治疗是利用放射线治疗肿瘤的一种局部治疗方法，然而，放射治疗过程中放疗抵抗现象普遍存在，多数患者对放射治疗不敏感，进而导致这部分患者预后较差，研究表明放疗后食管癌患者的5年生存率低于20％，且常导致局部治疗失败和复发转移。而常见的放疗增敏剂诸如甘氨双唑钠因毒副作用较严重已停用，因此，寻找毒副作用小且可以提高食管癌放疗敏感性的药物，对于提高食管癌患者的局部治疗效果和总体生存率具有十分重要的意义。

发明内容

针对现有食管癌治疗中存在的上述问题，本发明提供大黄素在制备治疗食管癌及食管癌放疗增敏药物中的应用。研究表明，肿瘤细胞的放疗敏感性与细胞在增殖周期各时相的分布密切相关，S期最不敏感，G0/G1期相对敏感，G2/M期最敏感。而大黄素能够诱导食管鳞状细胞癌KYSE150细胞系及其放疗抵抗细胞系KYSE150R发生G2/M期细胞周期阻滞，从而增强食管癌放疗敏感性，降低KYSE150和KYSE150R的增殖能力，抑制细胞迁移和侵袭，并诱导癌细胞凋亡。

为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：

本发明提供了大黄素在制备治疗食管癌药物中的应用。

同时，本发明还提供了大黄素在制备食管癌放疗增敏药物中的应用。

大黄素(1，3，8-三羟基-6-甲基蒽醌)，英文名称：Emodin，是一种天然的蒽醌类化合物，广泛存在于掌叶大黄、虎杖、何首乌等多种中草药中，主要应用于利尿、泻下、抗炎和血管松弛。本发明首次提供了大黄素在制备治疗食管癌及食管癌放疗增敏药物中的应用，经研究发现大黄素增强食管鳞状细胞癌放疗敏感性的主要作用机制是：其可以通过诱导食管鳞状细胞癌KYSE150细胞系及其放疗抵抗细胞系KYSE150R发生G2/M期细胞周期阻滞，进而提高食管癌放疗敏感性，降低KYSE150及其放疗抵抗细胞系KYSE150R的增殖能力，抑制其侵袭和迁移能力，并诱导癌细胞凋亡。本发明提供的大黄素和放疗联合治疗，有望为ESCC患者提供一种极具前景的治疗方案，对突破食管癌治疗瓶颈具有重大意义。

所述大黄素的结构式为：

大黄素，CAS号：518-82-1，分子式：C₁₅H₁₀O₅，分子量270.23。

优选的，所述食管鳞状细胞癌为未对放疗产生放疗抗性的食管鳞状细胞癌，或对放疗产生抵抗的食管鳞状细胞癌。

优选的，所述治疗食管癌的药物或食管癌放疗增敏药物还包括药学上可接受的赋形剂或载体。

优选的，所述治疗食管癌的药物或食管癌放疗增敏药物的制剂形式包括液体制剂或固体制剂。

优选的，所述治疗食管癌的药物或食管癌放疗增敏药物的给药方式包括口服给药或注射给药。

优选的，所述放疗包括使用选自以下放射线的治疗：X射线、α射线、β射线、γ射线、中子、电子线、质子束、粒子束或其组合；或者所述放疗包括外照射放射治疗或内照射放射治疗；或者所述放射治疗方法包括常规分割放射治疗或一次大剂量放射治疗。

优选的，所述放疗的一次照射剂量为2-6Gy；所述放疗增敏药物在放疗前48h使用。

大黄素在治疗食管癌以及提高食管鳞状细胞癌放射敏感性方面具有很好的应用前景，可用于制备治疗食管癌药物及提高食管癌放疗敏感性的药物，有利于提高患者的放疗敏感性及预后，为临床食管癌患者的治疗提供更为有效的治疗方案，也为后续食管癌的药物研发、临床治疗等提供了一个新的方向，具有极高的社会价值和市场应用前景。

