CN105651891B - 一种食品中核苷酸的高效液相色谱检测法 - Google Patents

一种食品中核苷酸的高效液相色谱检测法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种食品中核苷酸的高效液相色谱检测法，首先样品前处理：称取待测样品，加入水，用乙酸调节pH至4～5，涡旋5~10min后，加入乙醇溶液，蜗旋5~10min后8000~12000r/min离心5~15min，用乙醇溶液洗涤，55~70℃旋干，用水定容，取0.5~2mL过0.22μm滤膜于进样瓶中，供上机分析；接着进行高效液相色谱检测。本发明以乙酸与乙醇作为共沉淀剂，应用SB‑AQ柱和四丁基硫酸氢铵分离和检测核苷酸，方法的平均回收率为82.44%～98.92%，相对标准偏差为0.60%～2.27%，且该方法可同时检测奶粉、米粉和奶米粉中的核苷酸，适合多种产品，适用范围广，应用前景好。

Description

一种食品中核苷酸的高效液相色谱检测法
技术领域
本发明属于食品检测技术领域。更具体地，涉及一种食品中核苷酸的高效液相色谱检测法。
背景技术
核苷酸是构成核酸的成分，是由含氮的碱基、核糖或脱氧核糖、磷酸3种分子连接而成。核苷酸在人体内广泛分布，具有多种生物学功能。核苷酸发挥生理功能离不开五碳糖的重要结构也即核苷。由于牛乳和母乳中的核苷酸质量浓度差距较大，母乳中含有多种核苷和核苷酸，而牛奶中一般不含有，所以目前在乳制品中添加核苷酸主要用于婴幼儿配方奶粉中。在婴儿配方奶粉中添加的核苷酸种类主要有以下5种：胞嘧啶核苷酸(cytidine，CMP)；尿嘧啶核苷酸(uridine，UMP)；腺嘌呤核苷酸(adenosine，AMP)；鸟嘌呤核苷酸(ganosine，GMP)；次黄嘌呤核苷酸(inosine，IMP)；其主要生理功能是广泛参与人体的能量代谢、蛋白质合成，具有提高各种酶的活性、活化细胞功能、促进抗体形成、增强免疫功能的作用。它们可促进神经细胞的生长发育，是与“神经生长因子”有关或者可以作为神经生长物质利用的营养成分。核苷酸是婴儿的条件必需营养素，对婴儿的生长发育有重要的作用。另外，一些临床上的研究发现，添加核苷酸的婴儿配方奶粉可减少腹泻的发生及促进较小胎儿的生长发育。
但是，人体对核苷酸的需求是有一定限度的，并非越多越好。我国还没有关于婴幼儿食品和乳品中核苷的相关国家标准。目前，许多企业特别是国外独资或合资，以及我国大型乳品企业的标准中核苷酸都作为重要指标，所以对婴儿配方奶粉和米粉产品中核苷酸的质量监控极为重要，这就需要相应的检测技术支持。
但是，目前我国对于婴幼儿食品和乳品中核苷酸的测定方法并未制定国家标准。虽然目前有关核苷酸检测的报道较多，可检索到大量分析的报道，但食品分析集中在味精和肉等方面，有些方法的前处理尚不成熟。而婴儿配方奶粉是婴儿食用辅食前的唯一食物，对于其健康生长关系很大。目前报道的检测方法主要有比色法、离子交换色谱法、毛细管电泳法、液相色谱法、液相色谱质谱联用法等。比色法应用较早，但需要排除干扰、操作烦琐。离子交换色谱法、毛细管电泳法测定结果重现性不佳。液相色谱质谱联用法存在仪器价格昂贵，基质干扰大、检测成本高的缺点。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对现有技术中婴幼儿乳基制品和淀粉基制品中核苷酸检测技术的缺陷和不足，提供一种检测奶粉和米粉中核苷酸的方法，该方法优化了前处理方法，去除大量的杂质后，应用水相C-18柱，摸索采用最佳的流动相，有效将杂质与目标化合物分开，使得婴幼儿配方奶粉中核苷酸检测的难题得以解决。
本发明的目的是提供一种食品中核苷酸的高效液相色谱检测法。
本发明另一目的是上述方法在检测食品(尤其是婴幼儿奶粉，如奶粉和米粉)中核苷酸方面的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种食品中核苷酸的高效液相色谱检测法，包括如下步骤：
