DE1257083B - Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Glutaminsaeure - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. Cl.:

C12d

Deutsche Kl.: 6b-16/02

Nummer: 1 257 083

Aktenzeichen: K 55290 IV a/6 b

Anmeldetag: 16. Februar 1965

Auslegetag: 28. Dezember 1967

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von l- Glutaminsäure durch Züchten von Mikroorganismen der Gattung Corynebacterium in Nährmedien, die Essigsäure und/oder Alkaliacetat bzw. Ammoniumacetat als alleinige Kohlenstoffquelle enthalten und kein NH₄H₂PO₄ aufweisen.

Es ist bekannt, daß viele Mikroorganismen, die beim Züchten L-Glutaminsäure aus Kohlenhydraten bilden, aus Essigsäure als alleiniger Kohlenstoffquelle ebenfalls L-Glutaminsäure zu bilden vermögen. Diese fermentative Herstellung von L-Glutaminsäure mit Hilfe bekannter Glutaminsäure bildender Bakterien aus Essigsäure als Ausgangsmaterial ist jedoch mit dem Nachteil verbunden, daß im Vergleich zur Verwendung von Kohlenhydraten als Ausgangsmaterial niedrige Fermentationsausbeuten erzielt werden. Die fermentative Umwandlung von Essigsäure in L-Glutaminsäure mit Hilfe dieser Bakterien ist daher ohne praktische Bedeutung und kann nicht in technischem Maßstab durchgeführt werden.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Glutaminsäure durch Züchten von Mikroorganismen der Gattung Corynebacterium in Nährmedien, die Essigsäure und/oder Alkaliacetat bzw. Ammoniumacetat als alleinige Kohlenstoffquelle enthalten und kein NH₄H₂PO₄ aufweisen und das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Mikroorganismus der Gattung Corynebacterium Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15 806 einsetzt.

Dieser Mikroorganismenstamm ist aus Erdböden in der Nähe von Tokyo, Japan, isoliert worden und kann auch aus tierischen Fäces erhalten werden. Der Beiname (Artname) des der Gattung Corynebacterium angehörenden Mikroorganismen beruht auf seiner Eigenschaft, L-Glutaminsäure in bedeutenden Mengen bilden zu können.

Diese Eigenschaft der Bildung großer Mengen an L-Glutaminsäure aus Essigsäure in der Fermentationsflüssigkeit, d. h. in dem essigsäurehaltigen Nähr- medium, das zum aeroben Züchten des genannten Bakterienstammes Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15 806 verwendet wird, löst das Problem der fermentativen Herstellung in technischem Maßstab von L-Glutaminsäure aus dem verhältnismäßig billigen Ausgangsmaterial Essigsäure als alleiniger assimilierbarer Kohlenstoffquelle.

Der erfindungsgemäß verwendete Mikroorganismus bildet aus Zuckern keine Glutaminsäure, sammelt jedoch bei Verwendung von Essigsäure als alleiniger assimilierbarer Kohlenstoffquelle bemerkenswerte Mengen an L-Glutaminsäure an.

Verfahren zur fermentativen Herstellung
von L-Glutaminsäure

Anmelder:

Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., Tokio

Vertreter:

Dr.-Ing. H. Ruschke und Dipl.-Ing. H. Agular,
Patentanwälte, München 27, Pienzenauer Str. 2

Als Erfinder benannt:

Katsunobu Tanaka, Machida-shi;

Kazuo Oshima, Tokio;

Kenichiro Takayama, Mitaka-shi (Japan)

Beanspruchte Priorität:

Japan vom 17. Februar 1964 (8179)

Der erfindungsgemäß verwendete Bakterienstamm Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15 806 hat die folgenden Eigenschaften:

A. Morphologische Eigenschaften

Form der Bakterien: gewöhnlich kurze Stäbe mit runden Enden und bisweilen ellipsoidischer bzw. keulenförmiger Gestalt. Kommen einzeln oder in Paaren vor. Größe: 0,8 bis 1,2 · 1,2 bis 3,0 μ.

Selbständiges Bewegungsvermögen: nicht beweglich. Beobachtung von metachromatischen Granula: Verzweigende Zellen kaum feststellbar.

Grampositiv (In einer alten Kultur läßt sich eine Gramnegativität von etwa 50% feststellen).

B. Züchtungseigenschaften

1. Agarplatte: geringes, schwaches Wachstum, kreisförmig, glatt, schwach erhöht bis flach, ganz, fahlgelb, undurchsichtig, matt, schwach trocken.

2. Agarschrägkultur: mäßiges bis spärliches Wachstum, fadenförmig, erhöht bis flach, matt, glatt, undurchsichtig, fahlgelb, butterartig.

