<Desc/Clms Page number 1>
Verfahren zur biologischen Umwandlung eines Anhydrotetracyclins in das entsprechende Tetracyclin
Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von Tetracycline und insbesondere ein neues Verfahren zur biologischen Überführung von Anhydrotetracyclinen in die entsprechenden Tetracycline.
Tetracycline wurden durch aerobe Fermentierung eines wässerigen Nährmediums mit verschiedenen Stämmen der Art Streptomyces hergestellt.
Die Anhydrotetracycline, die Ausgangsmaterialien für das neue Verfahren nach der Erfindung sind bekannte Verbindungen.
Die Erfindung beruht darauf, dass es möglich ist, die biologische Überführung von Anhydrotetracyclinen in die entsprechenden Tetracycline durchzuführen, d. h., die biologische Hydratisierung der 5a, 6-Bindung der Anhydrotetracycline. Diese Umwandlung wird erreicht durch Zugabe einer Anhydrotetracyclin Verbindung zu einem Fermentationsmedium, welches mit einem Stamm einer Art der Gattung
EMI1.1
aureofaciens ATCCATCC Nr. 13192, S. rimosus ATCC Nr. 10 970 und dem sogenannten neuen Stamm S. viridifaciens ATCC Nr. ll 989 inoculiert ist. Lebensfähige Kulturen dieser Stämme wurden bei der American Type Culture
Collection (ATCC) in Washington D. C. hinterlegt. Nach der Fermentierung während eines üblichen Zeitraumes, z.
B. zwischen 12 und 96 h, zeigt sich, dass das Anhydrotetracyclin im wesentlichen in das entsprechende Tetracyclin in Mengen von etwa 25 bis zu etwa 750/0 überführt wurde.
Es ist sehr uberraschend, dass die Anhydrotetracycline als Substrate dienen können, welche durch die Mikroorganismen in die entsprectlendell letracycluit. ; ubergeluhrt werden. Bei einer normalen Fermentation dienen die Bestandteile des Nährmediums als Substrat, aus welchem das Antibioticum synthetisiert wird. Die Feststellung, dass eine bekannte stabile chemische Verbindung, insbesondere eine, die sich bei einem heftigen chemischen Abbau ergibt, als Substrat zur Herstellung einer gänzlich verschiedenen Tetracyclinverbindung dienen kann, ist völlig unerwartet.
Die Fermentationsbedingungen zur biologischen Umwandlung von Anhydrotetracyclinen zu den ententsprechenden Tetracycline sind im allgemeinen dieselben wie sie bei den gegenwärtig bekannten Verfahren zur Herstellung verschiedener Tetracycline durch Fermentierung angewendet werden, d. h. die Kultur kann aerob wachsen und das Fermentationsmedium enthält die gebräuchlichen Nährstoffe und Mineralsubstanzen. Geeignete Nährstoffe enthalten eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff, wie z. B.
Stärke, Dextrose, Rohrzucker, Glucose, Melasse, Sojabohnenmehl, Erdnussmehl, Hefe, Fleischextrakte, Pepton, Harnstoff, Maisquellflüssigkeit, lösliche Brennerei-Rückstände, Fischmehl und andere gebräuchliche Substanzen. Unter die anorganischen Salze fallen solche Substanzen wie Calciumcarbonat, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid und Salze der verschiedenen Spurenelemente, wie z. B. Mangan, Kobalt, Zink, Kupfer, Eisen u. ähnl.
Die andern allgemeinen Bedingungen der Fermentierung, wie z. B. Wasserstoff-Ionen-Konzentration, Temperatur, Belüftungsgeschwindigkeit, Herstellung des Inoculums, Sterilisierung, Inoculierung u. dgl. erfolgen in bekannter Weise.
Das Fermentierungsverfahren kann bei Temperaturen bisherab zu 200e oder bis hinauf zu 400e durch-
<Desc/Clms Page number 2>
geführt werden. Für maximale Ausbeuten sollte die Dauer der Fermentierung, zwischen 30 und 40 h betragen, obwohl gegebenenfalls die Fermentierung längere Zeiträume fortgeführt werden kann und obwohl natürlich niedrigere Ausbeuten in kürzeren Zeiträumen erzielt werden können.
Nachdem die Fermentierung über den gewünschten Zeitraum fortgeführt wurde und die Umwandlung der Anhydrotetracyclinverbindung in das entsprechende Tetracyclin praktisch vollständig ist, kann die Tetracyclinverbindung aus der Fermentationsmaische auf irgendeine bequeme Weise isoliert werden, wie es z. B. in der österr. Patentschrift Nr. 208506 beschrieben ist.
