DE2037988B2 - Verfahren zur Herstellung von Cytidin-5'-diphospho-cholin und seiner Salze - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von Cytidin-5'-diphospho-cholin und seiner Salze

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DE2037988B2
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cytidine
cdp
liter
diphosphocholine
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Hiroshi Tokio Hagino
Kiyoshi Sagamihara Kanagawa Nakayama
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KH Neochem Co Ltd
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
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Description

20
25 Aspergillus terreus A.T.CC 1012 Aspergillus flavus A.T.CC 13698 Gibberella fujikuroi A.T.CC 20136 RhizopusdelemarAXCC 20134 Mucor javanicus A.T.CC 15242 Saccharomyces cerevisiae A.T.CC 15248 Saccharomyces lactis A.T.CC 12425 Torulopsis sphaerica A.T.CC 8549 Zygosaccharomyces major (Synonym Saccharomyces rouxii) A.T.CC 15249 Kloeckera africana A.T.CC 16512 oder Candida guilliermondii A.T.CC. 9058,
d) Phosphationen,
e) Magnesium- und/oder Manganionen und
f) mindestens einen vergärbaren Zucker enthält, und das Cytidin-5'-diphospho-cholin aus der Gärmaische nach bekannten Methoden isoliert und gegebenenfalls in ein Basensalz überfährt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als vergärbaren Zucker Glucose verwendet
Bekanntlich ist Cytidin-S'-diphospho-cholin (CDP-Cholin) ein Coenzym des Fettstoffwechsels. Es wird nicht nur für die Biosynthese des Lecithins benötigt, wr. dem es spielt auch beim Aufbau von Plasmalogen in Leber und Gehirn eine Rolle. Der bei Kopfverletzungen
NH2 C
beobachtete erniedrigte Phospholipidgehalt und erniedrigte Ascorbinsäuregehalt wird durch intracarotiale Injektion von CDP-Cholin normalisiert. Diese Verbindung weist die folgende Strukturformel auf:
35
C-H
C-H O
CHHC
l\l l/l
H C-C H
I I
HO OH
Chidin-S'-diphospho-cholin kann z. B. aus Hefe (Science, Band 124 (1956), Seite 81) oder synthetisch (Journal of Biological Chemistry, Band 222 (1956), Seiten 185-191; Chem. pharmac. Bull (Tokyo) 10 (1962), S. 231; Japan Patent 6540/64), zitiert nach CA. 61 (1964). 13406) gewonnen werden. Die Herstellung von CDP-Cholin im Großmaßstab bereitet jedoch Schwierigkeilen, da die bekannten Verfahren zu seiner Herstellung nur geringe Ausbeuten ergeben und deshalb zu unerwünscht hohen Herstellungskosten führen. Aus diesem Grunde hat CDP-Cholin trotz seines unbestrittenen Wertes in der Praxis bisher nur geringe Bedeutung. Aufgabe der Erfindung war deshalb, ein Verfahren zur Herstellung von reinem CPD-Cholin zu schaffen, das gute Ausbeuten ergibt, billig ist und in industriellem
O O
Il Il
CH2-O-P-O-P—O—CH2—CH2—N®(CH3)j OH O'
Maßstab durchführbar ist. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von Cytidin-5'-diphospho-cholin, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man bei Temperaturen von etwa 20 bis 55°C und einem pH-Wert von 5,0 bis 9,0 ein wäßriges Reaktionsmedium vergärt, das
a) Cholin und/oder Phosphorylcholin,
b) Cytidin, Cytidin-5'-monophosphat (im folgenden als »CMP« bezeichnet), Cytidin-5'-diphosphat (im folgenden als »CDP« bezeichnet) und/oder Cytidin-S'-triphosphat (im folgenden als »CTP« bezeichnet),
c) Enzyme von
Biyjvibacterium ammoniagenes AXCG 6872 Escherichia coli AXGC 21148 Serratia marcescens AXGC. 2123 Aerobacter aerogenes AX.GG 21217 Corynebacterium glutamincuni A.T.C.G 13287 Arthrobacter simplex AXGG 1577 Micrococcus sodonensis AXGG 11880 Pseudomonas fluorescein A.T.GG 21256 Bacillus subtilis A.T.GG 15512 Nocardia globerula AXGG 21022 Streptomyces ambofaciens AXGC 15154 Penicillium chrysogenum A.TGG 15241 Aspergillus terreus AXCG 1012 Aspergillus flavus AX.GG 13698 GibbereIIa fujikuroi AXGG 20136 Rhizopus delemar AXGG 20134 Mucor javanicus AXGG15242 Saccharomyces cerevisiae AXGG 15248 Saccharomyces Iactis A.T.GG 12425 Torulopsis späaerica AXGG 8549 Zygosaeeharomyce» major (Synonym Saccharomyces rouxii) AXGG 15249 Kloeckera africana AXGG16512 oder Candida guilliermondii AXGG 9058
d) Phosphationen,
e) Magnesium- und/oder Manganionen und
f) mindestens einen vergärbaren Zucker enthält und das Cytidin-S'-diphospho-cholin aus der Gärmaische nach bekannten Methoden isoliert und gegebenenfalls in ein Basensalz überführt.
