IT202100013796A1 - Procedimento per determinare glifosato e acido aminometilfosfonico in un campione - Google Patents
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Description
Descrizione dell?invenzione industriale dal titolo:
?Procedimento per determinare glifosato e acido aminometilfosfonico in un campione?
TESTO DELLA DESCRIZIONE
Campo dell?invenzione
La presente descrizione riguarda un nuovo procedimento per determinare glifosato e acido aminometilfosfonico (AMPA) in campioni organici e inorganici e un relativo kit.
Tecnica di sfondo
La N-(fosfonometil)glicina (glifosato o GLYP) ? stata sintetizzata per la prima volta nel 1974 e selezionata come erbicida per la distribuzione commerciale per l?inibizione selettiva delle vie dello shikimato, una via enzimatica fondamentale che supporta la crescita delle piante. Considerato sicuro in termini di impatto ambientale ed effetti tossici sugli animali, con bassi costi di produzione ed elevata domanda di mercato, il GLYP ha rapidamente raggiunto una diffusione mondiale per usi agricoli estensivi ed ? stato l?erbicida pi? adottato negli ultimi 40 anni. Il GLYP viene trasformato in acido aminometilfosfonico (AMPA) dalle piante e nel suolo mediante deaminazione ossidativa e ulteriore degradazione ad acido 2-metilfosfinicoacetico.
Fin dalla prima introduzione sul mercato, gli effetti del GLYP sulle piante sono stati ampiamente studiati portando allo sviluppo di colture geneticamente modificate, tolleranti all?azione dell?erbicida.
Fatta eccezione per l?esposizione professionale ad alti livelli di erbicidi a base di glifosato, non ci sono state segnalazioni iniziali di tossicit? nell?uomo. A differenza di funghi, piante, alghe e batteri, gli animali reperiscono gli amminoacidi aromatici derivati dallo shikimato attraverso la loro dieta e sono privi dell?enzima bersaglio. Tuttavia, gli effetti dimostrati sul microbiota possono indirettamente spiegare gli esiti deleteri sui processi fisiologici dei mammiferi [Front. Behav. Neurosci. (2017), 11:146]. La letteratura scientifica sugli effetti biologici del GLYP sugli esseri umani ? ancora controversa e manca ancora il consenso tra i gruppi di ricerca e le agenzie di certificazione. In questo contesto, stabilire un modo coerente e trasversale per estrarre, determinare e quantificare GLYP e AMPA in campioni biologici, ? di fondamentale importanza per affrontare le potenziali caratteristiche farmacodinamiche e farmacocinetiche delle due molecole, ancora da descrivere. Coerentemente, non ci sono bersagli molecolari identificati per il glifosato nelle cellule di mammifero, n? alcun meccanismo di tossicit? ? stato esaurientemente dimostrato.
A met? degli anni ?80, sono stati fatti diversi tentativi di quantificare GLYP e AMPA data la frequenza degli episodi di suicidio avvenuti con l?ingestione di formulazioni a base di glifosato. La maggior parte delle procedure descritte per determinare le concentrazioni, tuttavia, sono estremamente complicate, richiedono tempo e non forniscono una quantificazione accettabile [Jpn. J. Legal Med., (1988), 42:128].
I primi tentativi attendibili di quantificare i residui di GLYP e AMPA in una matrice biologica, sono quasi simultanei e provengono da due laboratori universitari giapponesi. Nonostante i primi sviluppi (1991), questi studi descrivono un procedimento per la determinazione di GLYP e AMPA mediante l?utilizzo di derivati tosilati [J. Chromatogr. (1991), 566(1):239-43; J. Chromatogr. (1991), 571(1-2):324-330], ma non ? stata eseguita alcuna estrazione da matrici biologiche e l?analisi ? stata fornita solo per gli standard. Gli autori riportano una procedura per la quantificazione simultanea di GLYP e AMPA mediante cloruro di p-toluensolfonile in soluzione alcalina, ma la procedura richiede tempo e non ? precisa.
In alcuni casi, i tentativi dei ricercatori di quantificare GLYP e AMPA nel siero hanno mostrato una forte interferenza da parte dei componenti della matrice, che hanno influenzato il tempo di ritenzione e i cromatogrammi [Journal of Chromatography 566 (1991) 239-243]. In altri studi, sebbene limitato a campioni di terreno, FMOC ? stato utilizzato per derivatizzare GLYP portando alla formazione di un addotto assorbente nella gamma UV [J. Chem. Educ. 95(1) (2018) 136?140].
Nonostante negli ultimi anni siano stati sviluppati molti procedimenti per la rivelazione di GLYP e AMPA, ? ancora necessario un procedimento che consenta una quantificazione facile e affidabile di GLYP e AMPA in un campione.
Sintesi dell?invenzione
Lo scopo della presente divulgazione ? quello di fornire un nuovo procedimento per la determinazione con elevata precisione della presenza o quantit? di GLYP e AMPA in un campione organico o inorganico, che superi gli inconvenienti dei procedimenti noti.
Secondo l?invenzione, tale scopo viene raggiunto grazie all?oggetto richiamato in modo specifico nelle rivendicazioni che seguono, che si intendono parte integrante della presente divulgazione.