Die Erfindung wird ausführlicher in Verbindung mit den folgenden speziellen Beispielen beschrieben, in welchen das sterile Inoculierungsmedium folgende Zusammensetzung hatte :
Maisquellflüssigkeit 20 g
Dextrin Nr. 162 30 g (NHSO 2 g
CaCO3 7 g
Wasser auf 1000 ml und das sterile Fermentationsmedium folgende Zusammensetzung aufwies :
Maisquellflüssigkeit 27,5 g
EMI2.1
gNH4Q l, 5g
Spurenelementlösung 10,0 ml*
Wasser auf 1000 ml Spurenelementlösung : FeSO4. 7H2O12g ZnSO4 20 g MnSO4. H2O1g Wasser auf 1000 ml pH-Wert auf 1,3 mit konzentrierter
H SO eingestellt.
Beispiel l : Umwandlung von Anhydrotetracyclin in Tetracyclin.
Sporen von Streptomyces aureofaciens ATCC Nr. 10 762 wurden von einer Schrägagarkultur mit sterilem destilliertem Wasser abgewaschen und ergaben eine Suspension, die 73 x 105 Sporen je ml enthielt.
Ein aliquoter Teil von 1, 0 ml dieser Suspension wurde zu 100 ml sterilem Inoculierungsmedium in einem
500 ml Erlenmeyer-Kolben zugegeben. Die Mischung wurde bei 26, 50e während 24 h auf einer hin-und hergehenden Schüttelmaschine, die mit 116 Schwingungen je Minute betrieben incubiert. Ein Teil von 1, 0 ml dieses 24-h-Inoculums wurde jeweils in zwei Erlenmeyer-Kolben zu 250 ml gegeben, welche 25 ml des sterilen Fermentationsmediums enthielten. Die Kolben wurden mit ihrem Inhalt bei 250C während 48 h auf einer rotierenden Schüttelmaschine die mit 180 Umdr/min betrieben wurde, incubiert.
Am Ende dieses 48stündigen Incubationszeitraumes wurden 10 mg mit C'* markiertem Anhydrotetracyclin (300 Zählungen je Minute je Mikrogramm Anhydrotetracyclin) in Form eines feinen Pulvers in einen der beiden 250 ml-Erienmeyer-Kolben, welche die 48-h-Fermentierungsmaischen enthielten, gegeben. Der andere Kolben und dessen Inhalt wurden als Kontrolle beibehalten. Die beiden Kolben wurden für weitere 72 h bei 250C auf einer rotierenden Schüttelmaschine incubiert, wodurch sich eine Gesamtincubationszeit von 120 h ergibt. Zu diesem Zeitpunkt wurden 3, 0 ml Anteile auf jedem der beiden Kolben entnommen, bevor die Maischen-Untersuchung durchgeführt wurde.
<Desc/Clms Page number 3>
EMI3.1
<tb>
<tb>
Maischen-Untersuchung <SEP> auf <SEP> Tetracyclin
<tb> g/ml
<tb> Kontrolle <SEP> (kein <SEP> Anhydrotetracyclin <SEP> zugegeben) <SEP> 50
<tb> Versuch <SEP> (10 <SEP> mg <SEP> Anhydrotetracyclin <SEP> zugegeben) <SEP> 270
<tb>
Der Unterschied von 220 ug/ml zwischen dem Kontrollwert von 50 tlglml und dem Versuchswert von 270 ug/ml ist diejenige Menge Tetracyclin, die sich aus der Umwandlung des zugesetzten Anhydrotetracyclins ergibt, entsprechend einer Gesamtumwandlung von 55%.
Die 3,0 mI-Anteile der Kontroll- und Versuchsmaischen nach 120stündiger Fermentierung, welchebevor die Maischen-Untersuchung durchgeführt wurde-entfernt und aufbewahrt wurden, wurden jeweils mit 10 ml 0, 2n-Salzsäure verdünnt und das Mycel durch Filtrierung abgetrennt. Jedes Filtrat wurde durch Schütteln mit 1,5 ml Parachlorphenol extrahiert.
10 Mikroliter von jeder Phenol-Base wurden auf einzelne Streifen von 2, 45 cm Breite und 56 cm Länge von Whatman Chromatographiepapier Nr.1, welches vorhergehend durch Eintauchen in eine mit Phosphorsäure auf PH 3,0 eingestellte Lösung von 0,3 m-NaH PO gepuffert worden war aufgetragen und anschliessend luftgetrocknet. Anschliessend wurden die Streifen einer absteigenden Entwicklung unterworfen. Es wurde die organische Phase eines n-Butanol/0,3 m-NaH2PO4-Lösungsmittelsystems (1:1) verwendet, worin die Puffer auf einen pH- Wert von 3, 0 mit Phosphorsäure eingestellt war (System A).