Die Vergärung kann in üblichen Vorrichtungen bei Atmosphärendruck und Normaltemperatur durchgeführt werden.
Die Ausgangsmaterialien Cytidin, JMP, CDP oder CTP sind handelsübliche Verbindungen und können synthetisch hergestellt werden. Außerdem kann Cytidin cder CMP durch enzymatischen Abbau von Ribonucleinsäuren hergestellt werden, CDP oder CTP können auch durch Phosphorylierung von CMP hergestellt werden. Diese Verbindungen können entweder in freier Form oder in Form ihrer pharmakplogisch verträglichen Salze, z. B. als Natriumsalz, verwendet werden.
Cholin wird industriell hergestellt und ist im Handel leicht erhältlich. Es kann in Form seiner pharmakologisch verträglichen Salze, z. B. als Chlorid, Bromid, Citrat oder Gluconat, verwendet werden. Phosphorylcholin (Cholinphosphat) kann durch Phosphorylierung von Cholinchlorid hergestellt werden und ist im Handel wie Cholin als Chlorid erhältlich. Alle vorgenannten Formen können im Verfahren der Erfindung verwendet werden. Außerdem können auch funktioneile Derivate anstelle von Cholin und Phosphorylcholin verwendet werden.
Die Konzentrationen von Cholin, CMP, CDP, CTP, Cytidin oder Phosphorylcholin sind nicht besonders kritisch, abgesehen davon, daß wirksame Mengen davon erforderlich sind, d. h. Mengen, die die Herstellung der gewünschten Menge an CDP-Cholin erlauben. Im allgemeinen wird Cytidin, CMP, CDP und/oder CTP in Mengen von I g/Liter bis 1000 g/Liter, vorzugsweise 5 g/Liter bis 30 g/Liter, als freie Säuren eingesetzt. Die Cholin- und/oder Phosphorylcholinkonzentration beträgt vorzugsweise 0,5 g/Liter bis 50 g/Liter.
Die erforderlichen Phosphationen können in Form von anorganischen Phosphaten, z. B. KH2PO4, K2HPO4, K3PO4, Na2HPO4, NaH2PO4 und NajPO4, zugegeben werden. Ebenso kann man auch die freie Säure, 2. B,
Phosphorsäure, zusetzen, die bei der Neutralisation mit
einer geeigneten Base, z, B. NaOH, KOH oder NH4OH, zur Phosphatbildung führt In bestimmten Fällen, z. B.
wenn CTP und Phosphorylcholin verwendet werden, ist
es nicht notwendig, Phosphationen zuzugeben, da die erforderlichen Phosphationen vom CTP oder Phospho rylcholtn geliefert werden.
Die Phosphationenkonzentration ist ebenfalls nicht
besonders kritisch und kann je nach den Erfordernissen über einen weiten Bereich variiert werden. Zur Erreichung optimaler Ergebnisse wird eine Phosphationenkonzentration von 2 g/Liter bis 200 g/Liter, vorzugsweise 10 g/Liter bis 40 g/Liter, empfohlen. Die Konzentration der Magnesium- und/oder Manganioi.sn, die vorzugsweise als anorganische Salze, z.B.