3. Züchtung in Nährbrühe: schwach trübe, flockige Abscheidung, kein Geruch.

4. Agar-Stichkultur: am besten oben, fadenförmig.

5. Glucosenähragar: spärliches oder gar kein Wachstum.

709 710/178

C. Physiologische Eigenschaften

1. Optimale Temperatur: 25 bis 30°C (schwaches Wachstum bei 37 ⁰C).

2. Optimaler pH-Wert: 6 bis 8.

3. Verhalten gegenüber freiem Sauerstoff: aerob bis gelegentlich anaerob.

4. Lackmusmilch: nicht verändert.

5. Gelatine: nicht verflüssigt.

6. Schwefelwasserstoff: nicht gebildet.

7. Indol: nicht gebildet.

8. Stärke: nicht hydrolysiert.

9. Nitrat: nicht reduziert.

10. Katalase: positiv.

11. Urease: positiv.

12. Acetylmethylcarbinol: nicht gebildet.

13. Methylrot-Prüfversuch: negativ.

14. Aus Kohlenhydraten wird keine Säure gebildet.

15. Aus Essigsäure werden große Mengen L-Glutaminsäure gebildet.

16. Wenn Glucose oder Essigsäure als Kohlenstoffquelle verwendet wird, wird NH₄H₂PO₄ als alleinige Stickstoffquelle in Huckerschem Medium nicht ausgenutzt.

17. Cellulose wird nicht zersetzt.

Der erfindungsgemäße Bakterienstamm wurde gemaß Bergey, Manual of Determinative Bacteriology, 7. Auflage, klassifiziert. Der Stamm gehört deshalb zur Familie Corynebacteriaceae, weil er grampositiv, nicht sporenbildend und aerob ist und Stabform mit Granula aufweist. Weiterhin ist er in der Gattung Corynebacterium einzustufen, weil er grampositiv und nicht beweglich ist, Cellulose nicht zersetzt und sich aus tierischen Fäces isolieren läßt.

Gegenüber verwandten Stämmen weist der erfindungsgemäße Stamm die folgenden Unterschiede auf:

Erfindungsgemäßer

Bakterienstamm

ATCC 15 806

Corynebacterium
pseudodiphtheriticum

Corynebacterium equi

Farbe in Nähragar
Wachstum in Nähragar

Optimale Temperatur

Wachstum bei Zugabe von
Glucose

fahlgelb

gering und schwach,
etwas trocken

25 bis 30° C
gehemmt

grau oder cremefarben

feucht

37°C

lohfarben bis gelb oder rosa
bis rot

gewöhnlich feucht

25 bis 37°C
stimuliert

Eine Kultur von Cornybacterium acetoglutamicum wurde unter der Nr. ATCC15 806 bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, hinterlegt.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden als alleinige assimilierbare Kohlenstoffquellen Essigsäure, Natriumacetat, Kaliumacetat, Ammoniumacetat verwendet, während als Stickstoffquellen die gleichen assimilierbaren anorganischen, außer NH₄H₂PO₄, oder organischen Stickstoffquellen verwendet werden, wie man sie üblicherweise bei der f ermentativen Herstellung von Glutaminsäure mit Hilfe üblicher Glutaminsäure bildender Bakterien eingesetzt hat.

Das Züchten wird erfindungsgemäß in der Weise durchgeführt, daß das Nährmedium, das die Essigsäure und/oder Alkaliacetat bzw. Ammoniumacetat als alleinige Kohlenstoffquelle sowie weiterhin eine Stickstoffquelle der oben definierten Art und die üblichen anorganischen Salze enthält, auf einen pH-Wert von 6,0 bis 7,0 eingestellt und sodann sterilisiert wird. Das Kulturmedium wird dann mit dem erfindungsgemäß verwendeten Stamm, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15 806, beimpft und bei 25 bis 30⁰C unter aeroben Bedingungen bebrütet. Während des Züchtens wird der pH-Wert des Kulturmediums in vorteilhafter Weise durch Zugabe einer wäßrigen Lösung von Essigsäure und Ammoniumacetat auf 6,8 bis 7,8 eingestellt. Die Fermentation ist beendet, wenn die Bildung von L-Glutaminsäure ihr Maximum erreicht hat, was gewöhnlich in 2 oder 3 Tagen der Fall ist. Die Fermentationsflüssigkeit wird dann in an sich bekannter Weise durch ein Ionenaustauschharz gegeben, wobei die L-Glutaminsäure adsorbiert wird. Die L-Glutaminsäure wird dann mit wäßrigem Alkali extrahiert und die erhaltene Lösung eingeengt und gekühlt. Die abgeschiedenen Kristalle von L-Glutaminsäure werden abgetrennt und umkristallisiert. Die Isolierung der L-Glutaminsäure aus der Fermentationsflüssigkeit stellt als solche keinen Teil der vorliegenden Erfindung dar und kann auf irgendeine Art und Weise erfolgen, wie sie aus den herkömmlichen fermentativen Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure bekannt ist. Es können auch sämtliche anderen bekannten Verfahren zur Isolierung von L-Glutaminsäure aus einem Fermentationsmedium, in dem sie gebildet wurde, angewendet werden.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung des erfmdungsgemäßen Verfahrens.