Zwei 2, 54cm breite und 56 cm lange Streifen vom Chromatographiepapier Nr.1 Whatman, die vor-
EMI3.2
0,4 m-Na2HPO und 4, 5%graphie-Behälter, welcher Wasser auf dem Boden des Behälters und Essigsäure-Äthylester in einem offenen Gefäss am Boden des Behälters enthielten, gehangen. Etwa 1 h vor der Entwicklung wurden 10 Mikroliter der Phenol-Phase des Extraktes des Kontrollfiltrates auf einen Streifen und ein gleiches Volumen der Phenol-Phase des Extraktes des Versuchsfiltrates auf den andern Streifen aufgebracht. Anschliessend wurden die Streifen der absteigenden Entwicklung unterworfen. Es wurde die organische Phase eines Äthylacetat- phosphatcitratpuffer-Lösungsmittelsystems (l : l) bei PH 4,5 verwendet (System B).
Der Phosphat-Citratpuffer besteht aus gleichen Volumina 0, 4 m-NazHP04 und 4, 51o Citronensäure. Die entwickelten Flecken wurden durch Berauchen der Streifen mit Ammoniak und Betrachtung unter ultraviolettem Licht entdeckt.
Die entwickelten, luftgetrockneten Streifen wurden auf Radioaktivität mittels eines Geiger-MüllerZählers untersucht. Das Auftreten von Zonen mit Radioaktivität auf den Versuchsstreifen bei Rf 0,31 (System A) und bei Rf0,41 (System B), entsprechend den Rf-Werten für Tetracyclin auf den Kontrollstreifen, beweist die Umwandlung von Anhydrotetracyclin zu Tetracyclin, wie sie vorhergehend durch die oben aufgeführte Maischen-Untersuchung gezeigt wurde. Durch Messung der Radioaktivitäts-Spitzenbereiche wurde das Ausmass der Umwandlung von mit Cl4 markiertem Anhydrotetracyclin zu mit C*. markiertem Tetracyclin auf etwa 50% geschätzt.
Beispiel 2 : Umwandlung von Anhydrotetracyclin in Tetracyclin.
Es wurde eine wässerige Sporen-Suspension von S. rimosus ATCC Nr. 10 970, die etwa 68 x 10 Sporen im Milliliter enthielt, hergestellt, indem eine Schrägagarkultur mit sterilem destilliertem Wasser gewaschen wurde. 1, 0 ml dieser Suspension wurde zu 100 ml sterilem Inoculierungsmedium in einem 500 ml-Erlenmeyer-Kolben zugegeben. Dasinoculierte Material wurde bei 26, 50C während 24 h auf einer hin-und hergehenden Schüttelapparatur incubiert, anschliessend 1, 0 ml dieses 24stündigen vegetativen Inoculums entnommen und zu 25 ml sterilem Fermentationsmedium in einem 250 ml-Erleumeyer-Kolben zugegeben. Der Kolbeninhalt wurde bei 250C während 48 h auf einer rotierenden Schüttelmaschine incu-
EMI3.3
Die Röhrchen wurden auf eine rotierende Schüttelmaschine gebracht und bei 250C für weitere 72 h incubiert, so dass sich eine Gesamtincubationszeit von 120 h ergab. Nach Ablauf dieses Incubationszeitraumes wurden die Röhrchen entnommen, die Maische mit je 10 ml 0, 2n-Salzsäure verdünnt und das Mycel durch Filtrierung abgetrennt. Jedes Filtrat wurde durch Schütteln mit 0, 5 ml Parachlorphenol extrahiert.
Teile von 10 ml jeder Phenol-Phase wurden unter Verwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Systeme A und B chromatographiert. Die entwickelten, luftgetrockneten Chromatogramme wurden mit freiem Auge und danach mittels eines Geiger-Müller-Zählers auf Radioaktivität untersucht.
<Desc/Clms Page number 4>
Das Auftreten von Zonen mit Radioaktivität mit Rf-Werten von 0, 31 (System A) und 0, 41 (System B), entsprechend den Rf-Werten für Tetracyclin auf den Kontrollstreifen, bewies die Umwandlung von Anhydrotetracyclin in Tetracyclin. Durch Messung der Radioaktivitätsspitzenflächen wurde das Ausmass der Umwandlung von Anhydrotetracyclin in Tetracyclin auf etwa 10% geschätzt.
