DE1300896B - Verfahren zur biochemischen Herstellung von 5'-Guanylsaeure, Guanosindiphosphat und Guanosintriphosphat - Google Patents

Description

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur bio- Metallionen zugegen sind. Schließlich, ist zu bemerken,

chemischen Herstellung von 5'-Guanylsäure, Guanosin- daß in dem Falle, daß die vorhandene Calciummenge

diphosphat und Guanosintriphosphat durch Züchten unterhalb der angemessenen zulässigen Menge liegt,

eines Mikroorganismus in einem hierfür üblichen die angesammelte Produktmenge selbst dann geringer Guanin enthaltenden Nährmedium. 5 wird, wenn die vorhandene Manganmenge für die

Aus der französischen Patentschrift 1 316 247 ist Ansammlung optimal ist.

bereits die biochemische Herstellung von 5'-Guanyl- Die in Verbindung mit den obengenannten Mikrosäure durch Züchten von Mikroorganismen in einem Organismenstämmen zu verwendenden zulässigen Kohlenhydrate, 'Stickstoff substanzen und Mineralsalze Mengen der Metallionen lassen sich daher nur durch enthaltenden Nährmedium bekannt, wobei beim Ein- io bestimmte Konzentrationen oder Konzentrationssatz von 5% Glucose 1800 mg 5'-Guanylsäure/l er- bereiche definieren. Unter diesen Metallen üben äußerst halten werden. geringe Mengen an Mn⁺⁺ einen besonders großen

Ziel der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren Einfluß auf die Produktausbeute aus.
zur biochemischen Herstellung von 5'-Guanylsäure, Es ist also ersichtlich, daß das Mengenverhältnis Guanosindiphosphat und Guanosintriphosphat, wo- 15 der vier Metallionen zueinander eine wichtige Rolle durch sich eine höhere Ausbeute an diesen Substanzen spielt und daß nur bei Einhaltung der bestimmten erzielen läßt. Mengenverhältnisse bemerkenswert große Produkt-Erfindungsgemäß wurde gefunden, daß 5'-Guanyl- mengen angesammelt werden können,
säure, Guanosindiphosphat und Guanosintriphosphat Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung des in höherer Ausbeute erhalten werden können, wenn 20 erfindungsgemäßen Verfahrens. Wenn nicht anders man bestimmte Mikroorganismen in Gegenwart von angegeben, beziehen sich die Prozentangaben auf das bestimmten Metallionen und bei ganz bestimmten Gewicht, bezogen pro Liter Nährmedium. Die AnKonzentrationen dieser Metallionen in einem sonst gaben über die angesammelten Mengen von 5'-Guanylüblichen Guanin enthaltenden Nährmedium züchtet. säure, Guanosindiphosphat und Guanosintriphosphat Das Verfahren zur biochemischen Herstellung von 25 beziehen sich auf mg/ccm in Form von GMP · Na₂, 5'-Guanylsäure, Guanosindiphosphat und Guanosin- GDP und GTP.
triphosphat durch Züchten eines Mikroorganismus in