In una forma di realizzazione, la presente invenzione riguarda un procedimento per determinare la presenza o la quantit? di glifosato e acido aminometilfosfonico in un campione organico o inorganico, il procedimento comprendendo le seguenti fasi:
i) miscelare il campione sospettato di contenere glifosato e acido aminometilfosfonico con una soluzione di tosilcloruro ottenendo una prima soluzione;
(ii) incubare la prima soluzione, ottenendo cos? glifosato tosilato e acido aminometilfosfonico tosilato;
(iii) estrarre glifosato tosilato e acido aminometilfosfonico tosilato dalla prima soluzione, mediante (a) miscelazione della prima soluzione con un solvente aprotico organico avente una costante dielettrica inferiore a 10, (b) centrifugazione e (c) raccolta di un surnatante;
(iv) essiccare il surnatante;
(v) ricostituire il surnatante in acetonitrile, ottenendo un surnatante ricostituito;
(vi) separare cromatograficamente il glifosato tosilato e l?acido aminometilfosfonico tosilato da altri costituenti nel surnatante ricostituito mediante una colonna di cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC);
(vii) rivelare mediante uno spettrometro UV il glifosato tosilato e l?acido aminometilfosfonico tosilato separati cromatograficamente per determinare la presenza o la quantit? di glifosato e acido aminometilfosfonico contenuti nel campione.
In una forma di realizzazione, la presente invenzione riguarda un kit per eseguire il procedimento di determinazione della presenza o quantit? di glifosato e acido aminometilfosfonico in un campione come qui descritto, in cui il kit comprende una colonna di fase inversa per cromatografia liquida ad alte prestazioni, un flacone contenente una soluzione di tosilcloruro, flaconi contenenti soluzioni standard di glifosato tosilato e acido aminometilfosfonico tosilato e un manuale di istruzioni.
Breve descrizione dei disegni
L?invenzione verr? ora descritta in dettaglio, a puro titolo di esempio illustrativo e non limitativo e, con riferimento ai disegni allegati, in cui:
- Figura 1: Rappresentazione grafica del procedimento per determinare la presenza o la quantit? di glifosato e acido aminometilfosfonico come divulgato nella presente domanda: (1) miscelazione del campione con soluzione di tosilcloruro in acetonitrile; (2) incubazione della soluzione; (3) estrazione, con un solvente aprotico organico, del glifosato tosilato e dell?AMPA tosilato e successivo lavaggio della fase inferiore con un solvente di lavaggio; (4) centrifugazione, raccolta del surnatante ed essiccamento; (5) ricostituzione del surnatante essiccato con una fase mobile per l?analisi HPLC-UV; (6) Analisi HPLC-UV.
- Figura 2: cromatogrammi rappresentativi delle curve di calibrazione: Soluzioni Standard con concentrazione crescente di glifosato e AMPA (5, 10, 20 ppm). Il primo picco si riferisce all?AMPA (RT = 3,16 min) mentre il secondo picco ? relativo al Glifosato (RT = 5,08 min). I picchi minori sono dovuti al rumore di fondo del solvente.
- Figura 3: Andamento temporale della degradazione del glifosato ad AMPA. AMPA e Glifosato in Terreno di Coltura Cellulare dopo 90 min di incubazione con soluzione addizionata a 100 mg/ml di Glifosato (linea punteggiata); AMPA e Glifosato in cellule lisate dopo 90 min di incubazione con soluzione addizionata a 100 mg/ml di Glifosato in terreno di coltura cellulare (linea tratteggiata).
Descrizione dettagliata dell?invenzione
Nella descrizione che segue, vengono forniti numerosi dettagli specifici per fornire una comprensione completa delle forme di realizzazione dell?invenzione. Le forme di realizzazione possono essere messe in pratica senza uno o pi? dei dettagli specifici, o con altri procedimenti, componenti, materiali, ecc. In altri casi, strutture, materiali o operazioni ben noti non sono mostrati o descritti in dettaglio per evitare di confondere aspetti della realizzazione.
Il riferimento in tutta la presente descrizione a ?una sola forma di realizzazione? o ?una forma di realizzazione? indica che un/una particolare aspetto, struttura o caratteristica descritto/descritta in relazione alla forma di realizzazione ? incluso/inclusa in almeno una forma di realizzazione. Pertanto, le forme delle espressioni ?in una sola forma di realizzazione? o ?in una forma di realizzazione? presenti in vari punti della presente descrizione non si riferiscono necessariamente alla stessa forma di realizzazione. Inoltre, i/le particolari aspetti, strutture o caratteristiche possono essere combinati/combinate in qualsiasi modo adatto in una o pi? forme di realizzazione.
Le intestazioni qui fornite servono solo per comodit? e non interpretano l?ambito o lo scopo delle forme di realizzazione.
Gli erbicidi a base di GLYP sono stati ampiamente utilizzati in tutto il mondo negli ultimi 40 anni e siamo di fronte a un?esposizione continua a livelli indeterminati di GLYP e AMPA a causa dei residui in acqua, suolo, frutta e cibo in generale. Gli effetti sulla salute umana e animale di GLYP e AMPA sono ancora profondamente controversi. Tuttavia, il progresso della ricerca sui potenziali esiti deleteri deve essere supportato da una quantificazione precisa di GLYP e AMPA in campioni come fluidi biologici, campioni cellulari e tissutali, campioni di lavorazione degli alimenti, tra gli altri. Ad oggi non esiste un protocollo trasversale in grado di unificare le procedure di quantificazione da adottare da parte di R&D, controllo qualit?, Universit? e altri laboratori istituzionali.