Beispiel 3 : Umwandlung von Anhydrotetracyclin in Tetracyclin.
1, 0 ml einer Sporen-Suspension von S. viridifaciens ATCC Nr. 11989 mit einem Gehalt von 63 x 106 Sporen je Milliliter wurde zu 100 ml sterilen Inoculierungsmedium, welches in einem 500 ml-Erlenmeyer Kolben enthalten war, zugegeben. Diese Mischung wurde bei 26, 5 C während 24 h auf einer hinund hergehenden Schüttelmaschine, die mit 116 Schwingungen pro Minute arbeitete, incubiert. Am Ende dieses Incubierungszeritraumes wurden 25 ml des sterilen Fermentationsmediums in einem 250 ml-Erlenmeyer-Kolben mit einem aliquoten Teil von 1, 0 ml dieses 24stündigen vegetativen Inoculums beimpft.
Dieser beimpfte Kolben wurde bei 250C während 48 h auf einer rotierenden Schüttelmaschine, die mit 180 Drehungen in der Minute betrieben wurde, incubiert. Am Ende dieser 48stündigen Incubierungszeit
EMI4.1
teren 72 h incubiert, was einen Gesamt-Incubierungszeitraum von 120 h bedeutet. Nach Ablauf dieser Incubierungszeit wurden die Röhrchen entnommen, die Maischen jeweils mit 10 ml 0, 2n-Salzsäure verdünnt und das Mycel abfiltriert. Jedes Filtrat wurde durch Schütteln mit 0, 5 ml Parachlorphenol extrahiert.
Anteile von 10 ml jeder Phenol-Phase wurden entsprechend den in Beispiel 1 beschriebenen Systemen A und B chromatographiert. Die entwickelten, luftgetrockneten Chromatogramme wurden mit freiem Auge und danach auf Radioaktivität mittels eines Geiger-Müller-Zählers untersucht.
Das Auftreten von Zonen mit Radioaktivität mit Rf-Werten von 0, 31 (System A) und 0, 41 (System B), entsprechend den Rf-Werten für Tetracyclin auf Kontrollstreifen, bewies die Umwandlung von Anhydrotetracyclin in Tetracyclin. Durch Messung der Radioaktivitätsspitzenflächen wurde das Ausmass der Um-
EMI4.2
:1, 0 ml einer Sporen-Suspension von S. aureofaciens ATCC Nr. 10 763 mit einem Gehaltvon
65 x l (f Sporen je Milliliter; wurde zu 100 ml sterilem Inoculierungsmedium, welches in einem 500 ml-Erlenmeyer-Kolben war, zugegeben. Diese Mischung wurde bei 26, 5 C während 24 h auf einer hin-und hergehenden Schüttelmaschine, die mit 116 Schwingungen je Minute betrieben wurde, incubiert.
Anschliessend wurde ein Anteil von 25 ml sterilem Fermentationsmedium in jeweils einen von vier 250 ml-Erlenmeyer-Kolben gegeben. Ein Hemmstoff für die fermentative Chlorierung, 2- (2-furyl)-5-mercapto-1,3,4-oxadiazol wurde zugegeben im Verhältnis von 7 J1. g/ml Fermentationsmedium, d. h., eine Gesamtmenge von 175 J1. g in jeden der vier Kolben. Nach Sterilisierung, Abkühlung und Beimpfung mit 1. 0 ml des vorher beschriebenen 24stündigen Inoculums wurden die vier Kolben bei 250C während 48 h auf einer rotierenden Schüttelmaschine, die mit 180 Drehungen je Minute betrieben wurde, incubiert.
Am Ende dieses Incubierungszeitraumes wurden 8, 75 mg Anhydrochlortetracyclin zu dem Inhalt des einen Kolbenszugegeben ; 12, 5mg mit C14 markiertem Anhydrochlortetracyclin (320 Zählungen je Minute je Mikrogramm Anhydrochlortetracyclin) wurden zu dem Inhalt des zweiten Kolbens, 12, 5 mg mit Cf markiertem Anhydrochlortetracyclin (50 Zählungen je Minute je Mikrogramm Anhydrochlortetracyclin) wurden zu dem Inhalt des dritten Kolbens zugegeben und der vierte Kolben zur Kontrolle beibehalten.
