DE2517762A1 - Verfahren zur herstellung von mit l-lysin angereicherten hefen, die selbst bei der gaerung citronen-, isocitronen- und glutaminsaeure produzieren - Google Patents

Description

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ENTREPRISE DE RECHEäCHES ET D'ACTIVITES PETR0LIEEE8 E.R.A.P., 7 rue Nelaton jf PARIS (75015)

INSTITUT FRANGAIS DU PETROLE

4- avenue de Bois-Preau / RUELL MaLMAISON (92502)

Verfahren zur Herstellung von mit L-Lysin angereicherten Hefen, die selbst bei der Gärung Gitronen-, Isocitronen- und Glutaminsäure produzieren

Die Erfindung betrifft die Herstellung neuer Hefestämme und ihre Verwendung bei der Gärung, wobei einerseits die Herstellung einer mit L-Lysin angereicherten Biomasse, die für die Verwendung als Lebensmittel bestimmt ist, sowie andererseits eine gleichzeitige Herstellung von Citronensäure ermöglicht wird.

Hefen der Art Candida lipolytica sind bekannt, beschrieben wurde die Verwendung dieser Hefen bei der Gärung auf KohlenwasserstoffSubstraten.

Es wurde gefunden, daß man durch Mutagenese von Hefen der Art Candida lipolytica neue Stämme erhält, die gegen die Wirkung von Lysinanaloga resistent sind, die gewöhnlich in einer geringen Konzentration für die bekannten Hefen dieser Art toxisch sind.

Die bei der Verwendung dieser resistenten Stämme erzielten Ergebnisse zeigen sich einerseits an einer beträchtlichen Erhöhung des intracellularen Gehaltes an Lysin, und andererseits an der Eigenschaft, gleichzeitig große Mengen an Citronensäure und Isocitronensäure in einem Gärungsboden auszuscheiden, der Kohlenwasserstoffe und Mineralsalze in unbegrenzten Mengen enthält, ohne daß dabei in einem bestimmten Augenblick der Gärung irgendeine Verbindung zugesetzt werden muß, die einen dieser Effekte bewirkt.

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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von mit L-Lysin angereicherten Hefen, die selbst organische Säuren z.B. Citronensäure produzieren, dadurch gekennzeichnet, daß man

- in einer ersten Stufe mindestens eine Hefe der Art Candida lipolj^tica der Wirkung eines mutagenen Mittels aussetzt,

- in einer zweiten Stufe die erhaltene Hefe in einem Medium kultiviert, das ein Lysinanalogon in einer Konzentration enthält, die 50 - 100 mal höher ist als die Konzentration, gegen die die Ausgangszellen der j Hefe empfindlich sind und

- in einer dritten Stufe, die erhaltene resistente Hefe ' auf KohlenwasserstoffSubstraten kultiviert.

Das in der ersten Stufe verwendete mutagene Mittel kann ein ehem. mutagenes Mittel oder ein mutagenes Strahlungsmittel ! sein. "

Als nicht einschränkendes Beispiel können einerseits NMU (Nitrosomethylurethan) und NMG (Nitrosomethylguanidin) als chemische Stoffe und andererseits die Röntgen- oder UV-Strahlen als physikalische Strahlungsmittel genannt werden.

In der zweiten Stufe des Verfahrens kann die Kulti- ^:

vierung in Gegenwart eines beliebigen Lysinanalogons er- . : folgen.

Es ist bekannt, daß, die Hefestämme Candida gegen I

die Wirkung aller Lysinanaloga, die deshalb von

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Spesialisten toxische Analoga genannt werden, empfindlich sind.Zu den toxischen Analoga gehören z.B.

Aminocyclohexylalanin

Transdeshydrolysin (TDL)

S (ß -Amino-ä-th3^rl )cystein

2,β -Mamino-heptan-oxalycinsöure

Amino^-methyl-cyclohexan.^lycin

Aza-4-lysin

Methyl-5-lysin

^ - Amino-L - hydroxycapronsöure

O -llyd.roxylys.ln

Die Sensibilität dieser Lysinanaloga besteht darin, daf? die Ge{;cnv;art eines Lysinanalogons in dem Nährboden f'Ar die Hefe der Art Candida das Wachstum dieser Hefe vollständig blockiert.

