CN103472144A - 一种快速测定生物样品中游离分析物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速测定生物样品中游离分析物的方法，通过利用萃取溶剂中的氘代分析物的脱附来校正样品溶液中分析物的萃取过程，氘代分析物的脱附和分析物的萃取同时进行，最后利用色谱质谱仪器测定分析物及其氘代分析物的浓度，进而根据动力学校正方法的计算公式计算出游离分析物的浓度,血浆样品进而可以计算出血浆药物蛋白结合率。本方法不改变生物样品的性质和样品基质的影响，可实现简单、快速、准确地测定生物样品中游离分析物的含量。
Description
技术领域
本发明涉及一种快速分析生物样品的方法，特别涉及一种样品前处理、生物样品分析、血浆中药物蛋白结合率测定的分析方法，属于化学分析技术领域
背景技术
生物样品包括各种体液和组织，常用的是血液（血浆、血清、全血）、尿液、唾液。由于生物样品成分非常复杂，且一般具有生物活性，因此在常温条件下，样品在短时间内就会变质。鉴于此，生物样品分析前需要对活性物质进行复杂的预处理，如进行分离、纯化和浓缩。生物样品的分析方法多种多样，目前采用的主要方法包括：萃取、电泳、色谱等方法。由于萃取技术需要较长的萃取时间，对萃取剂要求很高，对于目标物质的定量也非常困难，因此萃取法对于生物样品的分析存在很大的缺陷；另外，电泳分析生物样品需要耗费很长的时间和很高的成本；虽然色谱方法比较常用，但其对样品的前处理要求也比较高。
复杂样品体系的分离、分析是现代分析科学中的重点和难点。随着现代科学技术的进步和分析技术、分析仪器的发展，分析的灵敏度、分辨率和自动化程度也越来越高，而费时费力的样品前处理技术已成为制约整个分析过程的瓶颈。因此，研究开发一种快速、高效、简单、绿色的样品前处理技术非常关键。
微萃取技术是上世纪九十年代发展起来的新型样品前处理技术，具有集采样、萃取、浓缩、分离于一体，简单方便，省时省力和绿色环保的特点。液相微萃取（LPME）由于其可选择的萃取相和萃取模式更多以及更为经济的特点，近年越来越受到国内外分析科学家重视。中空纤维液相微萃取（HF-LPME）利用多孔中空纤维膜来保护液体萃取相，具有成本低、有机溶剂用量少、样品净化功能突出、易与多种分析仪器联用和操作模式多样化等其它萃取技术无法替代的优点，是一种具有广阔发展前景的样品前处理技术，非常适合于血浆等复杂生物样品的分析。
虽然HF-LPME具有很多优点，然而，由于一般的定量方法需要在平衡状态下进行，其较长的萃取时间是HF-LPME最主要的方法缺陷。原因在于，对于生物样品分析而言，过长的萃取时间会影响游离药物和结合药物的平衡，进而会在生物样品的分析中产生一些假象而影响结果的准确度和精密度。此外，过长的分析时间可能导致萃取溶剂的损失，以及生物样品中酶的代谢等因素也会导致基质的改变。
另外，与传统的液液萃取（LLE）和固相萃取（SPE）不同，微萃取技术是一种非完全萃取的模式，因而定量校正技术对于微萃取技术的发展和应用十分重要。中空纤维液相微萃取一般采用平衡外标法定量，即利用标准溶液配制的样品溶液进行平衡萃取，再进行后续的仪器分析（色谱法或电泳法等），根据仪器的分析信号和已知的样品溶液浓度做出工作曲线。这种定量技术的缺点表现在：（1）平衡时间长（多数血浆样品的平衡时间是90-180分钟），样品会发生变化；（2）无法测定游离药物的浓度，外标法测定的只能是药物的总浓度（包括游离药物和结合药物），因而不能用于血浆样品中药物蛋白结合率的测定。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明的目的是克服现有生物样品分析的难点，提供一种简单、快速、准确测定生物样品中游离分析物的方法。