' Magnesiumsulfat oder Mangansulfat, zugesetzt werden, liegt vorzugsweise im Bereich von 0,001 g/Liter bis 3 g/Liter. Wird das Enzym oder Enzymsystem nicht in gereinigtem Zustand zugesetzt, so kann man auf gesonderte Zugabe von Magnesium- oder Mangan ionen verzichten, da diese im Enzympräparat enthalten sind.
Die genannten Hefen, Bakterien und/oder Pilze
werden im Verfahren der Erfindung in einer solchen Form verwendet, daß deren Enzymsysteme unter den Vergärungsbedingungen leicht in das wäßrige Nährmedium abgegeben werden können. Geeignete Formen der Hefen, Bakterien oder Pilze erhält man z. B. durch
jo Trocknen, Plasmolyse, Behandlung mit einem Lösungsmittel, wie Aceton, Extraktion, Behandlung mit einer grenzflächenaktiven Verbindung oder Ultraschallbehandlung. Vorzugsweise werden Hefen-, Bakterienoder Pilzzellen verwendet, die bei industriellen Fermen-
J5 tationsprozessen als Nebenprodukte anfallen und als Acetontrockenpulver gewonnen werden. Natürlich können auch flüssige Extrakte aus den genannten Hefen, Bakterien oder Pilzen verwendet werden, deren Ze'len mechanisch, durch Ultraschall oder durch Behandlung mit bakteriolytisch wirkenden Enzyrren zerstört wurden.
Das wäßrige Reaktionsmedium wird ferner mit einem oder mehreren vergärbaren Zuckern, wie Glucose, Fructose, Saccharose oder Maltose, versetzt Wenn das erfindungsgemäße Verfahren in Abwesenheit von vergärbaren Zuckern durchgeführt wird, ist die Ausbeute an CDP-Cholin geringer. Der vergärbare Zucker wird vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 5 g/Liter bis 100 g/Liter dem wäßrigen Reaktions medium zugesetzt.
Nach der Zugabe der vorgenannten Bestandteile zum Reaktionsmedium wird der pH-Wert mit einer Säure oder Lauge auf 5,0—9,0, vorzugsweise 7,0—7,2, eingestellt. Die Vergärung kann bei Normaltemperatur oder bei mäßig erhöhten Temperaturen, z. B. 20 bis 55° C, durchgeführt werden, bis sich eine wesentliche Menge von CDP-Cholin gebildet hat. Die Vergärungszeit hängt von der Vergärungstemperatur und dem pH-Wert ab, beträgt aber im allgemeinen etwa 0,5 bis 10 Stunden. Die Bildung von CDP-Cholin kann durch Dünnschichtchromatographie oder durch andere geeignete Anylsenverfahren verfolgt werden.
Nach der Beendigung der Vergärung werden die Bakterien, Pilze oder Feststoffe aus der Gärmaische entfernt, und das CDP-Cholin wird mit Hilfe eines lonenaustauscherharzes in bekannter Weise abgetrennt und gewonnen. Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
30 ml eines Reaktionsmediums vom pH-Wert 7,0 enthielten 7,38 mg/ml des Dinatriumsalzes von CMP, 24 mg/ml ChoHn, 10 mg/ml Glucose, 100 mg/ml aceton- s getrocknete Zellen von Brevibacterium ammoniagenes A.T.C.C. 6872, 11,6 mg/ml Kaliumdihydrogenphosphat, 20 mg/ml Dikaliumhydrogenphosphat und 2JS6 mg/ml Magnesiumsulfat (MgSO4 · 7 H2O). Dieses Gemisch befand sich in einem 250 ml fassenden Erlenmeyerkolben und wurde 4 Stunden bei 300C inkubiert Aus 50 Erlenmeyerkolben wurden etwa 1,5 Liter Gärmaische erhalten.
Aus der entstandenen Gärmaische wurden die Feststoffe abfiltriert. J ,2 Liter des Filtrats mit 3,8 mg/ml CDP-Cholin wurden mit 0,5 η KOH-Lösung auf den pH-Wert 8,5 eingestellt Das Filtrat wurde an einer Säule, die mit dem stark basischen Anionenaustauscherharz Dowex 1x2 (Ameisensäure-Form) beschickt war, chromatographiert Nach dem Waschen des Harzes mit Wasser wurde die Säule mit einem Ameisensäure-Gradienten eluiert, wobei die AmeiEensäurekonzentration bis 0,04 η anstieg. Die mit Hilfe dieses Gradienten eluierte CDP-Cholin enthaltende Fraktion wurde mit Aktivkohle behandelt. Dann wurde mit Aceton eluiert. Das Eluat wurde eingedampft und getrocknet Man erhielt 13 g CDP-Cholin als weißes Pulver.