Beispiel 1

Ein Nährmedium aus 500 g Natriumacetat, 200 g Ammoniumsulfat, 20 g Fleischextrakt, 300 g Calciumcarbonat, 10 g KH₈PO₄, 2 g MgSO₄-7H₂O, 30 g Harnstoff und Wasser auf 101 aufgefüllt, wird mit Hilfe von Natronlauge auf pH = 7,0 eingestellt. Das auf diese Weise erhaltene Fermentationsmedium wird mit Corynebacterium acetoglutamicum ATCC Nr. 15 806 beimpft, und es wird eine aerobe Schüttelkultur bei 30° C durchgeführt. Nach 72stündigem Züchten haben sich 15 g L-Glutaminsäure je Liter angesammelt. 101 der auf diese Weise erhaltenen Fermentationsflüssigkeit werden in an sich bekannter Weise durch ein Kationenaustauschharz gegeben, wodurch die L-Glutaminsäure auf dem Harz adsorbiert wird. Die adsorbierte L-Glutaminsäure wird dann mit verdünntem wäßrigem Ammoniak aus dem Harz eluiert. Die in üblicher Weise durchgeführte Kristall!-

sation der L-Glutaminsäure aus dem auf diese Weise erhaltenen Eluat liefert 120 g L-Glutaminsäure.

Beispiel 2

Mit Hilfe von Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15 806 wird ein Nährmedium beimpft, das auf 3 1 die folgenden Substanzen enthält: 60 g Natriumacetat, 30 g Ammoniumsulfat, 1,5 g KH₈PO₄, 1,5 g K₂HPO₄, 1,5 g MgSO₄-7H₂O, 0,6 g FeSO₄ -7 H₂O, 0,060 g MnSO₄ · 4H₂O, 6 g Fleischextrakt, 6 g Pepton, wobei der Rest Wasser ist und das Medium auf pH = 6,0 bis 7,0 eingestellt worden ist. Es wird eine aerobe Schüttelkultur bei 27 bis 3O⁰C durchgeführt. 8 g L-Glutaminsäure je Liter werden innerhalb einer Züchtungsdauer von 40 Stunden angesammelt. ¹S

Die Reinigung in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise liefert 19,8 g reine, kristalline L-Glutaminsäure.

Beispiel 3

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Mit Hilfe von Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15 806 wird ein Nährmedium beimpft, das aus den folgenden Bestandteilen besteht: 200 g Natriumacetat, 100 g Pepton, 50 g Fleischextrakt, 50 g Hefeextrakt, 25 g Natriumchlorid und Wasser auf 101 aufgefüllt und das auf pH = 6,5 bis 7,5 eingestellt worden ist. Es wird 24 Stunden bei 30⁰C unter Schütteln und aeroben Bedingungen gezüchtet.

Danach werden 10 ecm der auf diese Weise erhaltenen 24-Stunden-Kultur zum Beimpfen eines wäßrigen Fermentationsmediums verwendet, das je 101 Medium die folgenden Bestandteile enthält: 2 kg Natriumacetat, 1 kg Ammoniumsulfat, 50 g KH₂PO₄, 50 g K₂HPO₄, 50 g MgSO₄-7H₂O, 20 g FeSO₄ -7H₂O, 2 g MnSO₄ · 4H₂O, wobei der Rest Wasser ist. Es wird sodann bei 30⁰C unter Schütteln und unter aeroben Bedingungen gezüchtet. Während des Züchtens wird allmählich eine wäßrige Lösung zugegeben, die 4 Teile Essigsäure und 1 Teil Ammoniumacetat enthält, wodurch der pH-Wert der Fermentationsflüssigkeit auf pH = 6,8 bis 7,8 gehalten wird. Auf diese Weise werden in einer Züchtungszeit von 48 Stunden 50 g L-Glutaminsäure je Liter angesammelt. Die Fermentationsausbeute beträgt demnach 45 Gewichtsprozent, bezogen auf die Gewichtsmenge der verwendeten Essigsäure.

Die Reinigung in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise liefert 4,0 kg L-Glutaminsäure.

Wenn die Reinigung der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gebildeten L-Glutaminsäure mit Hilfe von Kationenaustauschharzen durchgeführt wird, kann man z. B. handelsübliche Kationenaustauschharze verwenden, die sich in der Η-Form befinden. Derartige Austauschharze werden durch Kondensation von Aldehyden, wie z. B. Formaldehyd, mit Phenolen oder Phenolsulfonsäuren usw. erhalten. Ein sulfoniertes Kationenaustauschharz vom Polystyroltyp kann ebenfalls verwendet werden; derartige Harze sind im Handel unter der Bezeichnung »Amberlite« erhältlich.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Glutaminsäure durch Züchten von Mikroorganismen der Gattung Corynebacterium in Nährmedien, die Essigsäure und/oder Alkaliacetat bzw. Ammoniumacetat als alleinige Kohlenstoffquelle enthalten und kein NH₄H₈PO₄ aufweisen, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus der Gattung Corynebakterium, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15 806 einsetzt.

   In Betracht gezogene Druckschriften:
   Britische Patentschrift Nr. 889 187.

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