DE1300895B

DE1300895B - Verfahren zur biochemischen Herstellung von 5'-Inosinsaeure

Info

Publication number: DE1300895B
Application number: DE1966K0058379
Authority: DE
Inventors: Misawa Masanaru; Nara Takashi; Komuro Toshio
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1965-02-10
Filing date: 1966-02-10
Publication date: 1969-08-14
Also published as: DE1298072B; FR1554572A; DE1300896B; GB1111891A

Description

1 2

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur bio- an Produkt beträchtlich verringert. Wenn jedoch die

chemischen Herstellung von 5'-Inosinsäure durch Menge an Mangan innerhalb der genannten Konzen-

Züchten eines Mikroorganismus in einem üblichen trationen geregelt wird, wird eine gute Produkt-

Hypoxanthin enthaltenden Nährmedium. ausbeute erhalten. Es muß jedoch noch erwähnt

Aus der britischen Patentschrift 979141 ist bereits 5 werden, daß diese zuletzt genannte gute Produktdie biochemische Herstellung von 5'-Inosinsäure durch ausbeute nur dann erhalten wird, wenn auch die zu-Züchten von Mikroorganismen in einem Kohlen- lässigen definierten Mengen der anderen drei Metallhydrate, Stickstoffsubstanzen und Mineralsalze ent- ionen zugegen sind. Schließlich ist zu bemerken, daß haltenden Nährmedium bekannt, wobei beim Einsatz in dem Falle, daß die vorhandene Calciummenge von 5°/o Maltose 2,3 mg/ml 5'-Inosinsäure erhalten io unterhalb der angemessenen zulässigen Menge liegt, werden. die angesammelte Produktmenge selbst dann geringer

Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren wird, wenn die vorhandene Manganmenge für die An-

zur biochemischen Herstellung von 5'-Inosinsäure, Sammlung optimal ist.

wodurch sich eine höhere Ausbeute an 5'-Inosinsäure Die in Verbindung mit den obengenannten Mikroerzielen läßt. 15 Organismenstämmen zu verwendenden zulässigen

Erfindungsgemäß wurde gefunden, daß die 5'-Inosin- Mengen der Metallionen lassen sich daher nur durch

säure in höherer Ausbeute erhalten werden kann, wenn bestimmte Konzentrationen oder Konzentrations-

man bestimmte Mikroorganismen in Gegenwart von bereiche definieren. Unter diesen Metallen üben

bestimmten Metallionen und bei ganz bestimmten äußerst geringe Mengen an Mn⁺⁺ einen besonders Konzentrationen dieser Metallionen in einem sonst 20 großen Einfluß auf die Produktausbeute aus.

üblichen Hypoxanthin enthaltenden Nährmedium Es ist also ersichtlich, daß das Mengenverhältnis

züchtet. der vier Metallionen zueinander eine wichtige Rolle

Das Verfahren zur biochemischen Herstellung von spielt und daß nur bei Einhaltung der bestimmten

5'-Inosinsäure durch Züchten eines Mikroorganismus Mengenverhältnisse bemerkenswert große Produktin einem hierfür üblichen, Hypoxanthin enthaltenden 25 mengen angesammelt werden können.

Nährmedium ist nun erfindungsgemäß dadurch ge- Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung

kennzeichnet, daß man Brevibacterium ammoniagenes des erfindungsgemäßen Verfahrens. Wenn nicht anders

ATCC15750 in Gegenwart von 2 mg/1 Fe++, 10 bis angegeben, beziehen sich die Prozentangaben auf

30 μg/l Mn++, 2,7 mg/1 Ca++und 100 bis 300 μg/l Zn⁺+, das Gewicht, bezogen pro Liter Nährmedium. Die Brevibacterium ammoniagenes ATCC15751 bzw. 30 Angaben über die angesammelten Mengen der

ATCC 6871 in Gegenwart von 3 mg/1 Fe⁺+, 20^g/l 5'-Inosinsäure (IMP) beziehen sich auf mg :ccm in

Mn⁺+, 2,7 mg/1 Ca⁺+ und 250 μg/I Zn++, Brevibac- Form von IMP-Na₂ · 7V₂ H₂O.

terium ammoniagenes ATCC 6872 in Gegenwart von . .

