DE1517762A1 - Verfahren zur Herstellung von Lipase - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Lipase, insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von Li- ^ pase mittels Fermentation Besonders betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Lipase oder lipasehaltigen Substanzen durch Fermentierung mit Mikroorganismen, die zum

Genus Trichosporon gehören·

Die echten Lipasen sind hydrolytische Enzyme, die Fette in Fettsäuren und Glyzerin hydrolysieren. Die Lipase des Pankreas, die bisher aus dem Pankreas von Tieren extrahiert und gebildet wurde, katalysiert die Hydrolyse einer großen Vielzahl von ( Fetten und ölen. Die Geschwindigkeit dieser Hydrolyse ist am größten, wenn die Substrate Fettsäuren von mittlerer Kettenlänge enthalten, beispielsweise Laurinsäure und Myristinsäure. Obwohl somit die Lipase eine wertvolle und brauchbare Substanz ist, sind die bisherigen Extraktionsverfahren zur Herstellung derselben ungünstig, umständlich und kostspielig, da die Rohmaterialien hinsichtlich der Menge begrenzt sind und die Extraktions- und ßeinigungsverfahren kompliziert sind. Dies stellt den grundsätzlichen Hachtell bei der Entwicklung von groß-

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technischen Verfahren zur Herstellung von Lipase dar.

Ein Ziel der Erfindung besteht in einem verbesserten Verfahren zur Herstellung von Lipase, bei dem die Nachteile und Mangel der bisherigen Verfahren überwunden werden. Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht in einem Verfahren zur Herstellung von Lipase durch Fermentierung, welches in wirksamer und einfacher Weise ausgeführt werden kann. Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht in einem Verfahren zur Herstellung von Lipase durch Fermentierung, wobei das Produkt in hoher Reinheit und guter Ausbeute erhalten wird.

Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht in einem Verfahren zur Herstellung von Lipase durch Fermentierung, das vorteilhaft und wirtschaftlich im großtechnischen Maßstab unter hoher Produktausbeute durchgeführt werden kann. Diese und weitere Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden ausführlichen Beschreibung.

Gemäß der Erfindung wurde festgestellt, daß eine neue Species eines Stammes von Hefe, der zum Genus Trichosporon gehört, die Eigenschaft besitzt, Lipase in großen Mengen zu bilden. Insbesondere wird der Stamm Trichosporon heteromorphum gemäß der Erfindung eingesetzt. Durch Kultivierung dieses Stammes unter aeroben Bedingungen ergibt sich ein billiges und vorteilhaftes Verfahren zur Herstellung von Lipase,

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Trichosporon heteromorphum, der gemäß der Erfindung eingesetzte Lipase bildende Mikroorganismus, wurde aus den Exkrementen von Tieren isoliert. Die fungologischen Merkmale sind folgende:

1. Form: Diese ist äusserst variabel. Die Form dieses Mikroorganismus wurde als kreisförmig, oval, elliptisch, und zylindrisch in einer Größe zwischen 4 - 6 /* χ 5 - 12 / beobachtet. Häufig läßt sich ein Mycel aus längeren zelli'örmigen Ketten mit einer Größe von 4-6/^ux15-35/* beobachten.

2. Schrägschnittkultur und Großkolonie: Der zentrale Teil derselben ist geringfügig vorstehend und zeigt eine pulverartige Natur, Der periphere Teil ist halb durchscheinend und besteht aus strahlenförmigem Mycel.

3. Schlitzkultur: Es wird genuines Mycel, Pseudomycel und Arthrosporen gebildet. Die Arthrosporen zeigen eine langkettige Form in Luft.

4. Statische Kultur: Eine dicke brüchige Mycelmembrane wird in Malzbrühe gebildet und die Oberfläche derselben wird

faltig und pulverig. Die ausgefallenen Zellen sind kreis- ^ förmig oder elliptisch und werden durch Sporenbildung vermehrt«

5« Endosporen, Endosporen werden nicht gebildet.

o. Äthanol: Äthanol wird verwertet.