Die zv.^reite Stufe besteht darin, daß man die Hefe, die in der ersten Stufe in einem Medium erhalten wird, das ein Lysinanalogon in einer relativ hohen Konzentration enthält, kultiviert und dadurch die Hefen auswählt, die sich in Gegenwart eines Lysinanalogons entwickeln können.

Die verschiedenen Hefestämme können gegenüber dem gleichen Analogon- nicht die gleiche Sensibilität aufweisen, und ein bestimmter Stamm hat aufgrund der Zelldurchlässigkeit für das Analogon nicht die gleiche Sensibilität gegenüber-allen toxischen Analoga.

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-k-

Jeder Stamm hat eine spezifische Sensibilität gegenüber einem in einer bestimmten Konzentration verwendeten Analogon. Den einen Stamm resistent zu machen, bemüht man sich, das Analogen auszuwählen, dem gegenüber der Stamm am sensibelsten ist, wodurch der Dissimilationseffekt der Toxizit"t bezüglicher Permeabilität beseitigt und ein Gt?.nm, der später wirksamer ist, erhalten wird.

Tatsächlich kann ein Stamm, der gegenüber demjenigen Lysinanalogon , gegen das er am sensibelsten ist resistent gemacht wurde, in Gegenwart der anderen Lysinanaloga wie üblich kultiviert werden, während es, wenn man ein beliebiges Analogen wählt, nicht sicher ist, daß der Stamm in Gegenwart anderer toxischerer Lysinanaloga weiter wachsen kann.

Zur Bestimmung der Resistenz der in der ersten Stufe erhaltenen Hefen gegenüber einem Lysinanalogon verteilt man die Zellsuspension in ■ einem Gelose -Nährmedium , das das Lysinanalogon in einer Konzentration enthält, die 50-100iaal höher ist als die Konzentration , gegenüber der die normalen Zellen empfindlich sind. Diese Konzentration beträgt im allgemeinen 10 Mol. Nur resistente Zellen können sich entwickeln.

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Pan kann folgende Versuche durchführen:

- der erste Versuch besteht darin, daß nan nach einem Tag der Kultivierung in einem minimalen Medium die Menge des für jeden Stamm erhaltenen intracellularen Lysins mißt und diese Menge mit der für einen wilden Stamm erhaltenen Menge vergleicht.

- der zweite Versuch besteht darin, daß iTio.il für jeden Stamm die Hemmung des IIoniocitrat-Synthetase-Enzyms durch Lysin mißt; bei mehr als 60 ';,' einer Enzymhemmung läßt sich beobachten, daß der Stamm sich nicht entwickelt.

Als guter nutanter Stamm wird derjenige bezeichnet, der diese Versuche erfolgreich besteht.

In der dritten Stufe kultiviert man die resistente in der zweiten Stufe ausgewählte liefe auf Kohlenwasserstoffsubstraten. Diese Kultur ermöglicht die Herstellung einer mit L-Lysin angereicherten Biomasse und die Ausscheidung von Stoffwechselprodukten z.Sv" Citronen- und Isocitronensäure und/oder Glutaminsäure.

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Eine Bestimmung des prozentualen Gehalts an Lysin bezogen auf Zellproteine zeigt, daß dieser in der riipcs des Zellwachstums sehr zunimmt, was ein Vorteil f^;ir den Nährwert der erhaltenen Biomasse i ^.t

Hs ist belmnnt, daß L-Lysin eine für Säugetiere essentielle Aminosäure ist und bei jungen Tieren eine wichtige Rolle als Wachstumsfaktor spielt. Überraschenderweise wurde festgestellt, daß die Kultur dieser gegen toxische Lysinanaloga resisteuten Zellen auf n-Poraffinen von einer gleichzeitigen und reichlichen Produktion an Citronen-und Isocitronensäure und einem Gärungsmedium begleitet wird, in dem keines der mineralischen oder organischen Nährelemente mengenmäßig begrenzt ist, während die sensiblen Zellen, nachdem sie zur Bildung der resistenten Zellen ,gedient haben in dem gleichen Medium und unter den gleichen Bedingungen nur in geringem Ilaße ausscheidende Wirkung haben.

Tatsächlich versucht man gewöhnlich den Stoffwechsel zu blockieren um eine Ausscheidung der StoffWechselprodukte zu erreichen, in dem man mindestens ein Nährelement dieses Medium^mengenmäßig begrenzt, was bei der vorliegenden Erfindung nicht der .Fall ist.