Beispiel 2
Beispiel 1 wurde ohne Glucosezusatz wiederholt. Man erhielt nur 03 mg/ml CDP-Cholin. Züchtete man in einem Reaktionsmedium, das außerdem kein Dinatriumsalz von CMP und kein Cholin enthielt, so konnte keine Bildung von CDP-Cholin festgestellt werden (weniger als 0,05 mg/ml).
Beispiel 3
Beispiel 1 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß anstelle des Dinatriumsalzes von CMP 4 mg/ml Cytidin verwendet wurden. Man erhielt 0,5 bis 0,6 mg/ml CP-Cholin.
Beispiele 4bis 19
Beispiel 1 wurde wiederholt, ab tr anstelle der Zellkörper von Brevibacterium ammoniagenes wurden Zellkörper der in Tabelle I angeführten Mikroorganismen verwendet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt.
Tabelle I Beispiel Stamm
Menge en
gebildetem
CDP-Cholin
(mg/ml)
Beispiel
Nr.		 Stamm Menge an
gebildetem
CDP-Cholin
(mg/ml)
4 Escherichia coli
A.T.C.C. 21148 		2,5
5 Serratia marcescens
A.T.C.C. 21213 		0,7
6 Aerobacter aerogenes
A.T.C.C. 21217 		0,6
7 Corynebacterjum glutamicum
A.T.C.C. 13287 		0,9
8 Arihrobacter simplex
A.T.C.C. 15799 		0,7
50
55
60
65
9 Micrococcus sodonensis 0,5 A.T.C.C. 11880
10 Pseudomonas fluorescens 0,7 A.T.C.C. 21256
11 Bacillus subtilis 0,6 A.T.C.C. 15512
12 Nocardia globerula 0,8 A.T.C.C. 21022
13 Stretntomyces ambofaciens 0,8 A.T.C.C. 15154
14 Penicillium chrysogenum 0,9 A.T.C.C. 15241
15 Aspergillus terreus 0,6 A.T.C.C. 1012
16 Aspergillus flavus 0,5 A.T.C.C. 13698
17 Gibberella fujikuroi 1,2 A.T.C.C. 20136
18 Rhizopus delemar 0,5 A.T.C.C. 20134
19 Mucor javanicus 0,5 A.T.C.C. 15242
Beispiel 20
Beispiel 1 wurde wiederholt, aber anstelle des Dinatriumsalzes von CMP wurden 8,1 mg/ml CDP verwendet. Man erhielt 4,1 mg/ml CDP-Cholin.
Beispiel 21
Beispiel 1 wurde wiederholt, aber anstelle des Dinatriumsalzes von CMP wurden 9,7 mg/ml CTP verwendet. Man erhielt 4,1 mg/ml CDP-Cholin.
Beispiele 22 bis 37
Es bildeten sich fast gleiche Mengen an CDP-Cholin wie in den Beispielen 4 bis 19 mit den dort beschriebenen Stämmen, wenn die Züchtung in 5 ml Reaktionsmedium in einem Reagenzglas unter Schütteln auf ähnliche Weise, wie in den Beispielen 4 bis 19 beschrieben, durchgeführt wurde, wobei aber anstelle von CMP 8,1 mg/ml CDP oder 9,7 mg/ml CTP ■"erwendet wurden.
Beispiele 38 bis 43
In einem 250 ml fassenden Erlenmeyerkolben be.fanden sich 30 ml eines Reaktionsmediums vom pH-Wert 7,0. Es enthielt 8,1 mg/ml CDP, 24 mg/ml Cholin,
10 mg/ml GLcose, 100 mg/ml acetongetrocknete Zellkörper der in Tabelle II aufgeführten Mikroorganismen, 11,6 mg/ml Kaliumdihydrogenphosphat, 20 mg/ml Dikaliumhydrogenphosphat und 236 mg/ml MgSO4 · 2 H2O. Man züchtete 4 Stunden bei 300C. Die Feststoffe wurden von der Gärmaische abfiltriert. Die Konzentration von CDP-Cholin im Filtrat ist in Tabelle
11 angegeben.