7. Fermentierung von Zucker: Es erfolgt keine Fermentierung.

8. Verwertung von Zucker: Glukose, Galaktose und Rohrzucker werden verwertet, jedoch Maltose und Laktose nicht verwertet.

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BAD GriiÜiNAL.

9. Albumin: Albumin wird nicht zersetzt. 10. Nitrate: Nitrate werden nicht verwertet.

Wenn die vorstehenden Eigenschaften mit denjenigen verglichen werden, wie sie in J. Lodder & N.J.W· Kreger-Van Rij: The Yeast, A Taxonomic Study, (1952) Horth Holland Publishing Co., Amsterdam and Interscience Publishers, Inc., New York (1952) und anderen Veröffentlichungen beschrieben sind, sind es solche, die mit dem Genus Trichosporon vert bunden sind. Jedoch sind diese Eigenschaften nicht identisch mit den Beschreibungen von bekannten Species. Beispiele hierfür sind in Tabelle I zusammengefaßt. Deshalb wurde der Species der Name Trichosporon heteromorphum nov. sp. gegeben.

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' Tabelle I

Physiologische Eigenschagten von Hefen des Genua

Trichosporon

Verwertung von Zucker

Verwertung von Kitraten

Verwertung von
Äthanol

Verwertung von Albumin

Rohrzucker Maltose Laktose

Trichosporon pullulans

Trichosporon

cutaneum co

° Trichosporon ^ω infestans

Trichosporon margaritiferum

Trichosporon sericeum

Trichosporon capitatum

Trichosporon fermentans

Trichosporon behrendii

Trichosporon heteromorphum

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung, ohne sie zu begrenzen. Falls nichts anderes angegeben ist, sind die angegebenen Prozentsätze auf das Gewicht je Liter Wasser bezogen.

Beispiel 1

Trichosporon heteromorphum No. 33-1 ATCG 20001 wurde in ein Kulturmedium aus 1 <%> Sojabohnenöl, 2 % Sojabohnenrückstand und 1 i» Maisquellflüssigkeit inokuliert. Die Kultivierung wurde dann aerob mit Belüftung und Rühren bei 30⁰C ausgeführt.

Nach einer Kultivierung während 48 Stunden wurden Hyeel und Festsubstanzen durch Zentrifugieren entfernt. Der Aktivitätswert der in der Kulturflüssigkeit angesammelten Lipase wurde durch das quantitative Analysenverfahren nach Fiore und Nord, Archives of Biochemistry, Band 23, Seite 473 (1949), bestimmt; er betrug 13,0 Einheiten/ml.

Beispiel 2

Die Kultivierung wurde mit dem gleichen Stamm und unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 1 durchgeführt. Die nach Zentrifugieren der erhaltenen Kulturflüssigkeit gewonnene überstehende Flüssigkeit wurde unter vermindertem Druck und bei 30⁰C auf ein Zehntel ihres ursprünglichen Volumens eingeengt.

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^BAD

~ 7 —

Die zweifache Menge des erhaltenen Volumens wurde an kaltem Aceton zu der Lösung zugefügt, wobei sie mit Eis gekühlt und gerührt wurde. Der weiße fasrige Niederschlag wurde gesammelt und mit einer geringen Menge Aceton, welches mit Eis gekühlt worden war, gewaschen. Dann wurde der Niederschlag in einem Exsiccator unter vermindertem Druck getrocknet. Es wurde dadurch eine rohe Probe von Lipase mit gelb-gräulicher Farbe erhalten. Der Aktivitätawert derselben, bestimmt wie in Beispiel 1, betrug 45 Einheiten/mg.