einem hierfür üblichen Guanin enthaltenden Nähr- Beispiel 1
medium ist nun erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet, daß man Brevibacterium ammoniagenes 30 Es wird Brevibacterium ammoniagenes ATCC15750 ATCC 15750 in Gegenwart von 2 mg/1 Fe⁺⁺, 10 bis gezüchtet. Die Bakterien werden zunächst in einem 30fig/l Mn⁺+, 2,7 mg/1 Ca++ und 100 bis 300 [LgJl Impf medium gezüchtet, das 2 % Glucose, eine Lösung Zn⁺⁺, Brevibacterium ammoniagenes ATCC 15751 in eines Aminosäuregemisches (je 70 μg/l der folgenden Gegenwart von 3 mg/1 Fe⁺⁺, 20 μg/l Mn⁺+, 2,7 mg/1 Aminosäuren; Glycin, L-Alanin, L-Asparaginsäure, Ca⁺⁺ und 250 μg/l Zn⁺+ oder Micrococcus sodonensis 35 L-Tryptophan, L-Phenylalanin, L-Pyrolin, L-Histidin, ATCC 19212 in Gegenwart von 12 mg/1 Fr⁺⁺, L-Lysin, L-Arginin, L-Valin, L-Leucin und L-Iso-2,8 mg/1 Mn++ 1,4 mg/1 Ca++ und 15 μg/l Zn++ im leucin), 0,1% K₂HPO₄, 0,03% MgSO₄ · 7 H₂O, Nährmedium züchtet. 0,25% NaCl, 0,0005% FeSO₄, 0,4 μg/ccm MnSO₄ · Um dem Nährmedium die genannten Mengen der 4 H₂O, 30 μg/l Biotin, 2 μg/ccm /7-Alanin, 1 μg/ccm Metallionen einzuverleiben, ist es erforderlich, defi- 40 Thiaminhydrochlorid und 0,2% Harnstoff enthält, nierte Mengen dieser Ionen in Form der Metallsulfate Der pH-Wert des Impfmediums wird vor der Sterili- oder -chlorate zuzugeben. In Fällen, wo ein Teil sierung auf 7,3 eingestellt. Der Harnstoff wird gesondieser Metalle, wie z. B. Mangan oder Zink, als dert von den anderen Bestandteilen sterilisiert und Verunreinigung in anderen Bestandteilen des Nähr- zu dem sterilisierten Impfmedium gegeben. Die Mikromediums enthalten ist, wie z. B, als Verunreinigung 45 Organismen werden in dem sterilisierten Impfmedium von Kaliumphosphat und Magnesiumsalzen, brauchen 24 Stunden bei einer Temperatur von 30⁰C gezüchtet, diese Ionen dem Medium nicht besonders zugegeben Das verwendete Fermentationsmedium hat die folzu werden. Wie die obengenannten Zahlenwerte gende Grundzusammensetzung:
zeigen, sind die zu verwendenden zulässigen Mengen

an Mangan und Zink bemerkenswert geringer als die- 50 Glucose 10 %

jenigen der anderen beiden Metalle, so daß die Mengen jr jjpn 12°/

dieser Ionen, die als Verunreinigung in den Bestand- L. * ' ."

teilen eines Nährmediums enthalten sind, in einigen KH₂PU₄ 1,2 /₀

Fällen ausreichen. Unter diesen beiden Metallen ist MgSO₄ · 7 H₂O 1>2%

die zu verwendende Menge an Mangan besonders 55 Biotin 30 μg/l

gering, hat jedoch nichtsdestoweniger einen bedeut- /3-Alanin 10 μg/ml

samen Einfluß auf das Wachstum der Mikro- Thiaminhydrochlorid '.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'. 5 jxg/ml
organismenstamme und die Produktausbeute. Wenn
die Menge an Mangan die zulässige Grenze überschreitet, wird das Wachstum der Mikroorganismen- 60 Fe++, Mn++ und Zn++ werden in Form ihrer

stamme so übermäßig beschleunigt, daß sich die an- Sulfate und Ca⁺+ in Form von CaCl₂ in verschiedenen

gesammelte Menge an Produkt beträchtlich ver- Konzentrationen zugegeben. Der pH-Wert des Fer-

ringert. Wenn jedoch die Menge an Mangan innerhalb mentationsmediums wird mit 5 n-NaOH auf 8,5 ein-

der genannten Konzentrationen geregelt wird, wird gestellt. Nach der Sterilisation des Mediums wird

eine gute Produktausbeute erhalten. Es muß jedoch 65 Harnstoff, der gesondert sterilisiert worden ist, zu

noch erwähnt werden, daß diese zuletzt genannte gute dem Fermentationsmedium in einer solchen Menge

Produktausbeute nur dann erhalten wird, wenn auch zugegeben, daß die Konzentration 0,6% in bezug auf

die zulässigen, definierten Mengen der anderen drei das Fermentationsmedium beträgt.