Sämtliche vier Kolben wurden wiederum bei 250C auf einer rotierenden Schüttelmaschine während weiterer 72 h incubiert, was einer Gesamtincubierungszeit von 120 h entspricht. Zu diesem Zeitpunkt wurden 3,0 ml- Anteile von jedem der beiden 120stündigen Fermentationsmaischen von 25 ml, welche mit C markiertes Anhydrochlortetracyclin und mit Cl markiertes Anhydrochlonetracyclin enthielten, entnommen und ebenso von der Kontroll-Fermentierungsmaische und zur weiteren Untersuchung aufbe- wahrt.
Der verbliebene Teil der Kontroll-Fermentierungsmaische und diejenige, zu welcher kein radioaktives Anhydrochlortetracyclin zugegeben worden war, wurden fluorometrisch auf den ChlortetracyclinGehalt untersucht, wobei folgende Ergebnisse erhalten wurden :
<Desc/Clms Page number 5>
EMI5.1
<tb>
<tb> Maischen-Untersuchung <SEP> auf <SEP> Chlortetracyclin <SEP> pg/ul
<tb> Kontrolle <SEP> (kein <SEP> Anhydrochlortetracyclin <SEP> zugegeben) <SEP> 310
<tb> Versuch <SEP> (8,75 <SEP> mg <SEP> Anhydrochlortetracyclin <SEP> zugegeben) <SEP> 460
<tb>
Der Unterschied von 150 pg/mIChlortetracyclinzwischen dem Kontrollwert von 310 biglml und dem Versuchswert von 460 ilglml ist die Menge Chlortetracyclin, die aus der Umwandlung des Anhydrochlortetracyclins in Chlortetracyclin herstammt,
was einer Ausbeute von 43% entspricht.
Die Anteile von 3, 0 ml der Kontrolle und der mit durch C markierten Anhydrochlortetracyclin und durch Cl markierten Anhydrochlortetracyclin versetzten 120stündigen Fermentationsmaische wurden je- weils mit 10 ml 0, 2n-Salzsäure verdünnt und das Mycel abfiltriert. Das Filtrat wurde in jedem Fall mit 0, 5 ml Parachlorphenol extrahiert.
10 Mikroliter jeder Phenol-Phase wurden auf einzelne 2, 54 breite und 56 cm lange Streifen von Chromatographiepapier Whatman Nr. l aufgetragen, welches vorhergehend durch Eintauchen in eine mit Phosphorsäure auf pH 3, 0 eingestellte Lösung aus 0, 3 m-NaH PO., gepuffert, dann luftgetrocknet worden war. Anschliessend wurden die Streifen der absteigenden Entwicklung unterworfen ; es wurde die organische Phase eines n-Butanol 0, 3m-NaH2PO4-Lösungsmittelsystems (1:1) verwendet, worin der Puffer auf pH 3, 0 mit Phosphorsäure eingeregelt worden war (System A).
Drei 2, 54 breite und 56 cm lange Streifen vom Chromatographiepapier Whatman Ni. 1, welche vorhergehend durch Eintauchen in eine aus gleichen Volumina 0,4 m-Na2HPO und 4, 51o Citronensäure zusammengesetzte Lösung gepuffert worden waren, wurden luftgetrocknet. Die gepufferten Streifen wurden über Nacht in einen Chromatographie-Behälter, der Wasser auf dem Boden des Behälters und Essigsäure- Äthylester in einem offenen Gefäss auf dem Boden des Behälters enthielt, gehangen.
Etwa 1 h vor der Entwicklung wurden 10 Mikroliter Phenol-Phase des Extraktes des Kontrollfiltrates auf einem Streifen, ein gleiches Volumen der Phenol-Phase des Extraktes des mit C14 markierten Testfiltrates auf den zweiten und ein gleiches Volumen der Phenol-Phase des Extraktes des mit Cl markierten Testfiltrates auf den dritten Streifen aufgetragen. Anschliessend wurden die Streifen absteigend entwickelt ; es wurde die organische Phase eines Äthylacetatphosphatcitratpuffer-Lösungsmittelsysiems (l : l) bei einem pH 4,5 verwen-
EMI5.2
Betrachten unter ultraviolettem Licht festgestellt.
Die entwickelten, luftgetrockneten Streifen wurden auf Radioaktivität mittels eines Geiger-MüllerZählers untersucht. Das Auftreten von Zonen mit Radioaktivität auf den Teststreifen bei Rf 0, 54 (System A) und bei Rr 0, 76 (System B), entsprechend den Rf-Werten für Chlortetracyclin, beweisen die Umwandlung von Anhydrochlortetracyclin in Chlortetracyclin, wie es vorhergehend durch die oben aufgeführte Maischen-Untersuchung gezeigt wurde. Durch Messung der Radioaktivitäts-Gipfelbereiche wurde das Aus- mass der Umwandlung desmit C 4 markierten Anhydrochlortetracyclins in mit C14 markiertes Chlortetracyclin auf 50%, die Umwandlung des mit CIS6 markierten Anhydrochlortetracyclins in mit Cl markiertes Chlortetracyclin auf 400/0 geschätzt.