附图说明

图1是本发明实施例2中KYSE150细胞系经不同浓度大黄素处理，联合(或不联合)6Gy X射线照射后的细胞克隆形成结果图(*P<0.05)，其中，A为克隆形成照片，B为形成克隆形成率柱状图；

图2是本发明实施例2中KYSE150R细胞系经不同浓度的大黄素处理，联合(或不联合)6Gy X射线照射后的克隆形成结果图，其中，A为克隆形成照片，B为形成克隆形成率柱状图；

图3是本发明实施例3中KYSE150细胞系经不同浓度大黄素处理，联合(或不联合)6Gy X射线照射后的细胞周期分布情况图，其中，A为流式细胞周期结果图，B为细胞周期分布柱状图；

图4是本发明实施例3中KYSE150R细胞系经不同浓度大黄素处理，联合(或不联合)6Gy X射线照射后的细胞周期分布情况图，其中，A为流式细胞周期结果图，B为细胞周期分布柱状图；

图5(A)为本发明实施例4中KYSE150细胞系在经不同浓度大黄素处理，不联合6GyX射线照射的划痕愈合结果图；

图5(B)为本发明实施例4中KYSE150细胞系在经不同浓度大黄素处理，联合6Gy X射线照射的划痕愈合结果图；

图6(A)为实施例4中KYSE150R细胞系在经不同浓度大黄素处理，不联合6Gy X射线照射的划痕愈合结果图；

图6(B)为实施例4中KYSE150R细胞系在经不同浓度大黄素处理，联合6Gy X射线照射的划痕愈合结果图；

图7是本发明实施例4中KYSR150及KYSE150R细胞系在经不同浓度大黄素处理，联合(或不联合)6Gy X射线照射后的迁移率柱状图，其中，A为KYSE150细胞系的迁移率柱状图，B为KYSE150R细胞系的迁移率柱状图；

图8是本发明实施例5中KYSE150细胞系经不同浓度大黄素处理，联合(或不联合)6Gy X射线照射后的侵袭情况图，其中，A为Transwell小室侵袭实验结果图，B为细胞侵袭率柱状图；

图9是本发明实施例5中KYSE150R细胞系经不同浓度的大黄素处理，联合(或不联合)6Gy X射线照射后的侵袭情况图，其中，A为Transwell小室侵袭实验结果图，B为细胞侵袭率柱状图；

图10为本发明实施例6中KYSE150细胞系经不同浓度大黄素处理，联合(或不联合)6Gy X射线照射后的细胞凋亡率情况图，其中，A为细胞凋亡情况流式图，B为细胞凋亡率柱状图；

图11为本发明实施例6中KYSE150R细胞系经不同浓度大黄素处理，联合(或不联合)6Gy X射线照射后的细胞凋亡率情况图，其中，A为细胞凋亡情况流式图，B为细胞凋亡率柱状图；

图12为本发明实施例7中KYSE150细胞系构建的裸鼠异种移植瘤模型，经200mg/kg大黄素灌胃处理，联合6Gy X射线照射后的荷瘤小鼠及其肿瘤解剖图；

图13为本发明实施例7中KYSE150R细胞系构建的裸鼠异种移植瘤模型，经200mg/kg大黄素灌胃处理，联合6Gy X射线照射后的荷瘤小鼠及其肿瘤解剖图；

图14为本发明实施例7中荷瘤小鼠解剖后，肿瘤体积柱状图，其中，A为KYSE150细胞移植瘤模型肿瘤体积柱状图，B为KYSE150R细胞移植瘤模型肿瘤体积柱状图；

图15为本发明实施例7中荷瘤小鼠解剖后，肿瘤重量柱状图，其中，A为KYSE150细胞移植瘤模型肿瘤重量柱状图，B为KYSE150R细胞移植瘤模型肿瘤重量柱状图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