Tabelle II
Beispiel Stamm
Nr.
Beispiel Stamm
Nr.
Menge an
gebildetem
CDP-Cholin
(mg/ml)
4J Saccharomyces cerevisiae 3,6
A.T.C.C. 15248
45 Saccharomyces lactis 3,3 A.T.C.C. 12425
46 Tonjlopsis sphaerica 3.1 A.T.C.C. 8549
47 Zygosaccharornyces major 1,7 (Synonym Saccharomyces rouxii)
A.T.C.C. 15249
Menge an gebildetem CDP-Cholin
(mg/ml) Beispiel Stamm
Nr.
Menge an
gebildetem
CDP-Cholin
(mg/ml)
38 Saccharomyces cerevisiae 3,7 A.T.C.C. 15248
39 Saccharomyces lactis 2,3 A.T.C.C. 12425
40 Torulopsis sphaerica 2,8 A.T.C.C. 8549 n
41 Zygosaccharomyces major 2.1 (Synonym Saccharomyces rouxii)
A.T.C.C. 15249
42 Kloeckera africana 1.2 :" A.T.C.C. 16512
13 Candida guilliermondii 1,1
A.T.C.C. 9058
Beispiele 44 bis 49
Die Beispiele 38 bis 43 wurden wiederholt, anstelle von CDP wurden jedoch 9.7 mg/ml CTP verwendet. Man erhielt folgende Ergebnisse. in
Tabelle III
48 Kloeckera africana 1,2 A.T.C.C. 16512
49 Candida guilltermondii 1,3 A.T.C.C 9058
Beispiele 50 bis 5.5
Ein 250 ml fassender Erlenmeyerkolben enthielt 30 ml eines Reaktionsmediums vom pH-Wert 7,0. Es enthielt 7.38 mg/ml des Dinatriumsalzes von CMP, 24 mg/ml Cholin. 10 mg/ml Glucose, 100 mg/ml acetongetrocknete Zellkörper der in Tabeiie iV aufgeführten Mikroorganismen, 11,6 mg/ml Kaliumdihydrogenphosphat, 20 mg/ml Dikaliumhydrogenphosphat und 2.96 mg/ml MgSO4 ■ 2 H2O. Man züchtete 4 Stunden bei 30"C. Die in der Gärmaische enthaltenen Feststoffe wurden abfiltriert. Die Konzentration von CDP-Cholin im Filtrat ist in Tabelle IV angegeben.
Tabelle IV
Beispiel Stamm
Menge an
gebildetem
CDP-Cholin
(mg/ml)
50 Saccharomyces cerevisiae 3,6 A.T.C.C. 15248
51 Saccharomyces lactis 2,2 A.T.C.C. 12425
52 Torulopsis sphaerica 2,8 A.T.C.C. 8549
53 Zygosaccharomyces major 2,1 (Synonym Saccharomyces rouxii)
A.T.C.C. 15249
54 Kloeckera africana 1.3 A.T.C.C. 16512
55 Candida guilliermondii 1,1 A.T.C.C. 9058

Claims (1)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung von Cytidin-5'-diphospho-cholin, dadurch gekennzeichnet, daß man bei Temperaturen von 20 bis 55° C und einem pH-Wert vor 5,0 bis 9,0 ein wäßriges Reaktionsmedium vergärt, das
a) Cholin und/oder Phosphorylcholin,
b) Cytidin, Cytidin-5'-monophosphat, Cytidin-5'-diphosphat und/oder Cytidin-S'-triphosphat,
c) Enzyme von
Brevibacterium ammoniagenes A.T.CC 6872 Escherichia coli A.T.CC 21148 Serratia marcescens A.T.CC 2123 Aerobacter aerogenes A.T.CC 21217 Corynebacterium glutamicum A.T.CC. 13287 Arthrobacter simplex A.T.CC 15799 Micrococcus sodonensis A.T.CC 11880 Pseudomonas fluorescens A.T.CC 21256 Bacillus subtilis A.T.CC 15512 Nocardia globerula A.T.CC 21022 Streptomyces ambofaciens A.T.CC. 14154 Penicillium chrysogenum A.T.CC. 15241
10
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