2,5 mg/1 Fe++ 10 bis 60 μg/^ Mn++ 2,7m mg/I Ca++ B e 1 s ρ 1 e 1 1

und 40 bis 300 μg/l Zn++, Micrococcus sodenensis 35 Es wird Brevibacterium ammoniagenes ATCC15750

ATCC15932 in Gegenwart von 12 mg/1 Fe++, 0,28 gezüchtet. Die Bakterien werden zunächst in einem

bis 2,8 mg/1 Mn⁺+, 1,4 mg/1 Ca++ und 10 bis 50 μg/l Impf medium gezüchtet, das 2°/₀ Glucose, eine Lösung

Zn++, Aspergillus sojae 16320 in Gegenwart von eines Aminosäuregemisches (je 70 μg/l der folgenden

2 mg/1 Fe++, 1,5 bis 15 μg/l Mn++, 2,7 mg/1 Ca++ und Aminosäuren: Glycin, L-Alanin, L-Asparaginsäure,

10 bis 150μg/l Zn++, Brevibacterium ammoniagenes 40 L-Typtophan, L-Phenylalanin, L-Prolin, L-Histidin,

ATCC15187 in Gegenwart von 2 mg/1 Fe++, 10 bis L-Lysin, L-Arginin, L-Valin, L-Leucin und L-Isoleu-

30 μg/l Mn++, 2,7 mg/1 Ca++und 100 bis 300 μg/l Zn++ ein), 0,1 °/₀ K₂HPO₄, 0,03 % MgSO₄ · 7H₂O, 0,25%

oder Brevibacterium ammoniagenes ATCC15312 in NaCl, 0,0005 % FeSO₄, O^g/ccm MnSO₄-4H₂O,

Gegenwart von 2 mg/I Fe++, 30 μg/l Mn++, 2,7 mg/1 30 μg/l Biotin, 2 μg/ccm /9-Alanin, 1 μg/ccm Thiamin-

Ca++und 100 μg/l Zn++im Nährmedium züchtet. 45 hydrochloric und 0,2% Harnstoff enthält. Der pH-

Um dem Nährmedium die genannten Mengen der Wert des Impfmediums wird vor der Sterilisierung

Metallionen einzuverleiben, ist es erforderlich, de- auf 7,3 eingestellt. Der Harnstoff wird gesondert von

finierte Mengen dieser Ionen in Form der Metall- den anderen Bestandteilen sterilisiert und zu dem

sulfate oder -chloride zuzugeben. In Fällen, wo ein sterilisierten Impfmedium gegeben. Die Mikroorga-

Teil dieser Metalle, wie z. B. Mangan oder Zink, als 50 nismen werden in dem sterilisierten Impfmedium

Verunreinigung in anderen Bestandteilen des Nähr- 24 Stunden bei einer Temperatur von 3O⁰C gezüchtet, mediums enthalten ist, wie z. B. als Verunreinigung

von Kaliumphosphat und Magnesiumsalzen, brauchen Das verwendete Fermentationsmedium hat die fol-

diese Ionen dem Medium nicht besonders zugegeben gende Grundzusammensetzung:

zu werden. Wie die obengenannten Zahlwerte zeigen, 55 10% Glucose,

sind die zu verwendenden zulässigen Mengen an Man- ₀. '

gan und Zink bemerkenswert geringer als diejenigen ¹^ '° K₂HrO₄,

der anderen beiden Metalle, so daß die Mengen dieser 1,2% KH₂PO₄,

Ionen, die als Verunreinigung in den Bestandteilen ^ 20/ MgSO · 7H O

eines Nährmediums enthalten sind, in einigen Fällen 60 . . *' ² '

ausreichen. Unter diesen beiden Metallen ist die zu 30 μg/l Biotin,

verwendende Menge an Mangan besonders gering, 10 μg/ccm/S-Alanin,

hat jedoch nichtsdestoweniger einen bedeutsamen .