1.材料

1.1主要仪器和试剂

1.2细胞株

人食管鳞状细胞癌细胞系KYSE150：由河北医科大学第四医院肿瘤研究所提供。

人食管鳞状细胞癌放疗抵抗系KSYE150R：将KYSE150在无菌细胞培养瓶中培养至细胞密度为50％后，用2Gy剂量的X射线进行照射，孵育至细胞密度达90％，用胰酶消化细胞，然后再次孵育至细胞密度为50％，用2Gy剂量的X射线进行第二次照射，重复以上步骤，直至累积剂量达到18Gy，得到放疗抵抗细胞系KSYE150R。

1.3试剂盒

试剂盒名称	生产厂家
		凋亡检测试剂盒	碧云天生物科技有限公司

1.3主要试剂的配制：

RMPl-l640细胞培养液(含10％胎牛血清)：将FBS胎牛血清50mL和5mL青霉素-链霉素于超净工作台中加入到450mL的RPMI-1640培养基中吹打混匀，于4℃冰箱保存。

含大黄素的细胞培养基：称取大黄素加入二甲基亚砜(DMSO)中，配制得到20mM的大黄素母液，于-20℃冰箱避光保存。实验时按不同浓度大黄素用细胞培养液倍比稀释上述母液，得到含大黄素的细胞培养基(DMSO小于1‰)。

2试验方法

2.1细胞处理

2.1.1细胞培养方法

(1)实验前用75％乙醇擦拭超净工作台，打开紫外线灯照射30min，确保相对无菌环境，将需要使用的细胞培养基、PBS缓冲液及胰酶室温放置至常温。

(2)将人食管鳞状细胞癌细胞系KYSE150和人食管鳞状细胞癌放疗抵抗细胞系KYSE150R加入装有RPMI-1640培养液(含10％胎牛血清)的培养瓶(培养面积25cm²)中进行培养，培养环境为37℃、5％CO₂的恒温培养箱，每日监测细胞生长状态，当细胞间融合度达到80％-85％时，培养液颜色已略微发黄，此时弃去培养液，用2mL PBS缓冲液轻柔冲洗2-3次；

(3)向培养瓶中每瓶加入1mL 0.25％胰酶，轻微晃动培养瓶使胰酶与细胞充分接触，将培养瓶于37℃培养箱中放置2min，取出培养瓶，置于显微镜中观察，当细胞失去原本形态，固缩变成圆球形，但未完全漂浮脱落时，说明消化程度合适，此时加入2mL RPMI-1640培养液(含10％胎牛血清)中和胰酶，终止消化，用1mL枪头轻柔吹打，形成单细胞悬液，加入15mL离心管中；

(4)将离心管放入低速离心机中，以1000rpm离心5min，离心后弃去上清液，加入新的RPMI-1640培养液(含10％胎牛血清)，用1mL枪头轻柔吹打，形成单细胞悬液，将单细胞悬液稀释2倍，接种至新的装有RPMI-1640培养液(含10％胎牛血清)的培养瓶中，按“十字交叉”法轻轻晃动培养瓶使细胞均匀铺于瓶底，置于37℃、5％CO₂的恒温培养箱中继续培养。实验时取对数生长期的细胞。

2.1.2细胞冻存

冻存时选取生长状况良好且处于对数生长期的细胞，弃去培养液，用2mL PBS缓冲液轻柔冲洗2-3次，每瓶加入1mL 0.25％胰酶，放入37℃培养箱中消化2min，加入2mL RPMI-1640培养液(含10％胎牛血清)终止消化，用1mL枪头轻柔吹打，使细胞脱落，形成单细胞悬液，加入15mL离心管中，将离心管放入低速离心机中，以1000rpm离心5min，离心后弃去上清液，加入细胞冻存液重悬细胞沉淀，并用枪头轻柔吹打使之混匀。

将细胞悬液按照1.5mL/管的量分装入无菌冻存管中，并尽量使细胞浓度达到1×10⁶细胞/mL冻存液，将细胞冻存管放入-80℃冰箱短期存放，长期冻存则需要放入-190℃液氮罐中。