Die Impfkultur wird zu dem Fermentationsmedium in einer Menge von 10 Volumprozent gegeben. Das Fermentationsmedium wird dann in verschiedene gesonderte 250-ccm-Erlenmeyerkolben gegossen. Es wird dann durch aerobe Schüttelkultur bei einer Temperatur von 30⁰C gezüchtet. Nach 72stündigem Züchten wird Guanin in einer Menge von 4 mg/ccm zu dem Fermentationsmedium zugegeben.

Die Mengen an GMP, die sich in dem Fermentationsmedium nach weiterem 12 stündigem Züchten nach der Zugabe des Guanins angesammelt haben, sind in der Tabelle angegeben. Neben den in der Tabelle genannten Mengen an GMP ließen sich als Nebenprodukte weiter GDP und GTP feststellen.

Tabelle

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Ver	Fe++	Mn++	Ca++	Zn++	GMP
such	mg/1	ven	mg/1	μg/l	mg/ml
1	0	30	2,7	100	0,5
2	2	0	2,7	100	2,3
3	2	30	0	100	Spur
4	2	30	2,7	0	3,2
5	2	10	2,7	100	1,6
6	2	30	2,7	100	10,1
7	2	100	2,7	100	Spur
8	2	10	2,7	300	10,5
9	2	10	2,7	600	Spur

30

Beispiel 2

Es wird Brevibacterium ammoniagenes ATCC15751 gezüchtet. Die Herstellung der Impfkultur und die Fermentation werden unter den gleichen Bedingungen wie im Beispiel 1 unter Verwendung von 3 mg/1 Fe⁺⁺, 20μg/l Mn++, 2,7 mg/ml Ca++ und 250 pg/1 Zn++ durchgeführt. 4,0 mg/ccm Guanin werden nach 72 stündigem Züchten zugegeben. Nach insgesamt 96 stündigem Züchten wird gefunden, daß sich in der Kulturflüssigkeit 10,6 mg/ml GMP, 0,1 mg/ml GDP und 1,1 mg/ml GTP angesammelt haben.

Beispiel 3

45

Micrococcus sodonensis ATCC 19212 wird gezüchtet. Es wird zunächst in einem Impfmedium gezüchtet, das 2% Glucose, 0,7% Caseinaminosäuren, 0,03% MgSO₄ · 7 H₂O₅ 0,1% K₂HPO₄, 0,001% FeSO₄ · 6 H₂O, 1 μg/ccm MnSO₄ · 4 H₂O, 30 μg/l Biotin und 0,2% Harnstoff enthält. Der pH-Wert des Impfkulturmediums wird vor der Sterilisierung auf 7,3 eingestellt. Der Harnstoff wird gesondert von den anderen Bestandteilen sterilisiert und zu dem sterilisierten Impfmedium gegeben.

Die Grundzusammensetzung des verwendeten Fermentationsmediums ist wie folgt:

Glucose 10%

K₂HPO₄ 0,6%

KH₂PO₄ 0,6%

MgSO₄ -7H₂O 0,6%

Biotin 30μg/l

Nach 48 stündigem Züchten werden 2 mg/ccm Guanin zu dem Fermentationsmedium gegeben und 12 mg/1 Fe++, 2,8 mg/1 Mn++, 1,4 mg/1 Ca++ und

60 15 μg/l Zn++ werden verwendet. Nach 72 stündigem Züchten haben sich 3,9 mg/ccm GMP in der Fermentationsfiüssigkeit angesammelt.