Il procedimento qui descritto mira a unificare i protocolli per determinare GLYP e AMPA in diversi campioni organici e inorganici, preferibilmente campioni biologici, fornendo un kit per la derivatizzazione e l?analisi con cromatografia UV. Il kit sviluppato rappresenta una risorsa pratica per applicazioni sperimentali, mediche, di controllo qualit?, alimentari e molte altre. Ad oggi, infatti, la maggior parte dei laboratori dotati di LC-MS/MS o HPLC-RF possono eseguire la determinazione di GLYP e AMPA con costi elevati e bassa riproducibilit?. Il presente procedimento consentir? ad ogni laboratorio dotato di un sistema HPLC-UV di estrarre e quantificare le due molecole da qualsiasi campione (organico o inorganico) con alta riproducibilit?, ampliando l?accesso ai dati sulle concentrazioni di GLYP e AMPA.
In una forma di realizzazione, la presente invenzione riguarda un procedimento per determinare la presenza o la quantit? di glifosato e acido aminometilfosfonico in un campione organico o inorganico; il procedimento comprendendo le seguenti fasi:
(i) aggiunta al campione, sospettato di contenere glifosato e acido aminometilfosfonico, di una soluzione di tosilcloruro ottenendo una prima soluzione;
(ii) incubazione della prima soluzione, ottenendo cos? glifosato tosilato e acido aminometilfosfonico tosilato;
(iii) estrazione di glifosato tosilato e acido aminometilfosfonico tosilato dalla prima soluzione, mediante (a) miscelazione della prima soluzione con un solvente aprotico organico avente una costante dielettrica inferiore a 10, (b) centrifugazione e (c) raccolta di un surnatante;
(iv) essiccamento del surnatante;
(v) ricostituzione del surnatante in acetonitrile, ottenendo un surnatante ricostituito;
(vi) separazione cromatografica del glifosato tosilato e dell?acido aminometilfosfonico tosilato da altri costituenti nel surnatante ricostituito, mediante una colonna di cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC);
(vii) rivelazione mediante uno spettrometro UV del glifosato tosilato e dell?acido aminometilfosfonico tosilato separati cromatograficamente, per determinare la presenza o la quantit? di glifosato e acido aminometilfosfonico contenuti nel campione.
Il procedimento oggetto della presente domanda ? rappresentato graficamente in Figura 1.
In una forma di realizzazione, la soluzione di tosilcloruro comprende tosilcloruro e acetonitrile (100%), in cui il tosilcloruro ? presente in una concentrazione di 30,0-60,0 mM, preferibilmente 50,0 mM.
In una forma di realizzazione, nella fase (i) il campione viene miscelato con la soluzione di tosilcloruro e un tampone. In una forma di realizzazione, il tampone ha un pH compreso tra 10,0 e 12,0, preferibilmente il pH ? 11,0. In una forma di realizzazione, il tampone ? selezionato tra tampone fosfato, bicarbonato, formiato e acetato.
In una forma di realizzazione, l?incubazione della fase (ii) viene eseguita a una temperatura di 40-60?C, preferibilmente a 50?C. L?incubazione viene condotta per un periodo di 2-10 min., preferibilmente 5 min. L?incubazione viene effettuata preferibilmente in un bagno d?acqua termostaticamente controllato.
Durante l?incubazione, GLYP e AMPA reagiscono con il tosilcloruro generando GLYP tosilato e AMPA tosilato come mostrato di seguito nello schema 1, in cui il pannello A si riferisce a GLYP e il pannello B si riferisce ad AMPA.
I derivati tosilati di GLYP e AMPA sono estremamente utili durante le reazioni analitiche perch? vengono estratti facilmente dal campione (sia organico che inorganico) secondo il procedimento qui descritto (ovvero la fase (iii)), consentendo una facile determinazione mediante spettrometria
UV.
Schema 1
In una forma di realizzazione, il solvente aprotico organico utilizzato nell?estrazione della fase (iii) ha un valore di costante dielettrica (?r) compreso tra 2,0 e 6,0. In una forma di realizzazione, il solvente aprotico organico contiene almeno un atomo di ossigeno, che consente, grazie alle sue forze dipolo-dipolo, deboli interazioni molecolari tra le molecole di solvente e GLYP e AMPA. In una forma di realizzazione, il solvente aprotico organico ? scelto tra acetato di etile, alcol isobutilico, diclorometano, etere etilico, solfuro di metile, etere propilico, alcol isopropilico, toluene, cloroformio, preferibilmente acetato di etile.
In una forma di realizzazione, l?estrazione della fase (iii) viene ripetuta due volte.
In una forma di realizzazione, nella fase (iii) la centrifugazione viene effettuata ad una temperatura di 2-10?C, preferibilmente a 5?C. In una forma di realizzazione, la centrifugazione viene effettuata per un periodo di tempo di 2-10 min, preferibilmente 5 min.
In una forma di realizzazione, l?essiccamento del surnatante della fase (iv) viene eseguito in un concentratore refrigerato sotto vuoto.