2.1.3冻存细胞复苏

将需要复苏的细胞冻存管从-80℃冰箱或液氮罐中取出，将冻存管放入PE手套中，并浸没在37℃水浴锅中晃动以减少解冻时间。待冻存液完全融化后，酒精纱布擦拭冻存管口，并吸取冻存管中的细胞悬液，缓慢加入装有10mL新鲜RPMI-1640培养液(含10％胎牛血清)的离心管中，1000rpm低速离心5min，离心结束后弃去上清液，用RPMI-1640培养液(含10％胎牛血清)重悬细胞，轻柔吹打混匀，并将细胞悬液加入含有RPMI-1640培养液(含10％胎牛血清)的培养瓶中，轻轻晃动使细胞均匀铺于瓶底，放入37℃、5％CO₂的恒温培养箱中培养。随时观察细胞贴壁情况，生长状况，培养液的颜色变化，并在合适的时间进行换液或传代培养。实验时取对数生长期的细胞。

2.1.4细胞计数

将细胞计数板及盖片用酒精擦拭干净，并将盖片盖在计数板相应位置。将待测细胞用0.25％胰酶消化，轻柔吹打混匀，使之成为单细胞悬液，用10μL小枪头从细胞悬液中部取10μL，缓慢将其打入细胞计数板和盖片的边缘，使细胞悬液充满盖片和计数板之间，无气泡产生，将计数板置于光学显微镜下观察，计算细胞计数板四大格细胞总数，压线细胞只记左侧和上方。按照如下公式计算：

细胞数/mL＝四大格细胞总数/4×10⁴；

每1000个细胞加入的细胞悬液量＝100/(四大格细胞总数/4)μL。

2.1.5细胞照射

待培养瓶或六孔板内细胞生长至细胞密度达到50％-60％，将需要照射组采用医用直线加速器(河北医科大学第四医院放疗中心，中国石家庄)进行X线放射治疗，照射剂量为6Gy，剂量率为300MV/min，源皮肤距离为100cm，在特定时间(培养瓶48h，六孔板8-10d)收集细胞用于下一步研究。

2.1.6统计学处理

统计学处理：上述实施例的所有实验均重复3次以上，结果采用均数±标准差表示。采用SAS统计软件对相关数据进行t检验，以P<0.05为有显著性差异。

实施例2

大黄素联合(或不联合)放疗对食管癌细胞克隆形成能力的影响：

1.取生长状况良好，且处于对数生长期的KYSE150及其放疗抵抗细胞系KYSE150R细胞，用0.25％胰酶消化，加入RPMI-1640培养液(含10％胎牛血清)终止消化，1000rpm离心5min，弃去上清液，加入新的RPMI-1640培养液(含10％胎牛血清)，用枪头轻柔吹打混匀，形成单细胞悬液，使用细胞计数板计数，六孔板每孔接种的细胞数为2000，加入RPMI-1640培养液(含10％胎牛血清)，十字交叉法摇晃均匀，尽量保证细胞在皿底不黏连成团，单细胞之间有一定的距离，且分布均匀，接种好的6孔板置于37℃、5％CO₂的恒温培养箱中培养。

2.隔天观察细胞状态，若细胞正常贴壁，形态无异常，则弃去每孔中的培养液，换成含不同浓度大黄素的培养基(将实施例1中的含大黄素培养基稀释为10μM、20μM)，将需要照射的六孔板于6Gy X射线下进行照射(剂量率为300MV/min，源皮肤距离为100cm)，然后继续培养，同一个浓度至少设置3个重复孔，并设置对照组，即更换为不含大黄素的培养基。

3.定期观察接种好的培养板，7天时，培养板中肉眼可见白色小点，显微镜下可见细胞克隆(每个克隆的细胞数在50个以上)，此时终止培养，弃去六孔板中的培养液。

4.各培养孔贴壁缓慢加入1-2mL PBS缓冲液，轻柔摇晃，浸洗两次，吸出PBS缓冲液，加入4％多聚甲醛溶液1mL/孔，室温固定20min，吸出多聚甲醛溶液，室温静置一段时间使残留的多聚甲醛溶液挥发，然后于室温下用0.1％结晶紫染色20min，将结晶紫染液回收，并用蒸馏水缓慢冲洗六孔板，去除残留结晶紫染液，冲洗完成后六孔板倒扣在吸水纸上晾干。