本发明的目的是这样实现的：
一种快速测定生物样品中游离分析物的方法，包括样品前处理装置的制作、动力学校正中空纤维液相微萃取、样品中游离分析物浓度的计算和仪器分析，其中所述样品前处理采用动力学校正中空纤维液相微萃取技术，所述样品中游离分析物浓度采用动力学校正样品溶液中分析物浓度计算公式进行计算，所述仪器分析采用色谱质谱联用仪器进行定性定量分析。
优选地，所述的快速测定生物样品中游离分析物的方法，其中所述动力学校正中空纤维液相微萃取技术的样品前处理方法为中空纤维膜中的氘代分析物的脱附与分析物的萃取同时进行。
优选地，所述的快速测定生物样品中游离分析物的方法，其中所述中空纤维液相微萃取可选用手动或自动中空纤维液相微萃取进行处理，中空纤维膜材料根据分析物进行选择。
优选地，所述的快速测定生物样品中游离分析物的方法，其中采用的动力学校正样品溶液中游离分析物浓度计算公式可以进一步计算出血浆样品的药物蛋白结合率。
一种快速测定生物样品中游离分析物的方法，包括如下步骤：
a.取聚偏氟乙烯中空纤维膜，剪成1.6-2.0cm的小段，甲醇超声清洗，自然晾干；
b.取0.5-10μL的移液枪枪头剪去上半部分，留下2.6-3.0cm长度的尖嘴部分，其尖端套在步骤a的聚偏氟乙烯中空纤维膜上，聚偏氟乙烯中空纤维膜另一端被封口；
c.取样品瓶，瓶口盖上一层带有一小孔的聚四氟乙烯/聚二甲基硅氧烷隔垫，将步骤b的连接有聚偏氟乙烯中空纤维膜的通过聚四氟乙烯/聚二甲基硅氧烷隔垫上的小孔固定于样品瓶内；
d.通过所述移液枪枪头自由端向聚偏氟乙烯中空纤维膜内腔中加入含有氘代分析物的萃取溶液，然后向所述样品瓶内加入含有分析物的血浆样品溶液，放到涡旋振荡器上，转速400-800rpm，萃取5-20分钟，然后用微量注射器吸取聚偏氟乙烯中空纤维膜内腔中的溶液作为样品，注入气相色谱-质谱仪进行所述分析物和氘代分析物的定量分析。
优选地，所述的快速测定生物样品中游离分析物的方法，其中在所述带有一小孔的聚四氟乙烯/聚二甲基硅氧烷隔垫上盖一层无孔聚四氟乙烯/聚二甲基硅氧烷隔垫。
进一步优选地，所述的快速测定生物样品中游离分析物的方法，其中步骤a中聚偏氟乙烯中空纤维膜的孔径0.2μm，内径1.2mm，外径1.4mm，且被剪成1.8cm的小段，甲醇超声清洗2分钟，自然晾干。
进一步优选地，所述的快速测定生物样品中游离分析物的方法，其中步骤b中将移液枪枪头剪去上半部分，留下2.8cm长度的尖嘴部分，其尖端套在步骤a的聚偏氟乙烯中空纤维膜上，聚偏氟乙烯中空纤维膜另一端用钳子夹紧封口。
进一步优选地，所述的快速测定生物样品中游离分析物的方法，其中步骤d中涡旋振荡器的转速为550rpm，萃取10分钟。
与现有分析方法相比，本发明涉及的测定生物样品中游离分析物的方法具有如下优点和显著进步：
（1）检测前，生物样品无需进行其它处理，直接由固定在中空纤维膜中的有机溶剂进行萃取，业不用进行样品pH值的改变，样品一直可以保持生理条件，避免了生理条件的改变对样品性质的改变（药物蛋白结合、pH值等）。
（2）动力学校正可以把萃取时间控制在20min以内，有效地避免了样品变质的影响，避免了样品中的基质对检测结果的影响，大大提高了分析方法的准确度。
