Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Glutaminsäure mittelst Corynebacterium acetomlutamicum oder einem Mutant davon Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Glutaminsäure durch Kultivieren von Corynebacterium acetoglutami- cum oder einem Mutant davon in einem Nährmedium,
das eine assimilierbare Stickstoffquelle und als einzige assimilierbare Kohlenstoffquelle Acetationen enthält. Im besonderen betrifft diese Erfindung ein Verfahren zur.
fermentativen Herstellung von L-Glutaminsäure durch Kultivieren von Corynebacterium acetoglutamicum ATCC N. 15806 oder einem Mutant davon unter aeroben Bedingungen in einem wässerigen Nährmedium, das als einzige assimilierbare Kohlenstoffquelle Essig säure, Natriumacetat, Kaliumacetat oder Ammonium acetat enthält.
Es sind bereits viele Mikroorganismen bekannt, die neben ihrer Fähigkeit, L-Glutaminsäure aus Kohlehy draten zu erzeugen, auch befähigt sind, L-Glutamin- säure aus Essigsäure als einziger assimilierbarer Koh- lenstoffquelle zu bilden.
Eine solche fermentative Her stellung von L-Glutaminsäure aus Essigsäure durch eine der bereits bekannten Bakterienarten ist jedoch mit dem Nachteil verbunden, dass die Ausbeute an Glutamin säure aus einem Essigsäure als assimilierbare Kohl'en- stoffquelle enthaltenden Nährmedium bedeutend gerin ger ist als jene, die bei Verwendung von Kohlehydraten erhalten werden kann. Die fermentative Umwandlung von Essigsäure zu L-Glutaminsäure mit Hilfe der besag ten Bakterien ist somit von keiner praktischen Bedeu tung und kann nicht in kommerziellem Ausmass ange wendet werden.
speziellen neuen Art, nämlich Corynebacterium aceto- glutamicum (KY Nr. 3513), welche aus dem Boden in der Nähe von Tokyo, Japan, isoliert und auch aus tieri schen Exkrementen erhalten wurde. Wie hier in der Folge gezeigt wird, ist der Mikroorganismus ein Coryne- bacterium. Sein Epitheton beruht auf seiner Eigen schaft, aus Essigsäureionen enthaltenden Nährmedien L-Glutaminsäure in erheblichen Mengen zu erzeugen.
Diese Eigenschaft, grosse Mengen L-Glutaminsäure aus Essigsäure in der Fermentationsflüssigkeit, und zwar aus einem Essigsäureionen enthaltenden wässerigen Nährmedium, das zum aeroben Kultivieren des besag ten Corynebacterium acetoglutamicum KY Nr.
3513 oder einer wirksamen Mutationsart desselben verwendet wird, zu erzeugen, löst das Problem der fermentativen Her stellung von L-Glutaminsäure in kommerziellem Aus- mass aus verhältnismässig billigem Rohmaterial, Essig säure oder deren obengenannten Salzen, als einziger assimilierbaren Kohlenstoffquelle. Der vorerwähnte Corynebaeterium acetoglutamicum (KY Nr. 3513), ATCC 15806, hat die folgenden Eigen schaften: <I>A.
Morphologische Charakteristika</I> Gestalt der Bakterie: Gewöhnlich kurze Stäbchen mit abgerundeten En den, manchmal elliptisch oder keulenförmig. Vorkom men einzeln oder paarweise.
Grösse: 0,8 bis 1,2 X 1,2 bis 3,0. Bewegungsfähigkeit: Nicht bewegungsfähig. Metachromatische Körnchen beobachtet. Verzweigte Zellen nur selten erkennbar. Gram-positiv (in einer alten Kultur werden bis zu 50 % Gram-negative beobachtet) Der Hauptgegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwirklichung eines kommerziellen Verfahrens zur fermentativen Herstellung von L-Glutaminsäure aus Essigsäure, Natriumacetat,
Kaliumacetat oder Ammo- niumacetat als Rohmaterial-Kohlenstoffquelle. Dieser Gegenstand wird erreicht durch die Verwendung einer <I>B. Charakteristika der Kultur</I> 1. Agarplatte: Ziemlich schwaches Wachstum, kreisförmig, leicht erhaben bis flach, glatt, gleichmässig, blassgelb, opak, matt, ziemlich trocken.
2. Schrägagar: Mässiges bis schwaches Wachstum, fadenförmig, erhaben bis flach, matt, glatt, opak, blass gclb, butterartig.
3. Nährbrühe: Leicht trüb, flockiger Niederschlag, goruchlos.
4. Stabilisiertes Agar: Am besten obenauf, faden- förmig.
5. Glucose-Nähragar: Schwaches oder kein Wachs tum.
<I>C. Physiologische Charakteristika</I> 1. Optimale Temperatur: 25-30 C (etwas Wachs tum bei 37' C) 2. Optimales pH: 6-8 3. Beziehung zu freiem Sauerstoff: aerob bis fakul tativ anaerob 4. Lackmusmilch: Unverändert 5. Gelatine: Nicht verflüssigt 6. Schwefelwasserstoff: Keine Bildung 7. Indol: Keine Bildung B. Stärke: Nicht hydrolysiert 9. Nitrat: Nicht reduziert 10. Catalase: Positiv 11. Urease: Positiv 12. Acetylmethylcarbinol: Keine Bildung 13. Methylrot-Probe: negativ 14.