5.将染色完成的细胞克隆进行手机拍照，使用Image J和Graphpad Prism软件对克隆数目进行计数(一般设置以大于50个细胞的集落视为一个克隆计数)，并计数克隆形成率，公式如下：

克隆形成率(％)＝克隆数目/接种细胞数×100％。

KYSE150细胞经不同浓度大黄素处理后的克隆形成图如图1A所示，以克隆形成率为纵坐标，以大黄素浓度为横坐标，绘制细胞克隆形成柱形图，如图1B所示。

结果可知，对照组克隆形成率为61.05％，使用浓度为10μM、20μM的大黄素处理后，处理组KYSE150细胞的克隆形成率分别为43.70％和32.70％。而采用6Gy X射线照射后，不经大黄素处理的KYSE150的克隆形成率由61.05％下降为36.60％。经大黄素(10μM、20μM)联合6Gy X射线照射处理后，克隆形成率分别降低为27.95％和1.75％。

KYSE150R细胞经不同浓度大黄素处理后的克隆形成图如图2A所示，以克隆形成率为纵坐标，以大黄素浓度为横坐标，绘制细胞克隆形成柱形图，如图2B所示。

结果可知，对照组克隆形成率为55.96％，使用浓度为10μM、20μM的大黄素处理后，处理组KYSE150R细胞的克隆形成率分别为39.23％和28.70％。而采用6Gy X射线照射后，不经大黄素处理的KYSE150的克隆形成率为58.25％。经大黄素(10μM、20μM)联合6Gy X射线照射处理后，克隆形成率分别降低为25.90％和13.08％。

以上结果证明，经不同浓度大黄素处理后，可以不同程度的抑制KYSE150细胞及其放疗抵抗细胞系KYSE150R的克隆形成能力，而大黄素联合放疗相较于单独放疗，KYSE150和KYSE150R的平板克隆形成能力进一步下降，且该抑制作用具有药物剂量相关性。

实施例3

大黄素联合(或不联合)放疗对食管癌细胞周期的影响：

按照上述实施例2的方法，分别采用0μM、10μM、20μM的大黄素处理KYSE150和KYSE150R细胞系48h后，联合(或不联合)6Gy X射线照射，待细胞稳定24h后收取细胞。将各处理组一并使用75％乙醇溶液固定，PI染色后采用流式细胞仪检测分析大黄素对细胞周期的影响。以DNA量为横坐标，以计数到的有效细胞数为纵坐标，绘制大黄素联合(或不联合)6Gy X射线照射对细胞周期影响流式图，如图3A和4A所示。以大黄素浓度以及联合(或不联合)6Gy X射线照射为横坐标，以各细胞周期的比例为纵坐标，绘制大黄素对细胞周期影响的柱形图，如图3B和4B所示。

如图3A，3B所示，不经过X射线照射，经不同浓度(0μM、10μM和20μM)大黄素处理后的KYSE150细胞系G0/G1期细胞比例分别是40.53％、29.96％和25.34％，G2/M期细胞比例分别是9.22％、11.48％和23.62％；联合6Gy X射线照射后，对照组(0μM)、10μM和20μM组G0/G1期细胞比例分别是37.89％、40.44％和53.18％，而G2/M期细胞比例分别是12.51％、11.63％和7.08％。

如图4A，4B所示，不经过X射线照射，经不同浓度(0μM、10μM和20μM)大黄素处理后的KYSE150R细胞系G0/G1期细胞比例分别是42.03％、30.28％和21.52％，G2/M期细胞比例分别是7.79％、13.38％和24.25％；联合6Gy X射线照射后，对照组(0μM)、10μM和20μM组G0/G1期细胞比例分别是43.12％、43.57％和54.40％，而G2/M期细胞比例分别是11.19％、10.60％和8.66％。