In una forma di realizzazione, nella fase (v) la soluzione ricostituente contiene acetonitrile e acqua in un rapporto in volume compreso tra 50:50 volume/volume e 75:25 volume/volume. In una forma di realizzazione, la soluzione ricostituente contiene inoltre un tampone. In una forma di realizzazione, il tampone ha un pH compreso tra 2,0 e 5,0, preferibilmente il pH ? 2,5. Preferibilmente, il tampone ? scelto tra formiato, acetato, fosfato, citrato, trifluoroacetato, propionato.
In una forma di realizzazione, nella fase (v) il surnatante ricostituito viene lavato con un solvente di lavaggio in grado di creare un azeotropo con il solvente aprotico organico utilizzato nella fase (iii) per rimuovere i residui di acqua prima di procedere alla fase (vi). In una forma di realizzazione, il solvente di lavaggio ? scelto tra toluene, acetato di etile, etanolo, benzene, metanolo. Ad esempio, se il solvente aprotico organico utilizzato nella fase (iii) ? acetato di etile, il solvente di lavaggio ? il toluene.
In una forma di realizzazione, la separazione cromatografica della fase (vi) viene eseguita utilizzando una colonna a fase inversa, preferibilmente una colonna C18, e una fase mobile. In una forma di realizzazione, la fase mobile comprende acqua e acetonitrile in rapporti in volume compresi tra 90:10 volume/volume e 50:50 volume/volume. In una forma di realizzazione, la fase mobile contiene inoltre un tampone. In una forma di realizzazione, il tampone ha un pH compreso tra 2,0 e 4,0, preferibilmente il pH ? 3,0. Il tampone ? scelto tra formiato, acetato, fosfato, citrato, trifluoroacetato, propionato, preferibilmente formiato.
In una forma di realizzazione, la rivelazione mediante lo spettrometro UV della fase (vii) viene eseguita a 240 nm.
In una forma di realizzazione, il campione ? un campione organico ed ? selezionato tra mezzo di coltura cellulare, fluido biologico, lisato cellulare e lisato tissutale. Quando il campione ? un lisato cellulare o tissutale, il campione viene deproteinizzato e delipidizzato secondo le conoscenze generali comuni (ad esempio come divulgato in Zhu Jie Ping; Li Feng; Sheng Ye Shou, Medicinal Plant (2011); 2(7):18-20) prima di eseguire la fase (i).
In una forma di realizzazione, la presente invenzione riguarda un processo per la preparazione di soluzioni standard contenenti GLYP e AMPA tosilati da utilizzare per la calibrazione del procedimento di determinazione della presenza o quantit? di GLYP e AMPA, come sopra descritto. Preferibilmente, le soluzioni standard di GLYP e AMPA tosilati contengono GLYP e AMPA tosilati ad una concentrazione compresa tra 0,5 ?g/ml e 20 ?g/ml. Il processo per la preparazione di soluzioni standard contenenti GLYP e AMPA tosilati comprende le seguenti fasi:
a) una soluzione di GLYP o AMPA viene miscelata con una soluzione di tosilcloruro ottenendo una prima fase acquosa ed una prima fase organica;
b) la prima fase acquosa viene lavata con un solvente aprotico avente un valore di costante dielettrica (?r) inferiore a 10, e portata a pH 1,5-2,5 ottenendo una seconda fase acquosa ed una seconda fase organica;
c) la prima e la seconda fase organica vengono mescolate, anidrificate, e quindi mescolate con il solvente aprotico, ottenendo una terza fase organica;
d) la terza fase organica viene essiccata ottenendo una polvere;
e) la polvere viene sospesa in un ulteriore solvente aprotico organico avente un valore di costante dielettrica (?r) compreso tra 25 e 40 ottenendo una soluzione;
f) essiccare la soluzione;
g) risospendere la soluzione essiccata nel solvente aprotico, ottenendo una soluzione standard di GLYP o AMPA tosilati.
In una forma di realizzazione, la soluzione di tosilcloruro contiene il solvente aprotico organico avente un valore di costante dielettrica (?r) inferiore a 10. In una forma di realizzazione, il solvente aprotico organico ha un valore di costante dielettrica (?r) compreso tra 2,0 e 6,0. Il solvente aprotico organico ? scelto tra acetato di etile, alcol isobutilico, diclorometano, etere etilico, solfuro di metile, etere propilico, alcol isopropilico, toluene, cloroformio, preferibilmente acetato di etile.
In una forma di realizzazione, la fase b) viene ripetuta due volte. In una forma di realizzazione, il pH della prima fase acquosa viene portato a pH 2,0, preferibilmente aggiungendo H2SO4 9 M.
In una forma di realizzazione, l?operazione di anidrificazione nella fase c) viene eseguita utilizzando MgSO4.
In una forma di realizzazione, l?operazione di essiccamento nella fase d) viene eseguita mediante afflusso di azoto e ulteriore essiccamento con un concentratore refrigerato sotto vuoto.
In una forma di realizzazione, l?ulteriore solvente aprotico organico, avente un valore di costante dielettrica (?r) compreso tra 25 e 40, ? scelto tra metanolo, acetone e acetonitrile.
Le soluzioni standard di GLYP e AMPA sono pronte per essere utilizzate, eventualmente operando una o pi? diluizioni delle stesse per ottenere le concentrazioni desiderate, nella fase (vi) del procedimento di determinazione di GLYP e AMPA come qui divulgato.