Das ist ein zweiter Vorteil , denn es ist bekannt, daß Citronensäure eine in der Nahrungs-,Arznei- und Reinigungsmittelindustrie häufig verwendete organische Säure ist.

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Die Di r;r?iGchaft dieser Zellen, sich mit L-Lysin anzureichern und Citronensäure in einem nr^.raffire enthaltenden Fährmedium und unter optimalen Vnohsturnsbedingungen auszuscheiden, ist der dritte Vorteil, der eine kontinuierliche Herstellung in ein, zwei oder drei Stufen erra^figli°ht sov*ie eine dauernde Rückbesinnung von lysinreichen Zellen einerseits und einer, wässrigen Lösung, in der die Citronensäure konzentriert ist, andererseits am Ausgang des Hetzten Produktionsfermenters und zwar durch einfaches Zentrifugieren.

Eine Analyse dieser wässrigen Lösung zeigt, daß sie IG ο citronensäure in bedeutenden I-Iengen und GTut'ini?.i"^Mure in geringen Mengen enthält.

Die Durchführung des Verfahrens besteht z.B. darin, daß man ein Inoculum einer Hefekultur vorbereitet, die die η-Paraffine assimilieren kann, z.B. Candida lypolytica, und sie gegen die Wirkung tonischer Lysinanaloga durch die beschriebenen Tiutagciiese- techniken resistent macht, sowie darin, daf? die G."rung in Gegenwart mindestens eines normalenC.Q-Cp₀ Paraffins durchgeführt wird.

Zur Vorbereitung des Inoculums v/erden, llefezellen der Art Candida. , die gegen ein toxisches Lysinannlogon resistent gemacht worden sind, unter aeroben Bedingungen in einem wässrigen Medium suspendiert , das eine assimilierbare Kohlenstoff quelle, im allgemeinen eine Fraktion n~paraffirischer C₁^-Cp_n Kohlenwasserstoffe, und eine assimilierbare Stickstoffquelle enthält.

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Da.ι Kerb'um wird z.B. 36 Stunden bei einer Temperatur von 25-30⁰C gerührt.

Hach Erhalt einer ausreichenden Dichte von Candida-Ze]lon in der Impfkultur, wird ein Teil dem Görungs-

rugesetzt, das eine n-parnffinj sehe kohlen-Htnffh.al tif;o Quelle, eine assimilierbare Stickstof fquello, rowie verschiedene Kationen, Anionen und Vitamine , die als wachstumsfordernde Komponente bekannt sind, enthält.

AIr. in dem Gärungsmedium verwendete Stickstoffqueller! können z.B. mineralische Ammoniumsalze gewählt werden von denen vorzugsweise Ammoniumnitrnt , /-Tinoniumsulfat, Aramon.iumchi orid,Ammoniumt und Harnstoff verwendet werden.

Folgende Kationen und Anionen fördern das

Wachstum der Hefen der Art Candida : Kalium, ' J.ia tr ium, Magnesium, Mangan, Eis en, Kalzium, Kupfer, , Kobalt,saure Phosphate,Sulfate,ChI oride,Borate, j ■ Kollybdatc und !Titrate.

Allgemein bekannt ist, daß der Zusatz von Vitaminspuren z.B. Thiamin und Biotin zu den Hefekulturen der Art Candida das Zellwachstum Y)O feinst i f]l.

T?9ch dem Aunse'tzung erfolgt die Gärung in einem bewegten und stark belüfteten Medium bei einer Temperatur zwischen 25 und 35 C ,vorzugsweise 3° ⁽'·

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Ot er "Π ?: ^rvckluft v'ird in das Gärungcnoriium ira Verh'H tri.i π όπ etwa 0,5-1,5 1 Luft/Hin. und pro Liter ilecHun eingeleitet.

Der p^TI-^T,Vert des die wachsenden Zellen enthaltenden '!0''¹IUP" vird ^orzug.sweise so eingestellt, daH .-li- c¹^r-chv;ij-]'\} ^¹Oit der Vermehrung drrr fiefezellen ^T'tiran.l *rt, d.h. auf einen Vtert -wischen 3 und6, vorr.i'c^.^ise h und5 .

