CN104515817B - 蛋白产品中游离核酸水解物的测定方法及生产工艺对核苷酸破坏程度的评价方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蛋白产品中游离核酸水解物的测定方法，采用以下步骤：(1)分别制备核苷酸混合标准液及碱基混合标准液，(2)配制待测样品的溶液，以步骤1所述的核苷酸混合标准液及碱基混合标准液作为参照液，采用高效液相色谱法通过洗出峰面积比较得到样品中游离核苷酸及游离碱基的含量值。本发明开发出使用高效液相色谱测定单细胞蛋白原料中5种碱基(胞嘧啶、尿嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤)，5种核苷酸(胞苷酸、尿苷酸、鸟苷酸、肌苷酸、腺苷酸)，5种核苷(胞苷、尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷)。然后根据碱基与核苷酸、核苷之间的关系判断生产工艺对核苷酸的破坏程度。

Description

蛋白产品中游离核酸水解物的测定方法及生产工艺对核苷酸 破坏程度的评价方法

技术领域

本发明属于核酸水解物测定技术领域，尤其属于单细胞蛋白生产质量控制领域。

背景技术

单细胞蛋白(Single cell protein简称SCP)又称微生物蛋白或菌体蛋白，是利用工业废水、废气、天然气、石油烷烃类、农副加工产品以及有机垃圾等作为培养基，培养酵母、非病源性细菌、微型菌、真菌等单细胞生物体，然后经过净化干燥处理后制成，是食品工业和饲料工业重要的蛋白质来源。

单细胞蛋白产品含有丰富的核苷酸，市场上酵母类的产品是饲料工业主要的核苷酸提供者。由于工艺特点的原因，自溶酵母、酶解酵母、水解酵母等产品含有较多游离态的核酸水解物，研究发现现有很多酵母产品既含有游离核苷酸，也含有较高含量的碱基。游离核苷酸能被动物快速吸收，发挥重要生理功能，碱基则会对动物肝脏肾脏造成不良影响。碱基含量过多意味着生产过程当中有重要营养价值的核苷酸被酶解、水解或微生物代谢。这会造成酵母产品的质量下降，提供的核苷酸含量降低，进而能为动物提供免疫功能的作用减少，同时增加的碱基如腺嘌呤则会对动物造成毒性。

判断单细胞蛋白的生产工艺对核苷酸的破坏程度，开发既能反应工艺条件的优劣又能为产品质量控制提供科学的、反映营养价值的评估方法就变得极为重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种测定单细胞蛋白中游离核酸含量的方法。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：蛋白产品中游离核酸水解物的测定方法，其特征在于采用以下步骤：

(1)分别制备核苷酸混合标准液及碱基混合标准液，

(2)配制待测样品的溶液，以步骤1所述的核苷酸混合标准液及碱基混合标准液作为参照液，采用高效液相色谱法通过洗出峰面积比较得到样品中游离核苷酸及游离碱基的含量值。

所述核苷酸混合标准液是通过分别量取尿苷酸标准储备液2.0ml、腺苷酸标准储备液2.0ml、鸟苷酸二钠标准储备液2.0ml、胞苷酸标准储备液2.0ml、肌苷酸标准储备液2.0ml、鸟苷标准储备液1.0ml、腺苷标准储备液1.0ml、尿苷标准储备液1.0ml、肌苷标准储备液1.0ml、胞苷标准储备液1.0ml至100ml容量瓶内，加水定容至100ml，

所述尿苷酸标准储备液、腺苷酸标准储备液、鸟苷酸二钠标准储备液、胞苷酸标准储备液、肌苷酸标准储备液、鸟苷标准储备液、腺苷标准储备液、尿苷标准储备液、肌苷标准储备液和胞苷标准储备液单独配制且浓度分别为0.8～1.2mg/ml。

所述碱基混合标准液是通过分别量取胞嘧啶标准储备液1.0ml、尿嘧啶标准储备液1.0ml、鸟嘌呤标准储备液10.0ml、胸腺嘧啶标准储备液1.0ml、腺嘌呤标准储备液1.0ml至250ml容量瓶内，加水定容至250ml，