Beispiel 5 : Umwandlung von 7-Bromanhydrotetracyclin in 7-Bromtetracyclin. Sporen von S. aureofaciens ATCC Nr. 12551 wurden von einer Schrägagarkultur mit sterilem
EMI5.3
gehenden Schüttelmaschine, welche mit 116 Schwingungen je Minute arbeitete, 24 h lang incubiert.
Nach Beendigung dieses Inoculierungszeitraumes wurde ein Anteil von 1, 0 ml dieses Inoculums in je zwei Erlenmeyer - Kolben zu 250 ml, welche 25 ml steriles Fermentationsmedium und 175 g2- (2-furyl)- -5-mercapto-1,3,4-oxadiazol einen Hemmstoff für fermentative Chlorierung enthielten, zugegeben.
Während eines Zeitraumes von 48 h wurden diese beiden inoculierten Kolben bei 250C auf einer rotierenden Schüttelmaschine, die mit 180 Umdr/min arbeitete, incubiert. Danach wurden 8,0 mg Anhydro - bromtetracyclin in Pulverform zu einem der beiden Kolben zugegeben. Beide Kolben wurden erneut bei den oben angegebenen Bedingungen während 72 h incubiert, was einer Gesamtincubationszeit von 120 h entspricht.
Die Kolben wurden dann aus dem Incubator entnommen und ihr Inhalt auf Bromtetracyclin untersucht, wobei folgende Ergebnisse erhalten wurden :
<Desc/Clms Page number 6>
EMI6.1
<tb>
<tb> Maischen-Untersuchung <SEP> auf <SEP> Brom- <SEP>
<tb> tetracyclin <SEP> pg/ml
<tb> Kontrolle <SEP> (kein <SEP> Anhydrobromtetracyclin <SEP> zugegeben) <SEP> 0
<tb> Versuch <SEP> (8, <SEP> 0 <SEP> mg <SEP> Anhydrobromtetracylcin <SEP> zugegeben) <SEP> 180
<tb>
Die Gesamtumwandlung von Anhydrobromtetracyclin in Bromtetracyclin betrug 56%.
Beispiel 6 : Umwandlung von 6-Desmethylanhydrotetracyclin in 6-Desmethyltetracyclin.
Eine wässerige Suspension, die etwa 70 x 106 Sporen je ml von S. aureofaciens ATCC Nr. 13192 enthielt, wurde hergestellt, indem eine Schrägagarkultur mit sterilem destilliertem Wasser gewaschen wurde. 1 ml dieser Suspension wurde zur Inoculierung von 100 ml sterilen Inoculierungsmedium in einem 500 ml-Erlenmeyer-Kolben verwendet. Das beimpfte Medium wurde bei 26, 5 C, während 24 h auf einer hin-und hergehenden Schüttelmaschine, welche mit 116 Schwingungen je Minute arbeitete, incubiert.
EMI6.2
Minute je Mikrogramm) in Pulverform wurde einem Röhrchen zugesetzt, das andere wurde als Kontrolle beibehalten. Die Röhrchen wurden auf eine rotierende Schüttelmaschine gegeben und bei 250C für weitere 72 h incubiert, was einer Gesamtincubationszeit von 120 h entspricht.
Am Ende dieser Incubationsperiode wurden die Röhrchen entnommen, die Maische in jedem mit 10 ml 0, 2n-Salzsäure verdünnt und das Mycel abfiltriert. Jedes Filtrat wurde durch Schütteln mit 0, 5 ml Parachlorphenol extrahiert. Zwei Streifen von 2, 54 cm Breite und 56 cm Länge aus Chromatographiepapier Whatman Nr. l wurden durch Eintauchen in eine PH 3, 4-Pufferlösung, welche aus 30 Volumen 0, 2 m -Na2HP04 und 70 Volumen 2.24%iger Citronensäure zusammengesetzt war, gepuffert und luftgetrocknet. Die beiden gepufferten Streifen wurden in einem Chromatographie-Behälter aufgehängt, der Wasser auf dem Boden des Behälters und eine Mischung organischer Lösungsmittel (Nitromethan : Benzol : Pyridin = 20 : 10 : 3) in einem offenen Gefäss auf dem Boden des Behälters enthielt.