In una forma di realizzazione, la presente invenzione riguarda un kit per eseguire un procedimento per determinare la presenza o la quantit? di glifosato e acido aminometilfosfonico in un campione come qui divulgato, in cui il kit comprende:
- una colonna per cromatografia liquida ad alte prestazioni a fase inversa,
- un flacone contenente una soluzione di derivatizzazione comprendente tosilcloruro,
- un flacone contenente una soluzione standard di GLYP tosilato;
- un flacone contenente una soluzione standard di AMPA tosilato; e
- un manuale di istruzioni.
In una forma di realizzazione, le soluzioni standard contengono GLYP tosilato e AMPA tosilato in una concentrazione compresa tra 0,5 ?g/ml e 20,0 ?g/ml.
In una forma di realizzazione, il kit contiene inoltre in diversi flaconi almeno uno tra: acqua e acetonitrile in un rapporto in volume pari a 90:10 volume/volume e opzionalmente un tampone avente un pH compreso tra 2,0 e 4,0; acqua e acetonitrile in un rapporto in volume pari a 50:50 volume/volume e opzionalmente un tampone avente un pH compreso tra 2,0 e 4,0; un solvente aprotico organico avente un valore di costante dielettrica (?r) compreso tra 25 e 40 (preferibilmente metanolo); acetonitrile.
La progettazione sperimentale e del protocollo ? stata un processo di due anni a causa del continuo affinamento delle procedure al fine di ottenere un procedimento concreto e nuovo per estrarre e quantificare il glifosato e il suo derivato AMPA ottenuti da diverse matrici biologiche e inorganiche. Gli inventori hanno iniziato a studiare gli effetti biologici del glifosato e dell?AMPA alla fine del 2018, con un background di team interdisciplinare, che va dalla cardiotossicit? (sia a livello tissutale che cellulare) alla farmacologia clinica. Detto questo, al meglio delle conoscenze degli inventori, non esiste una singola pubblicazione e/o domanda di brevetto sull?estrazione e la rivelazione di glifosato e AMPA basate su un procedimento HPLC-UV accoppiato con una procedura di derivatizzazione che comprende l?uso di tosilcloruro. Il procedimento di estrazione e quantificazione qui divulgato ? orientato alla rivelazione UV con un ampio scenario di applicazioni. Diversi rapporti fanno riferimento alla tecnica di massa in tandem, che ? un?analisi di 2? livello (analisi di conferma), mentre il procedimento qui descritto pu? essere ampiamente applicato nella quantificazione di analiti rivelabili spettrofotometricamente. L?apparato analitico UV ? molto conveniente. La presente invenzione supera chiaramente altre criticit? spesso legate alla quantificazione di glifosato e AMPA in matrici biologiche, che sono dovute ?...alla natura polare della molecola...? e ?...alle interferenze della matrice, i procedimenti di iniezione diretta sono applicabili solo per matrici relativamente pulite, come l?acqua o semplici matrici a base acquosa...?. Alcune pubblicazioni disponibili in letteratura, infatti, fanno riferimento a tecniche di derivatizzazione con FMOC, che ? pi? complessa rispetto alla derivatizzazione con tosilcloruro qui descritta. Molto spesso, l'effetto matrice nella rilevazione di AMPA con tecniche MS/MS ? mitigato dallo standard interno isotopico impiegato: questo approccio ? tuttavia molto costoso e non porta necessariamente a letture affidabili (Analytical Chemistry (2010); 82(23): 9671-9677). Alcuni protocolli di derivatizzazione basati su FMOC-Cl mancano di accuratezza quando applicati a matrici biologiche, mentre altri sono sviluppati per la rivelazione fluorimetrica.
Per quanto riguarda i procedimenti di rivelazione che impiegano il tosilcloruro per derivatizzare GLYP e AMPA [J. Chromatogr. (1991), 566(1):239-43; J. Chromatogr. (1991), 571(1-2):324-330], vale la pena notare che tali procedimenti differiscono dal procedimento qui descritto in termini di:
- rapporto di reazione, in termini di ottimizzazione del volume di reazione dei reagenti per affinare la velocit? di reazione del procedimento di derivatizzazione;
- tempo di procedura (circa 15 - 20 min rispetto ai 5 min del presente procedimento);
- fasi procedurali (le soluzioni di derivatizzazione utilizzate in questi procedimenti della tecnica precedente non sono iniettabili in HPLC-UV, pertanto ? necessario un ulteriore trattamento, contrariamente a quanto avviene nel presente procedimento).
Inoltre, i procedimenti della tecnica precedente utilizzano una colonna C18-5 con tampone fosfato 0,2 M -acetonitrile 85/15 volume/volume come fase mobile, mentre nel presente procedimento la fase mobile ? un tampone organico vs solvente organico (ad esempio, Soluzione A = Formiato di Ammonio 10 mM in Acetonitrile al 90% volume/volume e Soluzione B = Acetonitrile al 90% volume/volume acidificato con acido formico allo 0,1% volume/volume - Sol. A Sol. B = fase mobile) che pu? permettere una maggiore risoluzione, consentendo il raggiungimento di un pH ottimale per la separazione degli analiti.
Uno degli aspetti caratterizzanti del procedimento qui descritto ? lo sviluppo di una fase di estrazione per i derivati tosilati di GLYP e AMPA (fase (iii)) che consente di migliorare notevolmente l?affidabilit? e la riproducibilit? della rivelazione analitica di questi mediante HPLC-UV, in un campione organico o inorganico. Questa fase di estrazione prevede in realt? una procedura pi? semplice con una facile determinazione mediante spettrometria UV. Non tutti i laboratori di analisi hanno disponibilit? di rivelatori di massa. Dare la possibilit? di utilizzare una strumentazione pi? semplice ed economica pu? garantire una maggiore applicabilit? del nostro procedimento sviluppato.