其中，胞嘧啶标准储备液浓度为3.0～5.0mg/ml；尿嘧啶标准储备液浓度为3.0～5.0mg/ml；鸟嘌呤标准储备液浓度为0.3～0.5mg/ml；胸腺嘧啶标准储备液浓度为3.0～5.0mg/ml；腺嘌呤标准储备液浓度为3.0～5.0mg/ml。

所述步骤2中配制待测样品的溶液的操作包括：称取0.1000克粉碎细度达60目的样品于玻璃管内，加水15ml，漩涡震荡3次，每次1min，每次间隔20min；超声20min，并再次漩涡震荡；12000g高速离心15min；取上清液稀释一倍，混匀后保存过滤上机测定。

所述步骤2中的高效液相色谱法采用流动相A为0.1M的磷酸二氢钾溶液，流动相B为质量含量为25％的甲醇溶液。

所述步骤2中的高效液相色谱法采用如下梯度洗脱程度：

本发明的另一目的在于提供一种既反映产品生产工艺优劣又体现产品营养价值的质量控制指标的方法。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

生产工艺对核苷酸破坏程度的评价方法，其特征在于包括如下步骤：

设定K_A值及K值，其中，

总游离碱基是游离胞嘧啶、游离尿嘧啶、游离鸟嘧啶、游离胸腺嘧啶和游离腺嘌呤的总和；总游离核苷是游离鸟苷、游离腺苷、游离尿苷、游离肌苷、游离胞苷的总和；总游离核苷酸是游离尿苷酸、游离腺苷酸、游离鸟苷酸二钠、游离胞苷酸、游离肌苷酸的总和；

按下表以K_A及K值共同评价蛋白产品的质量及生产工艺，

上述游离核苷酸、游离核苷及游离碱基的含量通过前述的方法测定且计算得到。

本发明开发出使用高效液相色谱测定单细胞蛋白原料中5种碱基(胞嘧啶、尿嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤)，5种核苷酸(胞苷酸、尿苷酸、鸟苷酸、肌苷酸、腺苷酸)，5种核苷(胞苷、尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷)。然后根据碱基与核苷酸、核苷之间的关系判断生产工艺对核苷酸的破坏程度。

附图说明

图1是核苷酸及核苷标准品色谱图。

图2是碱基标准品色谱图。

具体实施方式

以下为本发明的实施步骤：

1 试剂和溶液

1.1 除非另有说明，本法所用试剂均为分析纯，水为去离子水，符合GB/T 6682二级水的规定。

1.2 磷酸二氢钾:分析纯。

1.3 氢氧化钾:分析纯。

1.4 甲醇:色谱纯。

1.5 乙腈:色谱纯。

1.6 20％w/v氢氧化钾溶液：称取氢氧化钾100克，溶解于500ml水中，保存于容量瓶内。

1.7 流动相A：0.1M磷酸二氢钾溶液，称取磷酸二氢钾27.2克，溶解于1000ml水中，添加20％氢氧化钾溶液1.0ml，加水定容至2升。0.45um水系滤膜过滤后备用。