Etwa 1 h vor der Entwicklung wurde eine Menge von 10 Mikroliter der Phenol-Phase des Extraktes des Kontrollfiltrates auf einem Streifen aufgetragen und ein gleiches Volumen der Phenol-Phase des Extraktes des mit C14 markierten Versuchsfiltratesaufden ändern Streifen aufgetragen. Anschliessend wurden die Streifen der absteigenden Entwicklung unterworfen, wobei
EMI6.3
organische Phasestem verwendet wurde, wobei der pH 3, 4-Puffer aus 30 Volumen 0, 2m-Na2RP04 und 70 Volumen einer 2,24%ige Citronensäure zusammengesetzt war (System C).
Zwei Streifen von 2, 54 cm Breite und 56 cm Länge von Chromatographiepapier Whatman Nr. 1 wurden durch Eintauchen in eine Lösung von 0, 3 m-NaH PO, die mit Phosphorsäure auf PH 2, 0 eingestellt war, gepuffertund dann luftgetrocknet. Die beiden gepufferten Streifen wurden in einem ChromatographieBehälter aufgehängt, der Wasser auf dem Boden des Behälters und ein organisches Lösungsmittel (Essigsäurebutylester) in einem offenen Gefäss am Boden des Behälters enthielt. Etwa 1 h vor der Entwicklung wurden 10 Mikroliter der Phenol-Phase des Extraktes des Kontrollfiltrates auf einem Streifen aufgetragen und ein gleiches Volumen der Phenol-Phase des Extraktes des mit < j markierten Testfiltrates auf dem andern Streifen aufgetragen.
Anschliessend wurden die Streifen der absteigenden Entwicklung unterworfen, wobei die organische Phase von Essigsäurebutylester zu 5% Trichloressigsäure mit pH 2,0-puffer (5:1: 4) als Lösungsmittelsystem verwendet wurde, wobei die Pufferlösung aus 0, 3 m-NAH. PO bestand (System D).
Die entwickelten, luftgetrockneten Streifen wurden mit dem Auge überprüft und auf Radioaktivität mittels eines Geiger-Müller-Zählers untersucht.Das Auftreten von Zonen mit Radioaktivität mit Rf-Werten von 0, 33 (System C) und 0, 24 (System D), entsprechend demjenigen von 6-Desmethyltetracyclin, bestätigte die Umwandlung von mit C14 markierten 6-Desmethyltetracyclin, in mit C markiertes 6-Des- methyltetracyclin. Messungen der Radioaktivitäts-Gipfelbereiche zeigten ein Ausmass der Umwandlung von mit C markiertem 6-Desmethylanhydrotetracyclin in mit C14 markiertes 6-Desmethyltetracyclin von z an.
Beispiel 7 : Umwandlung von 6-Desmethyl-7-Bromanhydrotetracyclin in 6-Desmethyl-7-bromtetracyclin.
Eine wässerige Suspension von Sporen von S. aureofaciens ATCC Nr. 10 762, die etwa 70 X 10 Sporen
<Desc/Clms Page number 7>
je Milliliter enthielt wurde durch Abschwemmen einer Schrägagarkultur mit sterilem destilliertem Wasser hergestellt. 1,0 ml dieser Suspension wurde zu 100 ml sterilem Inoculierungsmedium in einem 500 mlErlenmeyer-Kolben zugegeben. Das inoculierte Material wurde bei 26, 50C während 24 h auf einer hinund hergehenden Schüttelmaschine incubiert und danach Anteile von 1, 0 ml dieses 24h alten Inoculums entnommen und zu jedem von zwei 25 ml-Mengen sterilen Fermentationsmedium in zwei 250 ml-Erlenmeyer-Kolben zugegeben. Der Kolbeninhalt wurde bei 250C 48 h lang auf einer rotierenden Schüttelma-
EMI7.1
0Kolben zugegeben.
Beide Kolben wurden erneut bei 250C auf einer rotierenden Schüttelmaschine für weitere 72 h incubiert, wodurch sich eine Gesamtincubationszeit bei 250C von 120 h ergibt. Die Untersuchung der 120 h alten Fermentationsmaischen aus diesen beiden Kolben ergab die folgenden Resultate :
EMI7.2
<tb>
<tb> Maischen-Untersuchung <SEP> auf
<tb> 7-Brom-6-desmethyltetracyclin
<tb> ssgiml
<tb> Kontrolle <SEP> (kein <SEP> 7-Brom-6-desmethylanhydrotetracyclin <SEP> zugegeben) <SEP> 0
<tb> Versuch <SEP> (8 <SEP> mg <SEP> 7-Brom- <SEP> 6- <SEP> desmethylanhydrotetracyclin <SEP> zugegeben) <SEP> 215
<tb>
Die Gesamtumwandlung von 7-Brom-6-desmethylanhydrotetracyclinin7-Brom-6-desmethyltetra- lin betrug 610/0.