以上结果证明，大黄素可以诱导食管鳞状细胞癌KYSE150及其放疗抵抗细胞系KYSE150R的细胞周期从G0/G1期向对X射线照射更敏感的G2/M期推进，并且这种推进效果具有药物剂量依赖性。结合实施例3结果可知，经大黄素处理后再进行X射线照射，被推进到G2/M期的细胞被大量杀死，导致G2/M期细胞比例减少，G0/G1期细胞比例相对增加。

实施例4

大黄素联合(或不联合)放疗对食管癌细胞迁移能力的影响：

1.取生长状况良好，且处于对数生长期的KYSE150和KYSE150R细胞，用0.25％胰酶消化，加入RPMI-1640培养液(含10％胎牛血清)终止消化，1000rpm离心5min，弃去上清液，加入新的RPMI-1640培养液(含10％胎牛血清)，用枪头轻柔吹打混匀，形成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×10⁶个/mL，分别加入含0μM、10μM和20μM大黄素的培养基重悬细胞，在六孔板中每孔加入400μL细胞悬液，补充含0μM、10μM和20μM大黄素的培养基至对应孔中，保证每孔2mL，各处理组重复三个孔数，十字交叉法摇晃均匀，于37℃、5％CO₂的恒温培养箱培养24h待细胞长满。

2.将需要照射的六孔板于6Gy X射线下进行照射，照射后用10μL枪头沿着直尺，垂直于横线划痕。

3.PBS缓冲液中轻柔冲洗三次，每孔加入RPMI-1640培养液(含10％胎牛血清)2mL。在倒置的显微镜下于0h、24h和48h分别观察划痕间距并拍照，计算细胞迁移的百分率，计算公式如下：

细胞迁移率＝(0h划痕面积-48h划痕面积)/0h划痕面积×100％

不同浓度大黄素联合(或不联合)6Gy X射线照射处理KYSE150及KYSE150R细胞的迁移能力结果图如图5A，5B和图6A，6B所示。以大黄素浓度为横坐标，细胞迁移率为纵坐标，绘制细胞迁移率的柱形图，如图7A和7B所示。

如图5A，5B以及图6A，6B所示，KYSE150和KYSE150R细胞的划痕面积随观察时间的延长进一步缩小，且随大黄素浓度的提高，抑制划痕愈合的能力明显上升，呈剂量依赖性，联合6Gy X射线后，相较于单独用药或者单纯放疗，划痕愈合能力都进一步受到抑制。

如图7A，7B所示，观察48h后，不经大黄素处理且不经X射线照射的KYSE150和KYSE150R细胞迁移率分别为99.97％和99.98％；采用6Gy X射线照射后，不经大黄素处理的KYSE150及KYSE150R细胞迁移率为81.57％和99.89％；经20μM大黄素联合6Gy X射线照射处理后，KYSE150及KYSE150R细胞迁移率分别降低为17.12％和44.84％。

以上结果证明，单纯使用大黄素治疗可以抑制食管鳞状细胞癌KYSE150及其放疗抵抗细胞系KYSE150R的迁移能力，同时，大黄素联合放疗相较于单独放疗而言，KYSE150及其放疗抵抗细胞系KYSE150R的迁移能力进一步下降，且该抑制作用呈药物剂量依赖性。

实施例5

大黄素联合(或不联合)放疗对食管癌细胞侵袭能力的影响：

1.Matrigel胶的制备：将Matrigel胶和无血清RPMI-1640培养液以1：10的比例进行稀释，4℃保存备用。

2.将带有8μm孔的Transwell小室全部放在24孔板中，上室加入40μl稀释好的Matrigel胶，轻摇铺平整个小室，防止气泡产生，于37℃、5％CO₂的恒温培养箱放置24h待Matrigel胶凝固。