Einfluß auf das Wachstum der Mikroorganismen- ⁵ ^'^ccm Thiammhydrochlond,

stamme und die Produktausbeute. Wenn die Menge 65 4,5 mg/cem Hypoxanthin. an Mangan die zulässige Grenze überschreitet, wird

das Wachstum der Mikroorganismenstämme so über- Fe++, Mn++ und Zn++ werden in Form ihrer Sulfate

mäßig beschleunigt, daß sich die angesammelte Menge und Ca++ in Form von CaCl₂ in verschiedenen Kon-

zentrationen zugegeben. Der pH-Wert des Fermentationsmediums wird mit 5 n-NaOH auf 8,5 eingestellt. Nach der Sterilisation des Mediums wird Harnstoff, der gesondert sterilisiert worden ist, zu dem Fermentationsmedium in einer solchen Menge gegeben, daß die Konzentration 0,6 % in bezug auf das Fermentationsmedium beträgt.

Die Impf kultur wird zu dem Fermentationsmedium in einer Menge von 10 Volumprozent gegeben. Das Fermentationsmedium wird dann in verschiedene 250-ccm-Erlenmeyerkolben gegossen. Es wird dann durch aerobe Schüttelkultur bei einer Temperatur von 3O⁰C gezüchtet. Nach 96stündigem Züchten haben sich die in Tabelle I angegebenen Mengen IMP in der Fermentationsflüssigkeit angesammelt.

Tabelle I Tabelle II

Ver	Fe⁺+	Mn++	Ca⁺+	Zn++	IMP
such	mg/1	μβ/ι	mg/1	μβΛ	mg/ccm
1	0	30	2,7	100	0,8
2	2	0	2,7	100	5,2
3	2	30	0	100	Spur
4	2	30	2,7	0	5,9
5	2	10	2,7	100	10,2
6	2	30	2,7	100	17,2
7	2	100	2,7	100	Spur
8	2	10	2,7	300	18,5
9	2	30	2,7	300	1,3

Beispiel 2

Es wird Brevibacteriumammoniagenes ATCC15751 gezüchtet. Die Herstellung der Impfkultur und die Fermentation werden unter den gleichen Bedingungen wie im Beispiel 1 unter Verwendung von 3 mg/1 Fe⁺⁺, 20 jxg/1 Mn++, 2,7 mg/1 Ca++ und 250 pg/i Zn⁺+ durchgeführt. 4,0 mg/ccm Hypoxanthin werden zu dem Fermentationsmedium zu Beginn des Züchtens zugesetzt. Nach 96stündigemZüchtenwerden 17,6 mg/ccm IMP in der Kulturlösung angesammelt gefunden.

Beispiel 3

Es wird Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6871 gezüchtet. Die Züchtung wird unter den gleichen Züchtungsbedingungen wie im Beispiel 1 vorgenommen, mit der Ausnahme, daß 3,0 mg/ccm Hypoxanthin zu Beginn der Züchtung zugegeben und die im Beispiel 2 genannten Mengen an Fe⁺⁺, Mn⁺+, Ca⁺⁺ und Zn⁺⁺ verwendet werden. Nach 96stündigem Züchten haben sich 10,8 mg/ccm IMP in der Fermentationsflüssigkeit angesammelt.

Beispiel 4

Es wird Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 gezüchtet. Die Züchtung wird unter den gleichen Bedingungen wie im Beispiel 1 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß 1 % Fleischextrakt sowie 1 % Pepton in dem Impfmedium an Stelle der Lösung des Aminosäuregemisches verwendet und 5 mg/ccm Hypoxanthin zu Beginn zu dem Fermentationsmedium gegeben werden. Die Mengen an IMP, die sich nach 120stündigem Züchten angesammelt haben, sind in Tabelle II angegeben.

Ver	Fe⁺⁺	Mn++	Ca⁺+	Zn++	IMP
such	mg/1		mg/1	W/I	mg/ccm
10	2,5	0	2,7	40	8,2
11	2,5	10	2,7	40	11,9
12	2,5	30	2,7	40	19,6
13	2,5	60	2,7	40	7,7
14	2,5	100	2,7	40	Spur
15	0	30	2,7	40	Spur
16	2,5	30	0	40	Spur
17	2,5	10	2,7	100	17,5
18	2,5	30	2,7	300	5,2

Beispiel 5

Micrococcus sodenensis ATCC15 932 wird gezüchtet. Es wird zunächst in einem Impfkulturmedium gezüchtet, das 2% Glucose, 0,7 % Caseinaminosäuren, 0,03% MgSO₄ · 7H₂O, 0,1% K₂HPO₄, 0,001% FeSO₄-OH₂O, 1 μg/ccm MnSO₄ · 4H₂O, 30μg/l Biotin und 0,2% Harnstoff enthält. Der pH-Wert des Impfkulturmediums wird vor der Sterilisierung auf 7,3 eingestellt. Der Harnstoff wird gesondert von den anderen Bestandteilen sterilisiert und zu dem sterilisierten Impfmedium gegeben.