（3）无需复杂的前处理装置，避免采用微透析涉及的动力泵等，装置简单，成本低，没有非特异性吸附等现象。
（4）由于微萃取具有富集效果，虽然萃取时间短（10分钟），但仍然可以获得足够仪器检测到的游离分析物的物质的量n和Q，进而可以计算出样品中的游离分析物浓度C0和药物蛋白结合率。
附图说明
图为动力学校正中空纤维液相微萃取装置示意图
其中：1为防止溶剂挥发的聚四氟乙烯/聚二甲基硅氧烷隔垫（此材质的隔垫一般不吸附分析物）；2为固定枪头打孔的聚四氟乙烯/聚二甲基硅氧烷隔垫；3为样品瓶；4为微量注射器枪头；5为聚偏氟乙烯中空纤维膜或聚丙烯中空纤维膜；6为含有氘代分析物的萃取溶液（氘代分析物溶解在萃取溶剂中配制而成）；7为含有分析物（分析物有游离形式和蛋白结合形式）的生物样品。
具体实施方式
本发明的分析方法通过利用中空纤维液相微萃取进行生物样品中分析物的萃取和富集，利用动力学校正技术定量，短时间（5-20分钟）萃取，最后用色谱-质谱仪进行分析测定。
本发明的生物样品中分析物的萃取采用聚偏氟乙烯（PVDF）中空纤维膜微萃取装置。把上述中空纤维膜剪成合适的小段，甲醇超声清洗，自然晾干。把合适大小的移液枪枪头减去上半部分，留下一定的长度，此移液枪枪头用以在样品瓶中固定中空纤维膜。把聚四氟乙烯/聚二甲基硅氧烷(Teflon/PDMS)隔垫打个孔用以固定移液枪枪头的上半部分，移液枪枪头的尖嘴部分套在中空纤维膜上，用一加热的铁丝把中空纤维膜固定在移液枪枪头的尖嘴部分，中空纤维膜另一端用钳子夹紧封好口。
本发明的动力学校正中空纤维液相微萃取操作如下：把20-30μL的含有氘代分析物（氘代分析物的含量应保证其初始浓度和萃取一定时间后剩余的氘代分析物的含量在色谱仪器分析的线性范围内）的萃取溶剂（常用的是正辛醇、对二甲苯、正己醚等）加到固定在隔垫上的中空纤维膜的内腔中，等待2分钟，待萃取溶剂完全浸润到中空纤维膜壁的孔径中（纤维膜变透明）。然后把上述中空纤维膜放到4-10ml的样品瓶中（样品瓶中加有2-6ml的含有分析物的血浆样品），涡旋振荡，进行萃取。在萃取过程中，氘代分析物脱附到样品溶液中，游离分析物萃取到萃取溶剂中（结合药物由于分子较大，超过中空纤维膜的0.2μm孔径，不能被萃取）。萃取时间为5-20分钟（一般是平衡萃取时间的1/10）。萃取完成后，取出中空纤维膜，用微量注射器取纤维膜内腔中的萃取溶剂1-2L,注入色谱-质谱仪进行含量测定，获取公式1中的n和Q，此步骤和一般仪器分析的色谱-质谱分析相同。
本发明的原理基于界面层模型和扩散传质理论，推导和建立了动力学校正中空纤维液相微萃取（HF-LPME）测定生物样品中游离分析物浓度的计算公式。
本发明的游离分析物浓度计算公式如下：
公式（1）中C0代表样品溶液中游离分析物的浓度，n代表预平衡时在萃取时间t萃取溶剂萃取的分析物的物质的量(色谱-质谱分析获得的数值)，q0代表预先加到萃取溶剂中的氘代分析物的物质的量（已知量），Q代表预平衡时在萃取时间t萃取溶剂中残留的氘代分析物的物质的量（色谱-分析获得的结果），Ve代表萃取溶剂的体积，Kes代表分析物在萃取溶剂和样品溶液间的分配系数（有些药物可以查阅文献获取改值，文献检索不到的可以根据摇瓶法测定）。
根据公式（1），则对于生物样品中游离分析物的浓度测定，可以根据预平衡时氘代分析物的脱附来校正样品溶液中分析物的吸附，克服样品基质的影响，缩短分析时间。