3.取生长状况良好，且处于对数生长期的KYSE150和KYSE150R细胞，分别加入含0μM、10μM和20μM大黄素的培养基培养48h，用0.25％胰酶消化，加入RPMI-1640培养液(含10％胎牛血清)终止消化，1000rpm离心5min，弃去上清液，加入无血清RPMI-1640培养液，用枪头轻柔吹打混匀，形成单细胞悬液，使用细胞计数板计数，Transwell小室的上腔室接种的细胞数为1×10⁵个，用无血清RPMI-1640培养基补充上室液体至200μL，下室加入600μLRPMI-1640培养液(含10％胎牛血清)，十字交叉法摇晃均匀，尽量保证细胞在上室底不黏连成团，单细胞之间有一定的距离，且分布均匀，接种好的24孔板置于37℃、5％CO₂的恒温培养箱中培养。

4.37℃、5％CO₂恒温培养48h后取出小室，用棉签小心擦拭上室Matrigel胶以及胶上细胞，镊子夹取小室于PBS缓冲液中轻柔摇晃，浸洗三次，于24孔板中加入4％多聚甲醛溶液1mL/孔，将小室放入，室温固定20min，再次用PBS清洗三次，室温晾干。0.1％结晶紫染色20min，PBS清洗三次，室温晾干。

5.将Transwell小室上的聚碳酸酯膜从小室上剪下，置于载玻片上，盖玻片封片，显微镜下观察、拍照，随机挑选显微镜下5个视野计数穿透小室的细胞数目。

不同浓度大黄素联合(或不联合)6Gy X射线照射处理KYSE150及KYSE150R细胞的Transwell小室侵袭结果图如图8A，9A所示。以大黄素浓度为横坐标，侵袭细胞数为纵坐标，绘制细胞侵袭的柱状图，如图8B，9B所示。

如图8，9所示，单纯使用大黄素治疗可以抑制食管鳞状细胞癌KYSE150及其放疗抵抗细胞系KYSE150R的侵袭能力，且呈现剂量依赖性。大黄素联合放疗相较于单独放疗而言，KYSE150及其放疗抵抗细胞系KYSE150R的侵袭能力进一步下降，且该抑制作用呈药物剂量依赖性。

以上结果证明，经不同浓度大黄素处理后，可以不同程度的抑制KYSE150及其放疗抵抗细胞系KYSE150R的侵袭能力，而大黄素联合放疗相较于单独放疗，KYSE150和KYSE150R的侵袭能力进一步下降，且该抑制作用具有药物剂量相关性。

实施例6

大黄素联合(或不联合)放疗对食管癌细胞凋亡能力的影响：

1.按照上述实施例3的方法，分别采用0μM、10μM、20μM的大黄素处理KYSE150和KYSE150R细胞系48h后，联合(或不联合)6Gy X射线照射，然后继续使用相应浓度的大黄素干预24h后收取细胞。

2.收取的各组细胞经1000rpm离心10min，加入2mL PBS缓冲液重悬细胞，再次离心，反复清洗细胞3次。

3.弃去离心上清，依次加入100μL上样缓冲液，PI染液10μL，Annexin V-FITC染液5μL，避光孵育15-30min，补充400μL上样缓冲液后上机。

4.将各处理组一并通过Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪定量检测细胞凋亡率。

不同浓度大黄素联合(或不联合)6Gy X射线照射处理KYSE150及KYSE150R细胞的凋亡结果图，以Annexin V-FITC为横坐标，以PI为纵坐标，右下象限是凋亡早期细胞，右上象限是凋亡晚期细胞，展示凋亡结果流式图，如图10A，图11A所示。以大黄素浓度为横坐标，细胞凋亡率为纵坐标，绘制细胞凋亡率的柱形图，如图10B，图11B所示。

细胞凋亡率＝早期凋亡细胞比例+晚期凋亡细胞比例。

如图10A和10B所示，不经过X射线照射时，KYSE150细胞系的对照组(0μM)、0.8μM和1.6μM组的凋亡率分别为0.96％、1.93％和3.08％；联合6Gy X射线照射后，0μM、0.8μM和1.6μM组的凋亡率分别为9.91％、11.37％和16.38％。试验结果证明，大黄素作用于KYSE150细胞系后，细胞凋亡率增加，并呈现剂量依赖性；联合6Gy X射线放疗处理后，细胞凋亡率显著增加，并呈现剂量依赖性。