Beispiel 8 : Umwandlung von Anhydrotetracyclin-Nitril in Tetracyclin-Nitril.
In einem 500 ml-Erlenmeyer-Kolben wurden 100 ml sterilen Inoculierungsmediums mit 1, 0 ml einer
EMI7.3
auf einer hin-und hergehenden Schüttelmaschine incubiert. Am Ende dieses Zeitraumes wurde jeweils ein aliquoter Teil von 1, 0 ml dieses Inoculums zu zwei 25 ml- Anteilen des sterilen Fermentationsmediums in einzelnen 250 ml-Erlenmeyer-Kolben zugegeben. Diese beiden beimpften Kolben wurden bei 25 C auf einer rotierenden Schüttelmaschine während 48 h incubiert. An diesem Zeitpunkt wurden 7,0 mg gepulvertes Anhydrotetracyclin-Nitril zu einem der Kolben zugegeben, während der andere als Kontrolle beibehalten wurde.
Beide Kolben wurden erneut bei 250C unter Rühren für weitere 72 h incubiert, wodurch sich eine Gesamtincubationszeit bei 25 C von 120 hergibt. Aliquote Teile von 3 ml der Versuchs-und Kontroll-Maischen von 120 h Alter wurden jeweils mit 70 ml 0,2n-Salzsäure verdünnt und das Mycel abfiltriert. In jedem Fall wurde das Filtrat durch Schütteln mit 0,5 ml Parachlorphenol extrahiert.
Vier Streifen von 2, 54 cm Breite und 56 cm Länge von Chromatographiepapier Whatman Nr. l wurden durch Eintauchen in eine Lösung von 0, 3m-NaH PO. welche auf PH 2,0 Phosphorsäure eingestellt war, gepuffert und dann luftgetrocknet. Zwei gepufferte Streifen wurden über Nacht in einen Chromatgraphie-Behälter gehängt, welcher Wasser auf dem Boden des Behälters und eine Mischung von organischen Lösungsmitteln (Chloroform-Amylalkohol 4 : l) in einem offenen Gefäss auf dem Boden des Behälters enthielt. Etwa 1 h vor der Entwicklung wurde eine Menge von 10 Mikrolitei der Phenol-Phase desExtraktes des Kontrollfiltrates auf einen Streifen aufgetragen und ein gleiches Volumen der Phenol-Phase des Extrak- tes des Versuchsfiltrates auf den andern Streifen aufgetragen.
Anschliessend wurden die beiden Streifen der absteigenden Entwicklung unterworfen, wobei die organische Phase von Chloroform-Amylalkohol'pH 2,0-Puffer (4 : 1 : 5) als Lösungsmittelsystem verwendet wurde, wobei der pH 2, 0-Puffer aus 0, 3 m- -NaH, PO, bestand (System E). Die andern beiden gepufferten Streifen wurden über Nacht in einen Chromatographie-Behälter gehängt, der Wasser auf dem Boden des Behälters und eine Mischung von organischen Lösungsmitteln (Chloroform : Dimethylformamid 4 : I) in einem offenen Gefäss auf dem Boden des Behälters enthielt. Etwa 1 h vor der Entwicklung wurde eine Menge von 10 Mikroliter der PhenolPhase des Extraktes des Kontrollfiltrates auf einen gepufferten Streifen und ein gleiches Volumen der Phenol-Phase des Extraktes des Testfiltrates auf den andern Streifen aufgetragen.
Anschliessend wurden die beiden Streifen der absteigenden Entwicklung unterworfen, wobei die organische Phase von ChloroformDimethylformamid pH 2,0-Puffer (4: 1: 6) als Lösungsmittelsystem verwendet wurde, wobei der pH 2, 0-Puffer aus 0,3 m-NaH 2PO4 bestand (System F). Die entwickelten, luftgetrockneten Streifen wurden fluoroskopisch untersucht. Das Auftreten von fluoreszierenden Zonen mit Rf-Werten von 0, 14 (System E) und 0, 12 (System F), entsprechend denjenigen von Tetracyclin-Nitril, beweist die Tatsache, dass An- hydrotetracyclin-Nitril in Tetracyclin-Nitril überführt wurde. Das Ausmass der Umwandlung von Anhydrotetracyclin-Nitril in Tetracyclin-Nitril wurde auf 351o geschätzt.