1.8 流动相B：25％甲醇溶液，量取甲醇250ml溶解于750ml水中，搅拌混匀后0.45um有机系滤膜过滤后备用。

1.9 腺苷酸AMP：sigma#A2252。

1.10 胞苷酸CMP：sigma#C1131。

1.11 肌苷酸IMP：sigma#I2897。

1.12 鸟苷酸二钠GMP：sigma#G8377。

1.13 尿苷酸UMP：sigma#U1752。

1.14 腺苷Adenosine：sigma#A9251。

1.15 胞苷Cytidine：sigma#C122106。

1.16 鸟苷Guanosine：sigma#V900311。

1.17 肌苷Inosine：sigma#I4125。

1.18 尿苷Uridine：sigma#V900421。

1.19 制备腺苷酸标准储备液：称取腺苷酸AMP[sigma#A2252]0.1024克，加水定容至100ml，浓度为1.0240mg/ml

1.20 制备胞苷酸标准储备液：称取胞苷酸CMP[sigma#C1131]0.1001克，加水定容至100ml，浓度为1.0010mg/ml。

1.21 制备肌苷酸标准储备液：称取肌苷酸IMP[sigma#I2897]0.1021克，加水定容至100ml，浓度为1.0210mg/ml。

1.22 制备鸟苷酸标准储备液：称取鸟苷酸二钠GMP[sigma#G8377]0.0992克，加水定容至100ml，鸟苷酸二钠浓度为0.9920mg/ml。。

1.23 制备尿苷酸标准储备液：称取尿苷酸UMP[sigma#U1752]0.1000克，加水定容至100ml，浓度为1.0000mg/ml。

1.24 制备腺苷标准储备液：称取腺苷Adenosine[sigma#A9251]0.1214克，加水定容至100ml，浓度为1.2140mg/ml。

1.25 制备胞苷标准储备液：称取胞苷Cytidine[sigma#C122106]0.1041克，加水定容至100ml，浓度为1.041mg/ml。

1.26 制备鸟苷标准储备液：称取尿苷Guanosine[sigma#V900311]0.2598克，加水定容至250ml，浓度为1.0392mg/ml。

1.27 制备肌苷标准储备液：称取肌苷Inosine[sigma#I4125]0.1093克，加水定容至100ml，浓度为1.0930mg/ml。

1.28 制备尿苷标准储备液：称取尿苷Uridine[sigma#V900421]0.2577克，加水定容至100ml，浓度为1.0308mg/ml。

1.29 制备核苷酸混合标准液：依次量取尿苷酸、腺苷酸、鸟苷酸二钠、胞苷酸、肌苷酸、鸟苷、腺苷、尿苷、肌苷、胞苷标准储备液2.0ml、2.0ml、2.0ml、2.0ml、2.0ml、1.0ml、1.0ml、1.0ml、1.0ml、1.0ml至100ml容量瓶内，加水定容至100ml，混合标准液中尿苷酸、腺苷酸、鸟苷酸、胞苷酸、肌苷酸、鸟苷、腺苷、尿苷、肌苷、胞苷的浓度分别为20.000ug/ml、20.480ug/ml、17.700ug/ml、20.020ug/ml、20.420ug/ml、10.392ug/ml、12.140ug/ml、10.308ug/ml、10.930ug/ml、10.410ug/ml分装至0.5ml冻存管内，-20℃保存，有效期一年。

1.30 胞嘧啶Cytosine：sigma#V900462。

1.31 尿嘧啶Uracil：sigma#V900439。

1.32 鸟嘌呤Guanine：sigma#V900473。

1.33 胸腺嘧啶Thymine：sigma#V900437。

1.34 腺嘌呤Adenine：sigma#V900471。

1.35 制备胞嘧啶标准储备液：称取胞嘧啶1.0044克，加水定容至250ml，70℃热水浴加热溶解。

1.36 制备尿嘧啶标准储备液：称取尿嘧啶0.9976克，加水定容至250ml，70℃热水浴加热溶解。

1.37 制备鸟嘌呤标准储备液：称取鸟嘌呤0.1000克，加0.1M氢氧化钠溶液150～180ml，全部溶解后加水定容至250ml。

1.38 制备胸腺嘧啶标准储备液：称取胸腺嘧啶1.0133克，加水定容至250ml，70℃热水浴加热溶解。

1.39 制备腺嘌呤标准储备液：称取腺嘌呤1.0171克，加水定容至250ml，70℃热水浴加热溶解。

1.41 制备碱基混合标准液：依次量取胞嘧啶、尿嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤标准储备液1.0ml、1.0ml、10.0ml、1.0ml、1.0ml至250ml容量瓶内，加水定容至250ml，混合标准液中胞嘧啶、尿嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤的浓度分别为16.07ug/ml、15.99ug/ml、19.55ug/ml、16.21ug/ml、16.27ug/ml。分装至0.5ml冻存管内，-20℃保存，有效期一年。