S1.样品前处理：称取待测样品，加入水，调节pH至4～5，涡旋5～10min后，加入乙醇溶液，蜗旋5～10min后8000～12000r/min离心5～15min，用乙醇溶液洗涤，55～70℃旋干，用水定容，取0.5～2mL过0.22μm滤膜于进样瓶中，供上机分析；
S2.进行高效液相色谱检测。
优选地，步骤S1所述样品前处理是称取0.5g待测样品于50mL聚四氟乙烯离心管中，加入10mL水溶液，用冰醋酸调节pH在4～5之间，涡旋5min后，加入40mL的乙醇溶液，蜗旋5min后10000r/min离心10min，用乙醇溶液洗涤，60℃旋干，用5～10mL水定容，取1mL过0.22μm滤膜于进样瓶中，供上机分析。
更优选地，60℃旋干后用5mL水定容。
优选地，步骤S1所述调节pH为用乙酸调节pH在4～5之间。更优选地，所述乙酸为冰醋酸。
优选地，步骤S2所述高效液相色谱检测的色谱柱为SB-AQ柱。
优选地，步骤S2所述高效液相色谱检测的流动相为四丁基硫酸氢铵。
优选地，步骤S2所述高效液相色谱检测波长为254nm。
优选地，所述高效液相色谱检测的柱温在60～70℃之间。
优选地，步骤S2所述高效液相色谱检测的样品上机时间为样品制备好之后的60～240小时，上机前样品需要冷藏保存。
优选地，所述高效液相色谱检测的流动相的pH为2.75±0.3。
优选地，所述流动相在22±4℃下。
优选地，所述流动相的浓度为1.5mmol。
优选地，所述食品为奶粉、米粉和/或奶米粉。
本发明优化了前处理步骤，去除了大部分杂质干扰后，通过选择合适的柱子，优化离子对试剂的浓度和pH后，获得了满意的除杂和回收率保持效果。该方法适用于奶粉和米粉中核苷酸的检测。
本发明具有以下有益效果：
(1)本发明利用乙酸与乙醇作为共沉淀剂，应用SB-AQ柱和四丁基硫酸氢铵分离和检测核苷酸，提出了一种新的婴幼儿食品尤其是奶粉和米粉中核苷酸的检测方法，该方法可同时检测奶粉、米粉和奶米粉中的核苷酸，适合多种产品，适用范围广。
(2)本发明结果表明，5种核苷酸在10～1000mg/L范围内线性关系好，相关系数在0.9999以上，平均回收率为82.44％～98.92％，方法的相对标准偏差为0.60％～2.27％，能够满足日常检测需要。
(3)本方法有效消除了杂质对CMP的影响，获得了CMP异构化的证据，解决了其它方法无法准确测量CMP的难题。
附图说明
图1为直接应用乙酸沉淀后定容进行测试的结果。
图2为乙酸与乙醇共沉淀处理后定容进行测试的结果。
图3为应用甲醇作为奶粉和蛋白和纤维素的共沉淀剂的谱图。
图4为应用乙醇作为奶粉和蛋白和纤维素的共沉淀剂的谱图。
图5为应用乙醇作为奶粉和蛋白和纤维素的共沉淀剂的谱图。
图6为应用乙腈作为奶粉和蛋白和纤维素的共沉淀剂的谱图。
图7为应用3：1的乙醇和水作为奶粉和蛋白和纤维素的共沉淀剂的谱图。
图8为应用4：1的乙醇和水作为奶粉和蛋白和纤维素的共沉淀剂的谱图。
图9为应用5：1的乙醇和水作为奶粉和蛋白和纤维素的共沉淀剂的谱图。
图10为应用6：1的乙醇和水作为奶粉和蛋白和纤维素的共沉淀剂的谱图。
图11为应用草酸作为蛋白沉淀剂的谱图。
图12为应用盐酸作为蛋白沉淀剂的谱图。
图13为应用甲酸作为蛋白沉淀剂的谱图。
图14为应用乙酸作为蛋白沉淀剂的谱图。
图15为流动相pH为2.5时的谱图。
图16为流动相pH为2.8时的谱图。
图17为流动相pH为3.0时的谱图。
图18为流动相pH为3.6时的谱图。
图19为液相中10mmol四丁基硫酸氢胺的米粉空白的谱图。
图20为液相中1.5mmol四丁基硫酸氢胺的米粉空白的谱图。
图21为液相中10mmol四丁基硫酸氢胺的奶粉空白的谱图。
图22为液相中1.5mmol四丁基硫酸氢胺的奶粉空白的谱图。
图23为胞嘧啶核苷线性标准回归曲线。
图24为尿嘧啶核苷线性标准回归曲线。
图25为次黄嘌呤核苷线性标准回归曲线。