Il procedimento di validazione utilizzato dai presenti inventori si basa su un livello superiore di campioni richiesti per la standardizzazione dei procedimenti analitici: UNI EN ISO IEC 17025:2018. I parametri prestazionali sono stati testati con protocolli analitici intra-laboratorio e inter-laboratorio come richiesto dal par. 7.2.2. della UNI EN ISO IEC 17025: 2018. I parametri valutati sono:
- Gamma di test di linearit? e normalit? di Shapiro-Wilk;
- LOD (Limit Of Detection = Limite Di Rivelazione), LOQ (Limit Of Quantification = Limite Di Quantificazione), IF (Interval of Confidence = Intervallo di Confidenza), ripetibilit? e riproducibilit?;
- Robustezza;
- Valutazione dell?incertezza di misurazione con approccio metrologico e modello euristico di Horwitz.
Gli inventori, quindi, hanno ottenuto un procedimento di estrazione trasversale applicabile a tutti i campioni organici e inorganici con un?ottimizzazione delle procedure di derivatizzazione e un controllo termodinamico della reazione di sostituzione nucleofila unimolecolare (SN1) tra GLYP o AMPA e 4-Toluensolfonilcloruro.
Il kit per l?estrazione e la quantificazione di GLYP e AMPA qui descritto si basa su una procedura di derivatizzazione che ? completamente nuova e consentir? agli operatori di ridurre i costi e il tempo per eseguire il saggio, migliorando la ripetibilit? e la standardizzazione tra i laboratori. I punti di forza del presente procedimento sono un?elevata specificit? per le matrici biologiche (ad esempio applicazioni tossicologiche) e una tecnica analitica economica (HPLC-UV) applicabile a una vasta capacit? di trattamento dei campioni.
Il kit rappresenta uno strumento economico e affidabile per determinare la presenza o la quantit? di GLYP e AMPA, con elevata specificit? e di facile utilizzo. Il kit pu? essere utilizzato in qualsiasi laboratorio, poich? sono necessarie forniture regolari di laboratorio (articoli in plastica, pipette, centrifuga e simili) e un sistema HPLC-UV (non ? necessaria la colonna).
Le innovazioni tecniche del procedimento qui divulgato sono principalmente:
- Ottimizzazione del procedimento di derivatizzazione (tosilcloruro): minor tempo, maggiore specificit?, rimozione delle interferenze;
- Ottimizzazione della condizione cromatografica: minor tempo, migliore separazione dei picchi analitici e rimozione delle interferenze cromatografiche, riducendo cos? l?effetto matrice;
- Applicabilit? ai sistemi biologici: il procedimento ? adatto per il monitoraggio tossicologico del glifosato e dell?AMPA nel lisato cellulare/tissutale e nei fluidi biologici (per esempio plasma e siero).
Le innovazioni tecniche portano a diversi vantaggi in termini di:
- Eccezionale rapporto costo-efficacia;
- Facilit? di applicazione;
- Uso di reagenti e strumenti ampiamente disponibili nei laboratori.
Materiali e Procedimenti
Preparazione delle Soluzioni Standard
Le soluzioni standard di GLYP e AMPA tosilati sono preparate come descritto di seguito.
a. La soluzione contenente GLYP (o AMPA) viene miscelata con una soluzione di tosilcloruro contenente acetato di etile ottenendo una prima fase acquosa ed una prima fase organica.
b. La fase acquosa ottenuta viene lavata due volte con acetato di etile e portata a pH 2 aggiungendo 130 ?l di H2SO4 9 M, ottenendo una seconda fase acquosa ed una seconda fase organica.
c. Le due fasi organiche vengono raccolte e mescolate insieme, anidrificate e mescolate con acetato di etile ottenendo una terza fase organica.
d. La terza fase organica viene anidrificata con MgSO4 ottenendo una polvere.
e. La polvere viene quindi sospesa in acetato di etile ottenendo una soluzione.
f. La soluzione viene essiccata mediante afflusso di azoto e trasferita per l?essiccamento finale in un concentratore refrigerato sotto vuoto ottenendo una polvere.
g. La polvere viene quindi sospesa in 500 ?l di metanolo e nuovamente essiccata mediante concentrazione refrigerata sotto vuoto e successivamente risospesa in acetato di etile.
Determinazione di GLYP e AMPA in un campione ? fasi i a v.