2 仪器与设备

2.1 岛津LC-20AD高效液相色谱仪系统(梯度洗脱、紫外检测、可控柱温)。

2.2 色谱柱：Athena C18，4.6×150mm。

2.3 分析天平。

2.4 离心机。

2.5 超声清洗器。

2.6 1mL一次性注射器。

2.7 0.45um一次性水相过滤器。

2.8 0.5ml离心管。

2.9 100ml容量瓶。

2.10 250ml容量瓶。

2.11 40ml带盖螺盖玻璃管。

2.12 1000ul移液器。

2.13 5000ul移液器。

2.14 15mL塑料离心管。

3 测定步骤

3.1 样品处理

(1)称取0.1000克样品至于40ml玻璃管内。(每个待测样品重复取样至少两组。)

(2)加水15ml(溶解体积，V)，漩涡震荡3次，每次1min，每次间隔20min。

(3)震荡后超声20min。再次漩涡震荡。

(4)从玻璃管内取试液3ml至5ml离心管内。12000g高速离心15min。

(5)取上清液2ml至5ml离心管内，加水2ml，稀释一倍。混匀后保存过滤上机测定。

3.2 用高效液相色谱法对样品进行测定，采用以下色谱条件：

环境温度：25℃～30℃，清洁度要求：无杂物、异味等

色谱柱:Athena C18，4.6×150mm。

检测波长:260nm。

柱温:30℃。

流动相A:0.1mol/L磷酸二氢钾溶液。

流动相B:25％甲醇

进样量:20ul

流速:0.5mL/min

(注：分析结束后使用100％乙腈溶液清洗色谱柱后储存)

洗脱程序如下表1：

表1

色谱条件的优点：

流动相可以通用测定所有碱基、核苷酸和核苷，提高测定效率。

能够完全分离5种核苷酸、5种核苷、5种碱基。确保了测定游离态核苷酸水解物的定量准确。

3.3 采用相同的色谱条件对碱基混合标准液及核苷酸混合标准液分别进行HPLC的检测操作。

如图1及图2所示，上述步骤能将这几种游离的核苷酸、核酸及碱基很好的分离。

4 结果计算

使用外标法测定出样品中游离碱基、核苷酸、核苷的含量。

试样中碱基、核苷、核苷酸含量ω,以质量分数标识，数值以％表示，按公式计算：

$C=\frac{A}{A_{\mathrm{st}}}\×C_{\mathrm{st}}\·\·\·\left(1\right)$

${\mathrm{\ω}}_x=\frac{C\×V\×2}{m\×1000\×1000}\×100\·\·\·\left(2\right)$

式中：

A——样品核苷酸、核苷或碱基的色谱峰面积

A_st——标准品的色谱峰面积

C_st——标准品的浓度

x——某一核苷酸、或核苷，或碱基

C——核苷酸浓度ug/ml；

V——溶解体积ml；

m——样品重量(g)；

ωx——含量％；

测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留2位有效数字。

例如本例中，计算得到游离腺嘌呤的ω的值是0.32％。

5 精密度

重复以上检测，使获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10％。

6 根据检测结果计算K_A值、K值，并以此作为衡量产品营养价值、新鲜程度、核苷酸破坏程度的指标。

其中，游离腺嘌呤取自以上步骤4所计算得到的腺嘌呤的数值，

游离腺苷取自以上步骤4所计算得到的腺苷的数值。游离腺苷酸取自以上步骤4所得到的腺苷酸的数值。

其中，总游离碱基是以上步骤4所计算得到的胞嘧啶、尿嘧啶、鸟嘧啶、胸腺嘧啶和腺嘌呤的总和。

总游离核苷是以上步骤4所计算得到的鸟苷、腺苷、尿苷、肌苷、胞苷的总和。

总游离核苷酸是以上步骤4所计算得到的尿苷酸、腺苷酸、鸟苷酸二钠、胞苷酸、肌苷酸的总和。

K_A值是以腺苷酸代谢物质的比例为参考，查看腺苷酸最终代谢产物腺嘌呤与游离腺苷及腺苷酸的比值。比值越高，说明生产过程酶解/水解条件越剧烈、破坏的核苷酸越多。选用腺苷酸作为比值的原因是：1)单磷酸腺苷、三磷酸腺苷、腺苷具有重要的营养价值，是辅酶Q10的组成成分；2)腺嘌呤则对肝肾造成负担；3)是有毒物质。