图26为鸟嘌呤核苷线性标准回归曲线。
图27为腺嘌呤核苷线性标准回归曲线。
图28为CMP、UMP、GMP、AMP、IMP这5种核苷酸标准物质的液相色谱图。
图29为奶粉样品空白测定5种核苷酸的液相的色谱图。
图30为奶粉样品共加标50mg/kg核苷酸的液相的色谱图(共加标50mg/kg，每种核苷酸加标10mg/kg)。
图31为奶粉样品共加标100mg/kg核苷酸的液相的色谱图(共加标100mg/kg，每种核苷酸加标20mg/kg)。
图32为奶粉样品共加标300mg/kg核苷酸的液相的色谱图(共加标300mg/kg，每种核苷酸加标60mg/kg)。
图33为米粉样品空白测定5种核苷酸的液相的色谱图。
图34为米粉样品共加标50mg/kg核苷酸的液相的色谱图(共加标50mg/kg，每种核苷酸加标10mg/kg)。
图35为米粉样品共加标100mg/kg核苷酸的液相的色谱图(共加标100mg/kg，每种核苷酸加标20mg/kg)。
图36为米粉样品共加标300mg/kg核苷酸的液相的色谱图(共加标300mg/kg，每种核苷酸加标60mg/kg)。
图37为不同柱温时AMP的出峰顺序。
图38为样品随上机前放置时间的变化。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
实施例1检测方法
1、样品前处理
称取0.5g样品于50mL聚四氟乙烯离心管中，加入10mL水溶液，用冰醋酸调节pH在4～5之间，涡旋5min后，加入40mL的乙醇溶液，蜗旋5min后10000r/min离心10min，用乙醇溶液洗涤，60℃旋干，用5～10mL水定容，取1mL过0.22μm滤膜于进样瓶中，供上机分析。
2、进行高效液相色谱检测
(1)色谱柱：SB-AQ柱。
(2)流动相：四丁基硫酸氢铵。
(3)液相色谱检测波长为254nm。
(4)柱温在60～70℃之间。
(5)样品上机时间为样品制备好之后的60～240小时，上机前样品需要冷藏保存。
另外，流动相应用在SB-AQ柱时较佳pH为2.75±0.3，流动相浓度为1.5mmol。
实施例2样品前处理方法的选择及优化
具体前处理方法影响因子的选择及优化研究如下：
1、沉淀酸的选择
将不同的酸作为蛋白沉淀剂进行比较，发现不同酸沉淀后，出现的杂质不相同(如附图11～14所示)。草酸在CMP的出峰位置有较强的干扰，盐酸次之，甲酸和乙酸的杂质的出峰时间基本一致，但是甲酸在CMP附近的杂质较多。说明应用乙酸作为沉淀剂较好。
2、乙醇和乙酸(醋酸)共沉淀的影响
如附图1和2所示，将直接应用乙酸沉淀后定容以及乙酸与乙醇共沉淀处理定容后做比较，发现前者的杂质峰面积更大，尤其是CMP附近的杂质更多，掩盖了CMP的峰并无法定量。而应用乙酸乙醇共沉淀后所有的杂质风险降低3倍以上，CMP附近的干扰峰几乎完全去除，五种核苷酸的峰面积几近完全保留，而且该沉淀剂可同时沉淀蛋白和淀粉纤维素。
因此，本发明选择乙醇和乙酸(醋酸)作为奶粉和蛋白和纤维素的共沉淀剂。
3、有机沉淀剂的选择
分别将异丙醇、乙醇、甲醇和乙腈作为有机沉淀剂进行比较，结果如附图3～6所示，结果显示，异丙醇、乙醇和乙腈都能较好的去除保留时间(rt)为2.4min的杂质，而甲醇不能；同时乙醇的回收率高于异丙醇和乙腈。
因此，本发明选择乙醇和醋酸作为奶粉和蛋白和纤维素的共沉淀剂。
实施例3测定条件的优化
1、色谱柱的选择：研究比较了SB-AQ、TC、XDB、T3、amide等C18色谱柱之后，发现SB-AQ对于核苷酸的分离以及稳定性更好，因而选用SB-AQ柱进行测定。
2、流动相的选择
在流动相中加入离子对试剂四丁基硫酸氢铵，能更好地分离5种核苷酸和杂质。不同浓度的离子对试剂对UMP、AMP和IMP的保留时间的影响在±2min以内，而对CMP和AMP的保留时间的影响在±1min以内，因而通过调整离子对试剂浓度或者其它条件进行可以有效分离五种核苷酸以及杂质。当四丁基硫酸氢铵浓度为0.6g/L的时候，5种核苷酸分离度最好，且IMP与后面的杂质分离度也很好。