Die Grundzusammensetzung des verwendeten Fermentationsmediums ist wie folgt:

10 % Glucose,

0,6% K₂HPO₄,

0,6% KH₂PO₄,

0,6% MgSO₄-7H₂O,
30 μg/l Biotin,

2 mg/ccm Hypoxanthin.

Fe⁺+, Mn⁺⁺, Ca⁺+ und Zn++ werden (in den in Tabelle III genannten Mengen) in verschiedenen Konzentrationen zu dem Fermentationsmedium gegeben. Diese Ionen werden in Form ihrer Sulfate zugegeben, mit Ausnahme Ca++, das als CaCl₃ zugesetzt wird. Nach der Sterilisierung des Fermentationsmediums wird Harnstoff, der gesondert sterilisiert worden ist, hinzugegeben. Die anderen Züchtungsbedingungen sind die gleichen wie im Beispiel 1.

Die Mengen an IMP, die sich in der Kulturflüssigkeit nach 96stündigem Züchten angesammelt haben, sind in Tabelle III angegeben.

Tabelle III

Ver	Fe++	Mn+⁺	Ca⁺+	Zn⁺+	IMP
such	mg/1		mg/1	μg/l	mg/ccm
19	12	0	1,4	10	1,9
20	12	0,28	1,4	10	3,8
21	12	O Ö Z,ö	1,4	10	7,8
22	12	28,0	1,4	10	Spur
23	0	2,8	1,4	10	Spur
24	12	2,8	0	10	Spur
25	12		1,4	0	4,1
26	12	0,28	1,4	50	7,9
27	12	l,t>	1,4	150	Spur

Beispiel 6

Aspergillus sojae ATCC 16320 wird als Impf stamm verwendet. Bei diesem Stamm handelt es sich um eine

L 300 895

Mutante, die von Histidin abhängig ist. 50 ecm einer Lösung, die 8 % Saccharose, 0,1% K₂HPO₄, 0,005% MgSO₄-7H₂O, 0,2% NaNO₃, 0,05%KCl, 0,001% FeSO₄ · 7H₂O, 0,1%L-Histidinhydrochlorid und 8,2 mg/ccm IMP und 0,15 mg/ccm Hypoxanthin in dem Fermentationsmedium angesammelt haben.

Beispiel 8

Es wird Brevibacterium ammoniagenes ATCC15187 gezüchtet. Hierbei handelt es sich um einen Mutantenstamm, der von Adenin abhängig ist. Es wird das gleiche Impfmedium wie im Beispiel 1 verwendet, mit der Ausnahme, daß weiterhin 100 μg/ccm Adenin zu-

2% Agar enthält, wird in einem Rouxkolben fest werden gelassen, um ein festes Medium zu erhalten, in dem der Mikroorganismenstamm konserviert werden kann.

30 ecm sterilisierten Wassers werden in den Rouxkolben gegossen, der die vorliegenden Mikroorganis- io gegeben werden. Es wird weiterhin auch das gleiche men mit den ausreichend gebildeten Sporen enthält, Fermentationsmedium wie im Beispiel 1 verwendet,

doch werden zusätzlich 70 μg/ccm Adenin zugegeben.

Die anderen Züchtungsbedingungen sind die gleichen wie im Beispiel 1.
In der folgenden Tabelle V sind die Mengen IMP angegeben, die sich in der Fermentationsflüssigkeit nach 120stündigem Züchten angesammelt haben.

wodurch eine gleichmäßige Sporensuspension hergestellt wird. 1 ecm der so hergestellten Suspension wird in einen 250-ccm-Erlenmeyerkolben gegeben, der 30 ecm Fermentationsmedium enthält.

des Fermentations-

Die Grundzusammensetzung
mediums ist wie folgt:

10% Glucose,
1% K₂HPO₄,
IV₂ % KH₂PO₄,
1% MgSO₄-7H₂O,
0,3 % Caseinaminosäuren, 250 μg/ccm L-Histidinhydrochlorid, 5 μg/ccm ß-Alanin,

2 g/ccm Thiaminhydrochlorid,

3 mg/ccm Hypoxanthin.