如图11A和图11B所示，不经过X射线照射时，KYSE150R细胞系的对照组(0μM)、0.8μM和1.6μM组的凋亡率分别为0.76％、3.27％和4.87％；联合6Gy X射线照射后，0μM、0.8μM和1.6μM组的凋亡率分别为6.11％、14.42％和22.64％。试验结果证明，大黄素作用于KYSE150R细胞系后，细胞凋亡率增加，并呈现剂量依赖性；联合6Gy X射线放疗处理后，细胞凋亡率显著增加，并呈现剂量依赖性。

以上结果证明，经不同浓度大黄素处理后，可以不同程度的提高KYSE150细胞及其放疗抵抗细胞系KYSE150R的凋亡率，而大黄素联合放疗相较于单独放疗，KYSE150和KYSE150R的总凋亡率进一步下降，且该作用具有药物剂量相关性。

实施例7

大黄素联合放疗对食管癌细胞裸鼠移植瘤模型的影响：

1.从北京华阜康生物科技股份有限公司订购24只4-5周龄大的BALB/c-nu雄性裸鼠，饲养在无特定病原体(SPF)的设施中，先适应性饲养一周，然后将5×10⁶个KYSE150/KYSE150R细胞注射到每只小鼠的右侧后腿上，一周左右开始形成异种移植瘤。每隔一天测量肿瘤的长宽以及监测小鼠的体重，肿瘤体积的计算方法为：长×宽²/2。

2.随机将裸鼠分为三组进行治疗(每组4只裸鼠)，对照组(每隔一天100μL花生油灌胃处理)，放疗组(每隔一天100μL花生油灌胃处理)，大黄素联合放疗组(200mg/kg大黄素，溶于花生油，每隔一天进行油灌胃处理)。

3.灌胃3次以后，除对照组外，放疗组及联合治疗组裸鼠固定于小鼠固定器上，暴露右后腿肿瘤位置，遮蔽裸鼠其他暴露皮肤，行局部放疗，放疗剂量为2Gy/次，隔天放疗，放疗3次累积6Gy。放疗结束一周后拖尾断颈法处死裸鼠，并解剖肿瘤，称重拍照。

200mg/kg大黄素联合放疗处理KYSE150及KYSE150R细胞的裸鼠移植瘤模型结果分别如图12和图13所示。以不同处理组为横坐标，肿瘤体积为纵坐标，绘制不同处理组肿瘤体积柱状图如图14所示。以不同处理组为横坐标，肿瘤重量为纵坐标，绘制不同处理组肿瘤重量柱状图如图15所示。

如图12和图13所示，相较于对照组肿瘤，放疗组和大黄素与放疗联合治疗组均能抑制两组裸鼠肿瘤生长，而联合治疗组肿瘤体积和重量显著小于单纯放疗组和对照组，且差异有统计学意义，如图14和15所示。

以上结果证明，体内实验验证大黄素与放疗联合治疗可以显著抑制KYSE150及其放疗抵抗细胞系KYSE150R的裸鼠移植瘤中肿瘤的生长，且抑制作用较单独放疗更为明显。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.大黄素作为唯一活性成分在制备食管鳞状细胞癌放疗增敏药物中的应用，所述大黄素的结构式如下：

。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述食管鳞状细胞癌为未对放疗产生放疗抗性的食管鳞状细胞癌，或对放疗产生放疗抵抗的食管鳞状细胞癌。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物还包括药学上可接受的赋形剂或载体。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述药物的制剂形式选自液体制剂或固体制剂。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述药物的给药方式选自口服给药或注射给药。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述放疗使用选自以下放射线的治疗：X射线、α射线、β射线、γ射线、中子、电子线、质子束、粒子束或其组合。

7.如权利要求1所述的应用，其特征在于：或者所述放疗选自外照射放射治疗或内照射放射治疗。

8.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述放射治疗方法选自常规分割放射治疗或一次大剂量放射治疗。

9.如权利要求1或6所述的应用，其特征在于：所述放疗的一次照射剂量为2-6Gy；所述放疗增敏药物在放疗前48h使用。