因此，经过大量的比较研究，最终选择四丁基硫酸氢铵作为流动相，以下研究进一步对流动相的使用性质进行研究。
3、流动相pH的选择
将10mmol的离子对试剂调节不同的pH，发现pH对五种核苷酸的分离效果存在巨大差异(如附图15～18所示)。流动相温度在20±5℃下，在pH为2.5和3.6时，GMP和IMP两个物质无法实现分离。当pH＝3.0时GMP和IMP两个物质勉强实现分离。当pH＝2.75±0.03时五种核苷酸分离较好，说明应用SB-AQ柱时的较佳pH为2.75±0.03。
4、离子对试剂浓度的选择
分别采用pH为2.75，浓度为1.5mmol和10mmol的离子对试剂作为流动相，发现离子对试剂对杂质都有较好的分离，杂质峰基本在CMP之前、CMP至UMP、以及最后出现，对目标化合物的干扰较少(如附图19～22所示)。
但是，1.5mmol的离子对试剂对CMP的杂质分离效果更加，在该条件下，把10mmol/L浓度下无法分离的杂质完全分为两个峰，更好的实现杂质分离的目的。因而，本实验选取浓度为1.5mmol的离子对试剂作为流动相。
5、液相色谱检测波长的选择
首先测试不同的流动相条件和最佳检测波长，确定目标峰以后根据其液相色谱图选择液相目标峰最佳出峰情况液相条件方法的建立，选择最优的流动相条件和最佳检测波长，可有效去除杂质干扰。CPM的最佳吸收波长为275±5nm，UMP的最佳吸收波长为261±5nm，IMP的最佳吸收波长为249±5nm，GMP的最佳吸收波长在254±5nm和275±5nm，AMP的最佳吸收波长在257±5nm，综合考虑各种核苷酸的吸收波长，可选取254nm作为共同的吸收波长。
6、柱温的选择
柱温的变化对5种核苷酸的影响跟离子对试剂浓度的变化相类似，在柱温40～80℃之间，每隔5℃分离一次核苷酸标准品，发现AMP的峰在40℃时与GMP的峰重合，如图37所示，在80℃时与IMP的峰重合，即AMP的峰随着温度的升高从GMP的位置偏移至IMP的位置上，其中柱温在60～70℃之间分离较好。
7、样品上机时间的选择
如果样品过0.45μm滤膜过滤后马上上机，CMP出峰处会有两个非常高的杂质峰(最大吸收波长为243nm)，但随着放置时间的延长杂质会逐渐消除。实验证明样品保持在4℃冷藏的条件下，50小时之后已经检测不到243nm的杂质。样品在冷藏条件下保存，核苷酸含量一定时间内能保持稳定，核苷酸含量在样品放置了266小时内都较稳定。所以建议样品上机时间为样品制备好之后的60～240小时，上机前样品需要冷藏保存(图38)。
实施例4方法检出限、定量限、线性范围、回归方程、回收率等参数
1、定量限
本方法的定量限采用添加法进行实际测定得到，以10倍信噪比对应的浓度得出仪器的定量限为0.5mg/kg，方法的定量限需乘以稀释倍数后累加物种核苷酸浓度，本方法的稀释倍数为20倍，因而方法的定量限为10mg/kg。
2、方法的线性范围和回归方程
本方法测定的线性范围为：0.5mg/kg～50.0mg/kg，乘以稀释倍数后，每种核苷酸的线性范围是10mg/kg～1000mg/kg。线性范围覆盖定量限和关注浓度水平，线性相关系数为0.9999，具有5个数据点，并且通过平行测定3次来进行验证。线性回归方程和相关系数详见表1～表5。标准回归曲线如附图23～27所示。
表1 胞嘧啶核苷线性回归方程和相关系数表
表2 尿嘧啶核苷线性回归方程和相关系数表
表3 次黄嘌呤核苷线性回归方程和相关系数表
表4 鸟嘌呤核苷线性回归方程和相关系数表
表5 腺嘌呤核苷线性回归方程和相关系数表
3、正确度(回收率)和重复性试验
本方法通过在样品基质中加标方法测定回收率的方法来验证方法的正确度。婴幼儿配方奶粉的5种核苷酸选择2倍定量限、5倍定量限、10倍定量限三个水平进行回收率试验。每个水平重复进行3次平行单独测定，测定结果如表6和7。五种核苷的线性标准回归曲线如附图23～27所示。