K值是将5种游离碱基的总和与5种游离核苷、5种游离核苷酸的总和相除所得数值。该比值反应整体核苷酸水解物的代谢程度、破坏程度。比值越高，说明生产过程酶解/水解条件越剧烈、破坏的核苷酸越多。

K值能够反应大部分的单细胞蛋白的核苷酸破坏程度，但是产品中如果添加呈味核苷酸的副产物会导致指标失真，因为添加了较多的呈味核苷(肌苷酸、尿苷酸)。再通过K_A值去除呈味核苷的影响。

按下表2以K_A及K值共同评价蛋白产品的质量及生产工艺，

表2

使用该比值可以比较不同厂家的水解酵母、自溶酵母的生产工艺的先进程度。能够反映出，部分自溶酵母类产品的K、K_A值较高。

发现部分酵母产品添加了呈味核苷酸的生产副产物，游离的核苷酸以呈味核苷为主。但是通过K_A指标则能真实反应其生产工艺的优劣。

该指标发现生产过程如果不存在水解、酶解工序，其K值、KA值比值为零。说明能够提供优质的核苷酸供动物使用。

Claims (4)

1.蛋白产品中游离核酸水解物的测定方法，其特征在于采用以下步骤：

(1)分别制备核苷酸混合标准液及碱基混合标准液，

(2)配制待测样品的溶液，以步骤1所述的核苷酸混合标准液及碱基混合标准液作为参照液，采用高效液相色谱法通过洗出峰面积比较得到样品中游离核苷酸及游离碱基的含量值，高效液相色谱法采用流动相A为0.1M的磷酸二氢钾溶液，流动相B为质量含量为25％的甲醇溶液，并采用如下梯度洗脱：

2.根据权利要求1所述的蛋白产品中游离核酸水解物的测定方法，其特征在于：所述核苷酸混合标准液是通过分别量取尿苷酸标准储备液2.0ml、腺苷酸标准储备液2.0ml、鸟苷酸二钠标准储备液2.0ml、胞苷酸标准储备液2.0ml、肌苷酸标准储备液2.0ml、鸟苷标准储备液1.0ml、腺苷标准储备液1.0ml、尿苷标准储备液1.0ml、肌苷标准储备液1.0ml、胞苷标准储备液1.0ml至100ml容量瓶内，加水定容至100ml，

所述尿苷酸标准储备液、腺苷酸标准储备液、鸟苷酸二钠标准储备液、胞苷酸标准储备液、肌苷酸标准储备液、鸟苷标准储备液、腺苷标准储备液、尿苷标准储备液、肌苷标准储备液和胞苷标准储备液单独配制且浓度分别为0.8～1.2mg/ml。

3.根据权利要求1所述的蛋白产品中游离核酸水解物的测定方法，其特征在于：所述碱基混合标准液是通过分别量取胞嘧啶标准储备液1.0ml、尿嘧啶标准储备液1.0ml、鸟嘌呤标准储备液10.0ml、胸腺嘧啶标准储备液1.0ml、腺嘌呤标准储备液1.0ml至250ml容量瓶内，加水定容至250ml，

其中，胞嘧啶标准储备液浓度为3.0～5.0mg/ml；尿嘧啶标准储备液浓度为3.0～5.0mg/ml；鸟嘌呤标准储备液浓度为0.3～0.5mg/ml；胸腺嘧啶标准储备液浓度为3.0～5.0mg/ml；腺嘌呤标准储备液浓度为3.0～5.0mg/ml。

4.根据权利要求1所述的蛋白产品中游离核酸水解物的测定方法，其特征在于所述步骤2中配制待测样品的溶液的操作包括：称取0.1000克粉碎细度达60目的样品于玻璃管内，加水15ml，漩涡震荡3次，每次1min，每次间隔20min；超声20min，并再次漩涡震荡；12000g高速离心15min；取上清液稀释一倍，混匀后保存过滤上机测定。