对于血浆样品，根据公式1计算出游离药物浓度以后，可以进而进行药物蛋白结合率的计算，计算公式采用方程2，
公式（2）中PB(%)代表药物蛋白结合率，Ct代表血浆样品溶液中药物的总浓度（加入血浆样品中的药物浓度），Cf代表样品溶液中游离药物（分析物）的浓度，也就是根据公式（1）计算出来的游离药物浓度。
以下通过实施例形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1：
把聚偏氟乙烯（PVDF）中空纤维膜（孔径0.2μm，内径1.2mm,外径1.4mm）剪成1.8cm的小段，甲醇超声清洗2分钟，自然晾干。把0.5-10μL的移液枪枪头减去上半部分，留下2.8cm的长度，此移液枪枪头用以在样品瓶中固定中空纤维膜。把聚四氟乙烯/聚二甲基硅氧烷(Teflon/PDMS)隔垫打个孔用以固定移液枪枪头的上半部分，移液枪枪头的尖嘴部分套在中空纤维膜上，用一加热的铁丝把中空纤维膜固定在移液枪枪头的尖嘴部分，中空纤维膜另一端用钳子夹紧封好口，中空纤维膜的有效长度为1.5cm。
如图1所示，取10ml样品瓶（3），聚偏氟乙烯中空纤维膜（5）固定在移液枪枪头（4）上，移液器枪头固定在聚四氟乙烯/聚二甲基硅氧烷隔垫（2）上，用微量注射器准确加到中空纤维膜内腔中萃取溶液（2.5μg/ml的氘代氟硝西泮正辛醇溶液）20μL，加入4mL含有分析物（250ng/ml氟硝西泮）的血浆样品溶液，放到涡旋振荡器上，550rpm转速，萃取10分钟，然后用微量注射器吸取中空纤维膜内腔中的溶液2μL，注入气相色谱-质谱仪进行分析物和氘代分析物的定量分析。
根据氟硝西泮和氘代氟硝西泮标准溶液的仪器工作曲线，求出在萃取10分钟时正辛醇萃取溶剂中萃取的氟硝西泮的物质的量n(根据工作曲线求出的氟硝西泮浓度乘以萃取溶剂体积20μL)和萃取10分钟时正辛醇萃取溶剂中剩余的氘代氟硝西泮的物质的量Q(根据工作曲线求出的氘代氟硝西泮浓度乘以萃取溶剂体积20μL)。
计算游离药物浓度，采用公式1：
这里q0代表是已知的预先加到萃取溶剂中的氘代分析物的物质的量（这里=2.5μg/ml×20μL=50ng），Ve代表萃取溶剂的体积(20μL)，Kes代表分析物在萃取溶剂和样品溶液间的分配系数（氟硝西泮根据摇瓶法测定其分配系数为150）。这样，计算出来的250ng/ml氟硝西泮血浆样品中游离药物的浓度是60.5ng/mL。根据公式2，氟硝西泮血浆样品中游离药物的浓度是60.5ng/mL，总浓度为已知配制的250ng/ml，则氟硝西泮的血浆药物结合率为75.8%。本方法的回收率为102.1%，定量限为0.1ng/mL。
实施例2：
HF-LPME装置的制备和操作过程同实施例1。用微量注射器准确加到中空纤维膜内腔中萃取溶液（2.5μg/ml的氘代氟硝西泮正辛醇溶液）20μL，加入4mL含有分析物（250ng/ml氟硝西泮）的尿液样品，放到涡旋振荡器上，550rpm转速，萃取10分钟，然后用微量注射器吸取中空纤维膜内腔中的溶液2μL，注入气相色谱-质谱仪进行分析物和氘代分析物的定量分析。
根据氟硝西泮和氘代氟硝西泮标准溶液的仪器工作曲线，求出在萃取10分钟时正辛醇萃取溶剂中萃取的氟硝西泮的物质的量n(根据工作曲线求出的氟硝西泮浓度乘以萃取溶剂体积20μL)和萃取10分钟时正辛醇萃取溶剂中剩余的氘代氟硝西泮的物质的量Q(根据工作曲线求出的氘代氟硝西泮浓度乘以萃取溶剂体积20μL)。
计算游离氟硝西泮浓度，采用公式1：