结果表明，本发明方法的总体平均回收率为82.44％～98.92％，方法的相对标准偏差为0.60％～2.27％，能够满足日常检测需要。
表6 奶粉中不同添加水平的核苷酸回收率范围
表7 米粉中核苷酸不同添加水平回收率范围
4、经过测定，5种核苷酸标准物质的液相色谱图如附图28所示，图中依次为CMP、UMP、GMP、AMP、IMP。
奶粉样品空白测定以及加标后测定5种核苷酸液相的色谱图分别如附图29～32所示。
米粉样品空白测定以及加标后测定5种核苷酸液相的色谱图分别如附图33～36所示。
实施例5方法稳定性研究
另外，本发明还对该方法的稳定性进行了研究，将标准储备液放置三个月，进行期间核查，比较新旧工作曲线的响应值。
结果表明，标准储备液在三个月内稳定。
实施例6方法的应用和适用性
婴幼儿配方奶粉是非母乳喂养婴儿最重要的营养来源，婴幼儿健康成长是整个社会普遍关心的重要问题。目前在我国市场上流通的婴幼儿辅助食品主要有国内外厂家生产的营养乳粉配方食品，还包括部分国外厂家生产的以谷物类为基础的配方食品。我国婴幼儿配方奶粉市场需求巨大，但基础营养与加工技术研究起步较晚，其中婴幼儿辅助食品的种类、质量是食品科技工作者研究的一类重要课题。近年来，全球婴幼儿配方奶粉的市场需求不断增大，婴幼儿配方奶粉的世界产量在2007年至2010年间平均每年以8.2％的速度增长，从2010年到2014年平均同比增长达到11％，并且随着中国市场的极速增长，这个数字将超过20％。根据第四次国家卫生服务调查，我国每年新生婴幼儿约2000万，且自2002年以来人口出生率以1.24％增长，庞大的婴幼儿消费群体孕育了我国巨大的婴幼儿奶粉市场。同时，随着收入水平的提高，消费者对孩子的健康成长有着更高的消费意愿，有更多的需求并有能力购买更高品质的婴幼儿奶粉。我国婴幼儿配方奶粉的市场前景极好。
而核苷酸作为一类增强婴幼儿免疫功能的活性物质，经常被添加到各类配方奶粉中。核苷酸可以维持免疫系统的正常功能，提高人体对各类病菌的抵抗力。核苷酸能促进小肠成熟，改善肠道吸收功能。还可以刺激双歧杆菌生长，减少婴儿便秘、腹泻的发生。此外核苷酸还有极好的抗氧化作用，维持肝脏的正常功能。有些国家将核苷酸添加到婴儿奶粉中，发现核苷酸能加强对免疫的反应并降低腹泻的发生。虽然足月婴儿的临床实验显示这样的补充对婴儿增长没有明显益处，但对于低出生体重婴儿，关于补充核苷酸后的体重、身高、头围的改进己有报道。但是我国还没有关于婴幼儿食品、乳品中关于核苷酸检测的国家标准。
本标准采用液相色谱法对婴幼儿配方奶粉中的核苷进行测定。为了验证方法的适用性，使用本方法对通过进口法检委托的18个婴幼儿配方奶粉样品和17个婴幼儿配方米粉进行了检测。
婴幼儿配方奶粉实际样品的信息表和检测结果如表8所示。
表8 婴幼儿配方奶粉和米粉实际样品信息与测定结果

Claims (1)

1.一种食品中核苷酸的高效液相色谱检测法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.样品前处理：称取待测样品，加入水，用乙酸调节pH至4～5，涡旋5~10min后，加入乙醇溶液，蜗旋5~10min后8000~12000r/min离心5~15min，用乙醇溶液洗涤，55~70℃旋干，用水定容，取0.5~2mL过0.22μm滤膜于进样瓶中，供上机分析；
S2.进行高效液相色谱检测，所述高效液相色谱检测的色谱条件为：色谱柱为SB-AQ柱，流动相为四丁基硫酸氢铵，流动相pH为2.75±0.3，流动相浓度为l.5mmol，液相色谱检测波长为254nm，柱温在60～70℃之间，样品上机时间为样品制备好之后的60～240小时，上机前样品需要冷藏保存；
其中，所述食品为奶粉、米粉和/或奶米粉。
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