Tabelle V

Der pH-Wert des Fermentationsmediums wird vor der Sterilisierung auf 8,0 eingestellt. In dieses Grundmedium werden Fe⁺+, Mn⁺+ und Zn⁺⁺ in Form ihrer Sulfate und Ca⁺+ in Form von CaCl₂ in verschiedenen Konzentrationen gegeben. Weiterhin wird Harnstoff, der gesondert sterilisiert worden ist, in einer Menge von 0,6 Gewichtsprozent zu dem Fermentationsmedium gegeben.

Ver	Fe++	Mn++	Ca++	Zn⁺+	IMP
such	mg/1	με/1	mg/1	mn	mg/ccm
37	0	30	2,7	100	Spur
38	. 2	0	2,7	100	3,0
39	2	30	0	100	Spur
40	2	30	2,7	0	5,2
41	2	10	2,7	100	5,3
42	2	30	2,7	100	8,7
43	2	100	2,7	100	Spur
44	2	10	2,7	300	8,9
45	2	30	2,7	300	Spur

Beispiel 9

Es wirdBrevibacterium ammoniagenes ATCC15 312, ein ebenfalls von Adenin abhängiger Mutantenstamm, gezüchtet. Es wird das gleiche Impfmedium wie im Beispiel 1 verwendet, mit der Ausnahme, daß weiterhin 10 μg/ccm Adenin zugegeben werden. Es wird

Die anderen Züchtungsbedingungen sind die gleichen 40 weiterhin das gleiche Fermentationsmedium wie im wie im Beispiel 1. Die Mengen an IMP, die sich in der Beispiel 1 verwendet, mit der Ausnahme, daß kein

Adenin zugegeben wird. Weiterhin werden die

Kulturfiüssigkeit in den verschiedenen Kolben nach 120stündigem Züchten angesammelt haben, sind in Tabelle IV angegeben.

Tabelle IV

Ver	Fe++	Mn++	Ca++	Zn++	IMP
such	mg/1	μΕ/1	mg/1	μβ/1	mg/ccm
28	0	15	2,7	50	Spur
29	2	0	2,7	50	4,8
30	2	15	0	50	Spur
31	2	15	2,7	0	6,2
32	2	15	2,7	50	10,9
33	2	100	2,7	50	Spur
34	2	5	2,7	50	7,3
35	2	5	2,7	150	11,2
36	2	15	2,7	300	Spur

Beispiel 7

Es wird der gleiche Impf stamm wie im Beispiel 6 verwendet. Weiterhin wird auch das gleiche Fermentationsmedium wie im Beispiel 6 verwendet, mit der Ausnahme, daß an Stelle von Hypoxanthin 3,0 mg/ccm Adenin zugegeben und 2 mg/1 Fe⁺⁺, 1,5 μg/l Mn⁺+, 2,7mg/1 Ca⁺+ und 10μg/l Zn⁺+ verwendet werden. Nach 120stündigem Züchten wird gefunden, daß sich erfindungsgemäß zugesetzten Metallionen in folgenden Mengen zugegeben: 2mg/1 Fe⁺+, 30μ§/1 Mn++, 2,7 mg/1 Ca⁴"+ und 100μg/l Zn++. Die anderen Züchtungsbedingungen sind die gleichen wie im Beispiel 1.

Als Ergebnis wird gefunden, daß sich nach 120stündigem Züchten 9,5 mg/ccm IMP in der Fermentationsflüssigkeit angesammelt haben.

Aus den obigen Beispielen ist ersichtlich, daß erfindungsgemäß sowohl künstliche Nährmedien als auch natürliche Medien geeignet sind, solange sie nur die für das Wachstum der verwendeten Mikro-Organismenstämme wesentlichen Nährstoffe enthalten. Diese Nährstoffe sind wohlbekannt. Dazu gehören Substanzen, wie Quellen für Kohlenstoff, Quellen für Stickstoff, anorganische Verbindungen u. dgl., die von dem verwendeten Mikroorganismus in geeigneten Mengen verwertet werden. Als Quellen für Kohlenstoff können z. B. erwähnt werden Kohlenhydrate, wie Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Stärke, Stärkehydrolysat, Melassen usw., oder irgendwelche anderen geeigneten Kohlenstoffquellen, wie z. B. Glycerin, Mannit, Sorbit, organische Säuren, Glutaminsäure usw. Diese Substanzen können entweder allein oder in Form von Gemisch aus zwei oder mehreren dieser Substanzen verwendet werden.