这里q0代表是已知的预先加到萃取溶剂中的氘代分析物的物质的量（这里=2.5μg/ml×20μL=50ng），Ve代表萃取溶剂的体积(20μL)，Kes代表分析物在萃取溶剂和样品溶液间的分配系数（氟硝西泮根据摇瓶法测定其分配系数为151）。这样，计算出来的250ng/ml氟硝西泮血浆样品中游离药物的浓度是249ng/mL(n=5,RSD(%)=4.9)，方法的回收率为99.6%(n=5)，定量限为0.01ng/mL。
Claims (9)
1.一种快速测定生物样品中游离分析物的方法，包括样品前处理装置的制作、动力学校正中空纤维液相微萃取、样品中游离分析物浓度的计算和仪器分析，其特征在于：所述样品前处理采用动力学校正中空纤维液相微萃取技术，所述样品中游离分析物浓度采用动力学校正样品溶液中分析物浓度计算公式进行计算，所述仪器分析采用色谱质谱联用仪器进行定性定量分析。
2.根据权利要求1所述的快速测定生物样品中游离分析物的方法，其特征在于：所述动力学校正中空纤维液相微萃取技术的样品前处理方法为中空纤维膜中的氘代分析物的脱附与分析物的萃取同时进行。
3.根据权利要求1所述的快速测定生物样品中游离分析物的方法，其特征在于：所述中空纤维液相微萃取可选用手动或自动中空纤维液相微萃取进行处理，中空纤维膜材料根据分析物进行选择。
4.根据权利要求1所述的快速测定生物样品中游离分析物的方法，其特征在于：采用的动力学校正样品溶液中游离分析物浓度计算公式可以进一步计算出血浆样品的药物蛋白结合率。
5.根据权利要求1-4任一项所述的快速测定生物样品中游离分析物的方法，其特征在于包括如下步骤：
a.取聚偏氟乙烯中空纤维膜，剪成1.6-2.0cm的小段，甲醇超声清洗，自然晾干；
b.取0.5-10μL的移液枪枪头剪去上半部分，留下2.6-3.0cm长度的尖嘴部分，其尖端套在步骤a的聚偏氟乙烯中空纤维膜上，聚偏氟乙烯中空纤维膜另一端被封口；
c.取样品瓶，瓶口盖上一层带有一小孔的聚四氟乙烯/聚二甲基硅氧烷隔垫，将步骤b的连接有聚偏氟乙烯中空纤维膜的通过聚四氟乙烯/聚二甲基硅氧烷隔垫上的小孔固定于样品瓶内；
d.通过所述移液枪枪头自由端向聚偏氟乙烯中空纤维膜内腔中加入含有氘代分析物的萃取溶液，然后向所述样品瓶内加入含有分析物的血浆样品溶液，放到涡旋振荡器上，转速400-800rpm，萃取5-20分钟，然后用微量注射器吸取聚偏氟乙烯中空纤维膜内腔中的溶液作为样品，注入气相色谱-质谱仪进行所述分析物和氘代分析物的定量分析。
6.根据权利要求5所述的快速测定生物样品中游离分析物的方法，其特征在于：在所述带有一小孔的聚四氟乙烯/聚二甲基硅氧烷隔垫上盖一层无孔聚四氟乙烯/聚二甲基硅氧烷隔垫。
7.根据权利要求5所述的快速测定生物样品中游离分析物的方法，其特征在于：步骤a中聚偏氟乙烯中空纤维膜的孔径0.2μm，内径1.2mm，外径1.4mm，且被剪成1.8cm的小段，甲醇超声清洗2分钟，自然晾干。
8.根据权利要求5所述的快速测定生物样品中游离分析物的方法，其特征在于：步骤b中将移液枪枪头剪去上半部分，留下2.8cm长度的尖嘴部分，其尖端套在步骤a的聚偏氟乙烯中空纤维膜上，聚偏氟乙烯中空纤维膜另一端用钳子夹紧封口。
9.根据权利要求5所述的快速测定生物样品中游离分析物的方法，其特征在于：步骤d中涡旋振荡器的转速为550rpm，萃取10分钟。
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