Die gemäß der Erfindung durchgeführte Fermentierung mit dem Stamm Trichosporon heteromorphum zur Herstellung von Lipase wird unter aeroben Bedingungen, beispielsweise aerobes Schütteln der Kultur, bei einer Temperatur zwischen etwa 25 und 35Έ und bei einem pH-Wert von etwa 6,0 bis 7_f5 durchgeführt. Bei 1- bis 5-tägiger Kultivierung unter diesen Bedingungen ergeben sich große Mengen der gewünschten Lipase.

Es können sowohl synthetische Kulturmedien als auch natürliche Nährmedien gemäß der Erfindung verwendet werden, so lange sie die wesentlichen Nährstoffe für das Wachstum des angewandten Stammes Trichosporon enthalten. Zu derartigen Nährstoffen gehören Substanzen wie Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische^ferbindungen und dergleichen, die von dem eingesetzten Stamm bei Zugabe in geeigneten Mengen verwertet werden. Als Kohlenstoffquelle seien beispielsweise Kohlehydrate, wie

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BAD

Glukose, Galaktose und Rohrzucker,sowie Sojabohnenöl oder Sojabohnenrückstand oder andere geeignete Kohlenstoffquellen aufgeführt. Es kann sowohl eine einzige Kohlenstoffquelle als auch ein Gemisch aus 2 oder mehr Verbindungen angewandt werden. Als Stickstoffquelle können verschiedene Arten von anorganischen oder organischen Salzen oder Verbindungen, beispielsweise Harnstoff oder Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumphosphat und dergleichen, oder natürliche stickstoffhaltige Substanzen, wie Maisquellflüssigkeit, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, Kaseinhydrolysate, Reisschalenextrakt und dergleichen verwendet werden. Auch die Stickstoffquelle kann aus einem einzigen Stoff oder einem Gemisch von 2 oder mehr geeigneten Sub- . stanzen bestehen. Als anorganische Verbindungen, die dem Kulturmedium zugegeben werden können, seien Magnesiumsulfat, Natriumphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, Eisensulfat oder andere Eisensalze, Manganchlorid, Kalziumchlorid und dergleichen aufgeführt. Gewünschtenfalls können auch geeignete wachstumsfördernde Mittel dem Medium zugegeben werden.

Nach beendeter Fermentierung kann die Lipase aus dem Fermentationsfiltrat durch geeignete Maßnahmen, wie z.B. Ausfällung, abgetrennt Herden,

Die Erfindung wurde im vorstehenden anhand bevorzugter Ausführungsformen beschrieben, ohne darauf begrenzt zu sein.

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Claims (1)

1. PATENTANSPRÜCHE

   ο Verfahren zur Herstellung von Lipase, dadurch gekennzeichnet, daß ein zur Bildung von Lipase geeigneter und zum Genus Trichosporon gehörender Mikroorganismus in einem wässrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen gezüchtet und die in der erhaltenen Fermentierflüssigkeit enthaltene Lipase gewonnen wird»

   2β Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung bei einer Temperatur zwischen etwa 25 und 35¹C und bei einem pH-Wert zwischen etwa 6,0 und 7,5 durchgeführt wird.

   3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, zur Herstellung von Lipase dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Trichosporon heteromorphum in einem wässrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen kultiviert und die in der er-

   haltenen Fermentierflüssigkeit angesammelte Lipase gewonnen wird·

   4ο Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung bei einer Temperatur zwischen etwa 25 und 35⁰C und bei einem pH-Wert von etwa 6,0 bis 7,5 durchgeführt wird.

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   5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Trichosporon heteromorphum ATCC 20001 verwendet wird.

   6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Trichosporon herteromorphum ATCC 20001 in einem wässrigen, eine Kohlenstoffquelle und eine Stickstoffquelle enthaltendem Nährmedium unter aeroben Be· dingungen bei einer Temperatur von etwa 25 bis 35⁰Cf insbesondere 30⁰C kultiviert und die in der erhaltenen Fermentierflüssigkeit angesammelte Lipase gewonnen wird.

   7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Gewinnung der Lipase durch Ausfällung erfolgt.

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