Als Quelle für Stickstoff können die verschiedenartigsten anorganischen oder organischen Salze oder Verbindungen, wie z. B. Harnstoff oder Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumphosphat usw., oder Aminosäuren bzw. Aminosäuregemische oder natürliche stickstoffhaltige Substanzen, wie z. B. Maisquellwasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Peoton, Fischmehl, Caseinhydrolysate, Caseinaminosäuren, Fischextrakte, Reiskleieextrakt usw., verwendet werden. Auch diese Substanzen können entweder allein oder in Form von Mischungen aus zwei oder mehreren dieser Substanzen verwendet werden. Anorganische Verbindungen außer den Metallionen der vorliegenden Erfindung, die zu dem Nährmedium gegeben werden können, sind unter anderem Magnesiumsulfat, Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat oder Natriumchlorid usw. Weiterhin müssen dem Medium Nährstoffe zugesetzt werden, die für das Wachstum des jeweils verwendeten Mikroorganismen- ao Stammes wesentlich sind, wie z. B. Histidin oder Adenin. Wie in der Fermentationstechnik üblich, können dem Medium weiterhin wachstumsfördernde Mittel, wie z. B. Biotin oder Aminosäuren, wie z. B. Glutaminsäure oder Asparaginsäure, zugesetzt werden. »5

Die Fermentation wird unter in der Fermentationstechnik üblichen aeroben Bedingungen, wie z. B. in Form einer aeroben Schüttelkultur oder unter Rühren einer Submerskultur unter Einführung von sterilisierter Luft, bei einer Temperatur von etwa 20 bis 40°C und einem pH-Wert von etwa 5 bis 9 durchgeführt.

Nach Beendigung der Fermentation kann die 5'-Inosinsäure nach üblichen Verfahren aus der Fermentationsflüssigkeit isoliert werden, wie z. B. durch Behandlung mit Ionenaustauschharzen, Extraktion mit Lösungsmitteln, Fällung mit Metallsalzen, Chromatographie u. dgl.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur biochemischen Herstellung von 5'-Inosinsäure durch Züchten eines Mikroorganismus in einem hierfür üblichen Hypoxanthin enthaltenden Nährmedium, dadurch gekennzeichnet, daß man Brevibacterium ammoniagenes ATCC15 750 in Gegenwart von 2 mg/1 Fe⁺+, 10 bis 30 μ&Ί Mn++, 2,7 mg/1 Ca++ und 100 bis 300 μg/l Zn++, Brevibacterium ammoniagenes ATCC15751 bzw. ATCC 6871 in Gegenwart von 3 mg/1 Fe++, 20 μg/l Mn++, 2,7 mg/1 Ca++ und 250 μg/l Zn++, Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 in Gegenwart von 2,5 mg/1 Fe++, 10 bis 60μg/l Mn++, 2,7 mg/1 Ca++ und 40 bis 300 μg/l Zn++,Micrococcus sodenensisATCC15932 in Gegenwart von 12 mg/1 Fe++, 0,28 bis 2,8 mg/1 Mn++, 1,4 mg/1 Ca++ und 10 bis 50μg/l Zn++, Aspergillus sojae ATCC16320 in Gegenwart von 2 mg/1 Fe++, 1,5 bis 15 μg/l Mn++, 2,7 mg/1 Ca++ und 10 bis 150 μg/l Zn++, Brevibacterium ammoniagenes ATCC15187 in Gegenwart von 2 mg/1 Fe++, 10 bis 30 μg/l Mn++, 2,7 mg/1 Ca++ und 100 bis 300 μg/l Zn++ oder Brevibacterium ammoniagenes ATCC15312 in Gegenwart von 2 mg/1 Fe++, 30 μg/l Mn++, 2,7 mg/1 Ca++ und 100 μg/l Zn++ im Nährmedium züchtet.

909533/160