Aus den obigen Beispielen ist ersichtlich, daß erfindungsgemäß sowohl künstliche Nährmedien als auch natürliche Medien geeignet sind, solange sie nur die für das Wachstum der verwendeten Mikroorganismenstämme wesentlichen Nährstoffe enthalten. Diese Nährstoffe sind wohlbekannt. Dazu gehören Substanzen wie Quellen für Kohlenstoff, Quellen für Stickstoff, anorganische Verbindungen u. dgl., die von dem verwendeten Mikroorganismus in geeigneten Mengen verwertet werden. Als Quelle für Kohlenstoff können z. B. erwähnt werden Kohlenhydrate, wie Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Stärke, Stärkehydrolysat, Melassen usw. oder irgendwelche anderen geeigneten Kohlenstoffquellen, wie z. B. Glycerin, Mannit, Sorbit, organische Säuren, Glutaminsäure usw. Diese Substanzen können entweder allein oder in Form von Gemischen aus zwei oder mehreren dieser Substanzen verwendet werden. Als Quelle für Stickstoff können die verschiedenartigsten anorganischen oder organischen Salze oder Verbindungen, wie z. B. Harnstoff oder Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumphosphat usw., oder Aminosäuren bzw. Aminosäuregemische, oder natürliche stickstoffhaltige Substanzen, wie z. B. Maisquellwasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, Caseinhydrolysate, Caseinaminosäuren, Fischextrakte, Reiskleieextrakt usw. verwendet werden. Auch diese Substanzen können entweder allein oder in Form von Mischungen aus zwei oder mehreren dieser Substanzen verwendet werden. Anorganische Verbindungen außer den Metallionen der vorliegenden Erfindung, die zu dem Nährmedium gegeben werden können, sind unter anderem Magnesiumsulfat, Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat oder Natriumchlorid usw. Weiterhin müssen dem Medium Nährstoffe zugesetzt werden, die für das Wachstum des jeweils verwendeten Mikroorganismenstammes wesentlich sind, wie z. B. Histidin oder Adenin. Wie in der Fermentationstechnik üblich, können dem Medium weiterhin wachstumsfördernde Mittel, wie z. B. Biotin oder Aminosäuren, wie z. B. Glutaminsäure oder Asparaginsäure, zugesetzt werden.

Die Fermentation wird unter in der Fermentationstechnik üblichen aeroben Bedingungen, wie z. B. in Form einer aeroben Schüttelkultur oder unter Rühren einer Submerskultur unter Einführung von sterilisierter Luft, bei einer Temperatur von etwa 20 bis 40⁰C und einem pH-Wert von etwa 5 bis 9 durchgeführt.

Nach Beendigung der Fermentation können 5'-Guanylsäure, Guanosindiphosphat und Guanosintriphosphat nach üblichen Verfahren aus der Fermentationsflüssigkeit isoliert werden, wie z. B. durch Behandlung mit Ionenaustauschharzen, Extraktion mit Lösungsmitteln, Fällung mit Metallsalzen, Chromatographie u. dgl.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur biochemischen Herstellung von 5'-Guanylsäure, Guanosindiphosphat und Guanosintriphosphat unter Züchten eines Mikroorganismus in einem hierfür üblichen Guanin enthaltenden Nährmedium, dadurch gekennzeich-

   5 6

   net, daß man Brevibacterium amraoniagenes 20 μg/l Mn⁺+, 2,7 mg/1 Ca⁺+ und 250 μg/l Zn⁺⁺

   ATCC 15750 in Gegenwart von 2 mg/1 Fe⁺⁺, oder Micrococcus sodonensis ATCC 19212 in

   10 bis 30 μg/l Mn++, 2,7 mg/1 Ca++ und 100 bis Gegenwart von 12 mg/1 Fe++, 2,8 mg/1 Mn++,

   300 μg/l Zn++, Brevibacterium ammoniagenes 1,4 mg/1 Ca++ und 15 μg/l Zn++ im Nährmedium

   ATCC 15751 in Gegenwart von 3 mg/1 Fe++, 5 züchtet.