Diepe Einstellung des pll-iiertes kann 7..B. durch r.usatr. einer v/-"psrigen basischer Löc-unf; z.T. ^T v?srif:cr A'.Hiionio.k-, Soda-, Kali- , r-Iati'iunihydrogen- oder J""nliT:"':);,"dro^encartonotlosung erfolgen.

Vorzuge'·.eic?e v.'ird der gewünschte pIi-^T:.^Tert durch Zusatz einer ammoniakalischen wässrigen Lösung aufrechterhalten, um das beste Wachstum der Zellen zu £:ov^:'"hri eisten.

^T-^T?ch. einem ausreichenden Viachstum der Hefen, v:enn die nof.^rcr.d.igen Mengen an Citronensäure und Isocitroneiisäure gebildet sind, wird die Gärung unterbrochen und das Medium zentrifugiert.

Die als Filterkuchen erhaltenen mit Lysin angereicherten Zellen v/erden mit den für die Behandlung vo-i liefen für nahrungsmittel vor deren Lagerung gewöhnlich verwendeten Mitteln gewaschen und getrocknet.

Die im Überstand konzentrierte Citronensäure wird auf bekannte ^T/.^reise z.B. in Form von KoJ ziumsalz abgetrennt.

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iian kann diesem Überstand z.B. eine stochiometrische Menge Kaliumchlorid zusetzen,die für die Chelatbiüdung der in der Lösung enthaltenen Citronensäure notwendig ist, diese Lösung durch Zusatz z.B einer ammoniakalischen Lösung neutralisieren und ,"chlioßlich das Kalziumcitrat CiUr₀I₁ Erhitzen auf die Siedetemperatur unter einstündigem Rühren ausfüllen.

Die Citronensäure kann über ihr Kalziumsalz durch Behandlung mit Schwefelsäure zurückgev.'onnrn ν erden .

: Man kann sie z.B. mit kaltem Wasser waschen,

■ sie in auf !3-10⁰C abgekühltem Wasser suspendieren,

; der gerührten., bei dieser Temperatur gehaltenen

! Suspension die für die voll st findige Freisetzung

der Citronensäure notv/endige stöchionetrische

j Menge an Schwefelsäure zusetzen, d.h. bis der pIMiert der Suspension sich auf 1,75-1,35 stabilisiert hat.

Das gebildete KaIziumsulfat wird durch Filtration zurückgewonnen.

Das Filtro.t wird über eine basische und anschließend · eine saure Kolonne mit Ionenaustausch'orharzen geleitet, um die in der Lösung verbliebenen mineralischen Verunreinigungen zu beseitigen, es wird, bei vermindertem Druck bei einer Temperatur unterhalb oder bei 35°C zur Trockene verdampft, wodurch quantitativ die kristalline Masse -11-

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d.er Ehrend dor ni'rung gebildeten Citronensäure fcvnnnen vlrd.

Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Zrfindung n"hcr erläutern.

a) Herstellung von gegen Transdehydrolysin ( TDL) resistenten Ilutanten und Versuch

Ein vilder Stamm IFF 29 wird zunächst eine Nacht c.uf einem festen Gelose-Doden, der einen Tlefee::trr\l:t vni OHukose enthält, kultiviert. I¹Io Zeile?! '..'erden in sterilem destilliertem "vosser auf eine Dichte von 10 Zellen/ml, suspendiert. 5 nl dieser Suspension werden in eine Petrischale (Durchmesser 5 cn) gegeben und eine Minute lang einer UV-Strahlung (2000 erg/mm ) ausgesetzt. Fraktionen von 0,1 ml der Zellsuspension v/erden auf Petri-Schaleii ^erteilt, die ein Iledium mit einem minimalen

h Ge"¹ orcr.ekrlt dem mit 5.10- ΓΙ M-5-Dcshydrolysindichlorhydr^t (TDL) zugesetzt v.^rerden. Diener ^r'oden hat folgende Zusammensetzung:

A₂- Salze ri xiVor.e ΙΙη^ΗΓΟ/, /gar
Thiamin

: 1^0 ml : 10 g

: 2<"> g je 1Π00 ml destilliertes Wasser

: 10 ppm

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ORIGINAL INSPECTEÖ

Zu?-?irnr.r.r.r.tzung der Λ_ο ~ Sau ze

10 g KH₂FO₄ 5 g Mg SO₄ · 7 HpO !Ia Cl : 1 g

0,75 E CaCl₂ (wasserfrei)