Reagenti:
A. Soluzione di derivatizzazione: 5 mg di 4-Toluensolfonilcloruro in 10 ml di acetonitrile (grado HPLC) B. Tampone fosfato 0,4 M: volume 1:1 di Na2HPO40,4 M e Na3PO4 0,4 M, pH 11,00
Campione: terreni di coltura cellulare, fluidi biologici (plasma, siero), lisati cellulari e tissutali e campioni inorganici
0. Se il campione ? un lisato cellulare o tissutale, deve essere deproteinizzato e delipidizzato come descritto in Medicinal Plant (2011); 2(7): 18-20;
1. inserire 200 ?l di campione in una provetta da 2 ml e aggiungere 200 ?l di reagente B e 200 ?l di reagente A, vorticare 10 s;
2. incubare la soluzione in bagno termostatico a 50?C per 5 min;
3. aggiungere 500 ?l di acetato di etile alla soluzione, mescolare energicamente per 5 min quindi centrifugare a 5?C, 3500 giri al minuto per 5 min. Raccogliere il surnatante e trasferirlo in una nuova provetta da 2 ml. Ripetere la procedura una volta con 300 ?l di acetato di etile. Lavare il surnatante con 150 ?l di toluene per eliminare i residui d?acqua;
4. essiccare il surnatante in un concentratore refrigerato sottovuoto;
5. ricostituire il surnatante essiccato in 200 ?l di fase mobile (Fase A: Acqua acido formico allo 0,1% volume/volume formiato di ammonio 50 mM; Fase B: Acetonitrile:Acqua 9,5:0,5 acido formico allo 0,1% volume/volume formiato di ammonio 50 mM).
A questo punto ? possibile eseguire l?analisi HPLC-UV.
Analisi HPLC-UV ? fasi vi e vii.
Colonna: Fase Inversa Core Shell (5 ?m, 4,6 mm x 250 mm) Eluizione: a gradiente con sistema binario (vedi Tabella 1)
Soluzione A: Tampone acquoso con range di pH 2,0 - 3,5 Soluzione B: Solvente Organico (costante dielettrica tra 25 - 40) con 10% volume/volume di Soluzione A;
Iniezione di volume: 5,0 ?l ? 50,0 ?l
Condizione del Rivelatore: ?max = 240 nm
Flusso: 1,0 ml/min
Tabella 1.
Calibrazione
Il procedimento di calibrazione si basa sulla regressione lineare dell?iniezione di standard. La curva di calibrazione ? derivata da standard con fattori di diluizione crescenti.
Il cromatogramma tipico della curva di calibrazione ? riportato in Figura 2, il tempo di ritenzione dei picchi e la relativa concentrazione sono riportati rispettivamente nella Tabella 2 e nella legenda del grafico.
Tabella 2.
Risultati
Il procedimento cromatografico ? rappresentato e la risoluzione dei picchi ? valutabile nella Figura 3. La linea punteggiata rappresenta i segnali cromatografici di AMPA e GLYP nel Terreno di Coltura Cellulare dopo 90 min di incubazione con soluzione addizionata a 100 mg/ml di GLYP. La linea tratteggiata rappresenta i segnali cromatografici di AMPA e GLYP in cellule lisate dopo 90 min di incubazione con soluzione addizionata a 100 mg/ml di GLYP in terreno di coltura cellulare. Le concentrazioni di AMPA e GLYP di cui alla Figura 3, sono riportate nella Tabella 3. Infine, la linea continua nel cromatogramma della Figura 3 rappresenta la soluzione standard di AMPA e GLYP tosilati per l?identificazione dei picchi.
Tabella 3.
Claims (14)
1. Procedimento per determinare la presenza o la quantit? di glifosato e acido aminometilfosfonico in un campione, il procedimento comprendendo le seguenti fasi:
i) miscelare il campione sospettato di contenere glifosato e acido aminometilfosfonico con una soluzione di tosilcloruro ottenendo una prima soluzione;
(ii) incubare la prima soluzione, ottenendo cos? glifosato tosilato e acido aminometilfosfonico tosilato;
(iii) estrarre glifosato tosilato e acido aminometilfosfonico tosilato dalla prima soluzione mediante: (a) miscelazione della prima soluzione con un solvente aprotico organico avente una costante dielettrica inferiore a 10, (b) centrifugazione e (c) raccolta di un surnatante;
(iv) essiccare il surnatante;
(v) ricostituire il surnatante in acetonitrile, ottenendo un surnatante ricostituito;
(vi) separare cromatograficamente glifosato tosilato e acido aminometilfosfonico tosilato da altri costituenti nel surnatante ricostituito, mediante una colonna per cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC);
(vii) rivelare mediante uno spettrometro UV il glifosato tosilato e l?acido aminometilfosfonico tosilato separati cromatograficamente, per determinare la presenza o la quantit? di glifosato e acido aminometilfosfonico contenuti nel campione.
2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui la soluzione di tosilcloruro comprende tosilcloruro e acetonitrile ed opzionalmente una soluzione tampone avente un pH compreso tra 10,0 e 12,0.
3. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui l?incubazione della fase (ii) viene effettuata ad una temperatura di 40-60?C, preferibilmente a 50?C.
4. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui la centrifugazione della fase (iii) viene effettuata ad una temperatura di 2-10?C.
5. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui la fase (iii) viene ripetuta due volte.
6. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui l?essiccamento del surnatante della fase (iv) viene effettuato in un concentratore refrigerato sottovuoto.
7. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui la ricostituzione della fase (v) viene effettuata impiegando una soluzione di ricostituzione contenente acetonitrile e acqua in un rapporto in volume compreso tra 50:50 e 75:25 volume/volume e opzionalmente una soluzione tampone avente un pH compreso tra 2,0 e 5,0.
8. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui nella fase (v) il surnatante ricostituito viene lavato con un solvente di lavaggio in grado di creare un azeotropo con il solvente aprotico organico utilizzato nella fase (iii).
9. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui la separazione cromatografica della fase (vi) viene effettuata utilizzando una colonna a fase inversa e una fase mobile comprendente acqua e acetonitrile in un rapporto in volume compreso tra 90:10 e 50: 50 volume/volume, la fase mobile contenendo opzionalmente un tampone avente un pH compreso tra 2,0 e 4,0.
10. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui la rivelazione mediante spettrometro UV viene effettuata a 240 nm.
11. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui il campione organico ? scelto tra terreno di coltura cellulare, fluido biologico, lisato cellulare e lisato tissutale.
12. Procedimento per preparare soluzioni standard di GLYP tosilato e AMPA tosilato per eseguire il procedimento per determinare GLYP e AMPA in un campione organico o inorganico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, il procedimento comprendendo le seguenti fasi:
(a) miscelare una soluzione di GLYP o AMPA con una soluzione di tosilcloruro, ottenendo una prima fase acquosa e una prima fase organica;
(b) lavare la prima fase acquosa con un solvente aprotico inorganico avente un valore di costante dielettrica inferiore a 10, ottenendo una seconda fase acquosa ed una seconda fase organica;
(c) miscelare insieme la prima e la seconda fase organica, anidrificare e aggiungere il solvente aprotico organico, ottenendo una terza fase organica;
(d) essiccare la terza fase organica ottenendo una polvere;
(e)sospendere la polvere in un ulteriore solvente aprotico organico avente un valore di costante dielettrica compreso tra 25 e 40, ottenendo una soluzione;
(f) essiccare la soluzione;
(g) risospendere la soluzione essiccata nel solvente aprotico organico ottenendo una soluzione standard di GLYP o AMPA tosilato.
13. Kit per eseguire un procedimento per determinare la presenza o la quantit? di glifosato e acido aminometilfosfonico in un campione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui il kit comprende:
- una colonna a fase inversa per cromatografia liquida ad alte prestazioni;
- un flacone contenente una soluzione di tosilcloruro; - un flacone contenente una soluzione standard di GLYP tosilato;
- un flacone contenente una soluzione standard di AMPA tosilato; e
- un manuale di istruzioni.
14. Kit secondo la rivendicazione 13, comprendente inoltre almeno uno tra: acqua e acetonitrile in un rapporto in volume pari a 90:10 volume/volume ed opzionalmente un tampone avente un pH compreso tra 2,0 e 4,0; acqua e acetonitrile in un rapporto in volume pari a 50:50 volume/volume ed opzionalmente un tampone avente un pH compreso tra 2,0 e 4,0; un solvente aprotico organico avente un valore di costante dielettrica (?r) compreso tra 25 e 40; e acetonitrile.
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Non-Patent Citations (12)
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|---|
| ABDULLAH ET AL: "Improved method for the determination of glyphosate in water", JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 697, no. 1-2, 21 April 1995 (1995-04-21), pages 363 - 369, XP005607244, ISSN: 0021-9673, DOI: 10.1016/0021-9673(94)01161-7 * |
| ANALYTICAL CHEMISTRY, vol. 82, no. 23, 2010, pages 9671 - 9677 |
| FRONT. BEHAV. NEUROSCI., vol. 11, 2017, pages 146 |
| J. CHEM. EDUC., vol. 95, no. 1, 2018, pages 136 - 140 |
| J. CHROMATOGR., vol. 571, no. 1-2, 1991, pages 324 - 330 |
| JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY, vol. 566, 1991, pages 239 - 243 |
| JPN. J. LEGAL MED., vol. 42, 1988, pages 128 |
| KAWAI S ET AL: "Determination of glyphosate and its major metabolite aminomethylphosphonic acid by high-performance liquid chromatography after derivatization with p-toluenesulphonyl chloride", JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 540, 1 January 1991 (1991-01-01), pages 411 - 415, XP028084569, ISSN: 0021-9673, [retrieved on 19910101], DOI: 10.1016/S0021-9673(01)88832-4 * |
| KHROLENKO ET AL: "Determination of glyphosate and its metabolite aminomethylphosphonic acid in fruit juices using supported-liquid membrane preconcentration method with high-performance liquid chromatography and UV detection after derivatization with p-toluenesulphonyl chloride", JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 1093, no. 1-2, 4 November 2005 (2005-11-04), pages 111 - 117, XP005118418, ISSN: 0021-9673, DOI: 10.1016/J.CHROMA.2005.07.062 * |
| TOMITA M ET AL: "High-performance liquid chromatographic determination of glyphosate and (aminomethyl)phosphonic acid in human serum after conversion into p-toluenesulphonyl derivatives", JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY B, ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS, NL, vol. 566, no. 1, 3 May 1991 (1991-05-03), pages 239 - 243, XP026548858, ISSN: 0378-4347, [retrieved on 19910503], DOI: 10.1016/0378-4347(91)80130-5 * |
| ZHU JIE PINGLI FENGSHENG YE SHOU, MEDICINAL PLANT, vol. 2, no. 7, 2011, pages 18 - 20 |
| ZOUAOUI K ET AL: "Determination of glyphosate and AMPA in blood and urine from humans: About 13 cases of acute intoxication", FORENSIC SCIENCE INTERNATIONAL, ELSEVIER B.V, AMSTERDAM, NL, vol. 226, no. 1, 3 January 2013 (2013-01-03), XP028999269, ISSN: 0379-0738, DOI: 10.1016/J.FORSCIINT.2012.12.010 * |
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