Von Kohlenhydraten wird keine Säure gebildet 15. Grosse Mengen von L-Glutaminsäure werden aus Essigsäure erzeugt 16. Wenn Glukose oder Essigsäure als Kohlenstoff quelle verwendet wird, wird NH.iH-PO4 als einzige Stickstoffquelle in Hucker's Medium nicht gebraucht 17. Zellulose wird nicht zersetzt Die vorliegende Bakterie wurde nach Bergey's Ma nual of Determinative Bacteriology, 7th edition klassi fiziert.
Diese Art gehört zur Familie der Corynebac- tcriaceae weil sie Gram-positiv ist, nicht Sporen-bildend, aerob und stabförmig mit Körnchen ist. Ferner ist es richtig, dieselbe in die Gattung des Corynebacterium einzuordnen, weil sie Gram-poshiv, nichtbewegungsfä- hig ist, Zellulose nicht ze-,setzt und aus tierischen Exkre menten isoliert wurde.
Punkte, in denen diese Art sich von verwandten Arten unterscheidet, sind die folgenden:
EMI0002.0042
Vorliegende <SEP> Bakterie <SEP> Corynebacterium <SEP> Corynebacterium
<tb> pseudodiphtheriticum <SEP> equi
<tb> Farbe <SEP> im <SEP> Nähragar <SEP> blassgelb <SEP> grau <SEP> oder <SEP> creme <SEP> gelbbraun <SEP> bis <SEP> gelb
<tb> oder <SEP> rosa <SEP> bis <SEP> rot
<tb> Wachstum <SEP> im <SEP> Nähragar <SEP> ziemlich <SEP> schwach,
<SEP> ziemlich <SEP> trocken <SEP> feucht <SEP> gewöhnlich <SEP> feucht
<tb> Optimale <SEP> Temperatur <SEP> 25 <SEP> bis <SEP> 30 <SEP> C <SEP> 37 <SEP> C <SEP> 25 <SEP> bis <SEP> 37 <SEP> C
<tb> Wachstum <SEP> bei <SEP> Zusatz <SEP> inhibiert <SEP> stimuliert
<tb> von <SEP> Glukose Eine Kultur von Corynebacterium acetoglutamicum KY No. 3513 ist unter der Zulassungsnummer ATCC 15806 in der American Type Culture Collection, Rock- ville, Maryland, hinterlegt.
In dem Verfahren gemäss der vorliegenden Erfin dung werden die Rohmaterialien: Essigsäure, Natrium acetat, Kaliumacetat usw. als assimilierbare Kohlen stoffquellen verwendet, während die anorganischen oder organischen Stickstoffquellen, die üblicherweise bei der fermentativen Herstellung von Glutaminsäure unter Verwendung von gewöhnlichen glutaminsäureproduzie- renden Bakterien angewandt werden, hier ebenfalls als Stickstoffquellen gebraucht werden.
Zur Durchführung des Kultivierens gemäss der vor liegenden Erfindung wird der pH des Nährmediums (Kulturmedium), das als einzige Kohlenstoffquelle Es sigsäure oder eines der vorerwähnten Salze und eine vorstehend definierte Stickstoffquelle enthält, auf 6,0 bis 7,0 eingestellt und dann sterilisiert.
Sodann wird die Art, welche gemäss der vorliegenden Erfindung ange wandt wird, Corynebacterium acetoglutamicum KY No. 3513, in besagtes Kulturmedium eingeimpft und bei 25 -30' C unter aeroben Bedingungen inkubiert. Mit Vorteil wird während der Kultivierungsdauer durch Zusatz einer wässerigen Lösung von Essigsäure oder Ammoniumacetat der pH auf 6,8 bis 7,8 eing--stellt. Die Fermentation ist beendet,
wenn die Erzeugung von L-Gultaminsäure ihr Maximum erreicht hat, gewöhn lich nach 2 bis 3 Tagen. Dann wird die Fermentations- flüssigkeit durch ein Ionenaustausch-Harz gegossen, auf an sich bekannte Art, an welchem die L-Glutaminsäure adsorbiert wird. Dann wird die Glutaminsäure mit wäs serigem Alkali extrahiert, konzentriert und abgekühlt.
Kristalle von L-Glutaminsäure werden abgetrennt und umkristallisiert. Das Gewinnen oder Ernten der L-Glu- taminsäure aus der Fermentationsflüssigkeit ist kein Teil der vorliegenden Erfindung und kann nach irgendeinem der früheren Fermentationsverfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure ausgeführt werden (jede andere bekannte Methode zur Gewinnung von L-Glutamin- säure aus einem Fermentationsmedium, in welchem sie erzeugt wurde, kann ebenfalls angewandt werden).
Die folgenden erläuternden aber nicht einschränken den Beispiele der derzeit bevorzugten Verkörperungen der Erfindung erklären die vorliegende Erfindung noch näher. Die Erfindung erstreckt sich nicht nur auf die Verwendung des vorerwähnten Mikroorganismus (Co rynebacterium acetoglutamicum KY No. 3513), sondern auch auf Mutationsarten desselben mit den Charakteri stiken der besagten Bakterie und hergestellt zum Beispiel durch Mutation unter der Einwirkung von ultravioletten Strahlen usw.
<I>Beispiel 1</I> Ein Kulturmedium bestehend aus Natriumacetat 500 g Ammoniumsulfat 200 g Fleischextrakt 20 g Calciumcarbonat 300 g KH2p04 10 g M9S04. 7<B>11</B>20 2 g Harnstoff 30 g und Wasser ergänzt auf 10 Liter wird mit Natriumhydroxydlösung auf pH 7,0 eingestellt.
Corynebacterium acetoglutamicum wird in das so erhal tene Fermentationsmedium eingeimpft und das Schüt- telkultivieren wird bei 30 C aerob durchgeführt. In 72-Stunden-Kultur sammeln sich 15g L-Glutaminsäure pro Liter an. 10 Liter der so erhaltenen Fermentations- flüssigkeit werden in einer an sich bekannten Weise durch ein Kationenaustausch-Harz gegossen, wobei die L,Glutaminsäure adsorbiert wird.
Die adsorbierte L Glutaminsäure wird dann mit verdünntem wässerigem Ammoniak aus dem Harz ausgewaschen. Kristallisation der L-Glutaminsäure aus dem Ausfluss, welcher diese in Lösung enthält, nach herkömmlichen Methoden, er gibt eine Ausbeute von 120 g L-Glutaminsäure. <I>Beispiel 2</I> Corynebacterium acetoglutamicum KY No. 3513 (ATCC No. 15806) wird in ein Kulturmedium einge impft, das pro 3 Liter folgendes enthält:
Natriumacetat 60 g Ammoniumsulfat 30 g KHZP04 1,5 g K2HP04 1,5 g M9S04.7H20 1,5 g FeS04.7H"0 0,6 g MnS04. 4H0 0,06 g Fleischextrakt 6 g Pepton 6 g Der Rest ist Wasser, und das Medium wird auf pH 6,0 bis 7,0 eingestellt. Es wird bei 27 bis 30 C aerob schüttelkultiviert. In einer 40-Stunden-Kultur sammeln sich pro Liter 8 g L-Glutaminsäure an.
Reinigung nach der in Beispiel 1 beschriebenen Me thode ergibt eine Ausbeute an gereinigten Kristallen der L-Glutaminsäure von 19,8 g.
<I>Beispiel 3</I> Corynebacterium acetoglutamicuAn KY No. 3513 (ATCC No. 15806) wird in ein Kulturmedium der fol genden Zusammensetzung eingeimpft: Natriumacetat 200 g Pepton <B>100</B> g Fleischextrakt 50 g Hefeextrakt 50 g Natriumchlorid 25 g und Wasser ergänzt auf 10 Liter bei pH 6,5 bis 7;5. Inkubation bei 30 C während 24 Stunden unter Schütteln bei aeroben Bedingungen.
Darnach werden 10 ml der auf diese Weise erhal tenen 24-Stunden-Kultur in ein wässeriges Fermenta- tionsmedium eingeimpft, welches pro 10 Liter Medium folgendes enthält: Natriumacetat 2 kg Ammoniumsulfat 1 kg KH2P04 50 g K2HP04 50 g M9S04.7H20 50 g FeS04. 7H20 20 g MnS04.4H20 2 g Der Rest ist Wasser. Die Inkubation wird dann bei 30 C unter Schütteln bei aeroben Bedingungen durchge führt.
Während diesem Kultivieren wird allmählich eine wässerige Lösung, die 4 Teile Essigsäure und 1 Teil Ammoniumacetat enthält, zugesetzt, wodurch der pH der Fermentationsflüssigkeit auf pH 6,8 bis 7,8 gehalten wird. Auf diese Weise wurden in einer 48-Stunden-Kul- tur 50g L-Glutaminsäure angesammelt.
Die Fermen- tationsausbeute ist somit äquivalent zu 45 Gew.-% be- zogen auf das Gewicht der verwendeten Essigsäure.
Reinigung auf die in Beispiel 1 beschriebene Art er gab eine Ausbeute von 4,0 kg L-Glutaminsäure.
Wo die Reinigung der L-Glutaminsäure, die nach dem vorliegenden Fermentationsverfahren hergestellt wurde, mit einem Kationenaustausch-Harz durchgeführt wird, kann zum Beispiel ein im Handel erhältliches kationenaustauschendes Harzmaterial des säureregene rierten Typus verwendet werden. Solche Austausch harze werden durch Kondensation von Aldehyden, wie Formaldehyd, mit Phenolen oder Phenolsulfosäuren und dergleichen erhalten.
Ein Kationenaustauschharz vom Typus eines sulfonierten Polystyrols kann ebenfalls ver wendet werden; solche sind im Handel unter dem Na men Amberlite erhältlich.