50 g (mi₄)₂_so₄

10 ml von Λ. Oligoelementen je 1000 ml destilliertes Wasser

A, -Salze : H,-BO₇ ( 500 mg)

I s J

Cu SO₇, · 5 H₂ O ('40 mg) EJ (1^0 m-)

Fc Cl₅ · G HpO (200 mg)

Iln SO,, , Λ HoO (530 mg)

H₀MoO, . 2 Ho O (160 mg)

Zn 0O₄ . 7 lip O (AOO mg) pro 100Q ml destilliertes

Wasser

Nach 5 Inkubationstagen bei 28 C wird, eine bestimmte Anzahl recistenter Kolonien abgetrennt. Sie racheen. ohne Schwierigkeiten auf TDL 5.10 ' H> röhrend der wilde Stamm IFF 29 auf TDL 5-10"-' 1-1 völlig blockiert ist. Von den 34 isolierten Stämmen (die als mg1-mg34 bezeichnet sind) wachsen 25 ebensogut wie der Stamm IFF 29 auf Glukose undn-Hexadecant und werden für spätere Untersuchungen

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ie^o Ct"noe werden auf e.incra flüssigen ϊ-Tedium I'.iilti"':! cr^J". (eins gleiche v.'.ie oben angegeben, jedoch ohne i^gar) nach einen Tag bei 20 C werden die Zellen .in der exponentiellen Phase gewonnen (5-7 10 Zellen/ml), vom Nährboden getrennt, sie v/erden im Wasserbad extrahiert dn?? Trockengewicht wird bestimmt.

Die Lysinl-'nnzentration darin wird nach der Methode von Shimura und Vogel bestimmt (BBA, 1966, 118 , 396). Die besten Resultate v/erden bei der Mutanten mg-5 erhalten, die 189/<ϊ!ο1 Lysin pro g Trockengewicht enthält, während IFP 29 8ⁿAHol enthält.

b) Kulti'rierung und Säureherstellung

Ausgehend von einem Gelosetyp, der Zellen von Candida "lipolytica mg - 5 enthält, die gegen Konzentration von 10~-' Ii Trans-^-deshydrolysin resistsnt sind, setzt man ein 100ml -BechergTas mit 20 ml doσ flüssigen Mediums A mit folgender Zu-P-""μιφϊ cn c et riling an:

KK₂PO₄

Na₂HPO₄- 12 H₂O 1,5 β/1

Mg	SO	Ca	Cl	4	.· 7	7	H2O	O	ο	,7 g/1
	Fe	SO		SO/,	5		O		4 g/1
Cu	SO	2			O	,1 g/1
4	t	H2		2 mg/1
4	t	H2		5//S/1

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Λ /ι

Π EO 1°/'C/1

3 3

Hn SO₇₊ . 7H₉O 10 /_c/l

Zn S0_7j . 7HpO . 10 ."g/l (ΓΠί_Λ)₆'No₇O₂^AH₂O ΙΟΟ,,β/1 Co (NO^)₂. 6H₂O 10/g/l Hefeextrakt inn _m5/i Leitungswasser eingestellt auf n-paraffinische CL₉-C.,-,-Fraktion 15 g/l

ο Die Cnn/¹:'d·"¹. -Zellen werden bei 30 C noch Fixierung des Ξocherglases mit dem Inoculum o.uf einem PJihrtipch , der sich mit einer Geschwindigkeit von 1Λ-0 Umdrehun_t ^r;e]i /Min dreht, inkubiert

ITnch 36 Stunden Inkubationszeit v/erden 10 ml dieses Inoculun5'"erv:endet, um ein 1,5 Ü-Fernbach-Becherglas ■ mit 20^ri ::;! des Ilährbodens Λ anzusetzen.

Nach 36 Inkubationszeit bei 30 C auf dem Rührtisch dienen diecc 200 ml des die wachsenden Zellen mg - 5 enthaltenden Bodens dazu, einen Fermenter mit einem Volumen voη 4 1 , der 21 des Ilährbodens A enthalt, anzusetzen.

Die Einstellung des pH-Wertes erfolgt durch Zucatz einer wässrigen"4ΓΤ-Ammoniaklösung.

Dac Ilcdium wird bei 2000 Umdrehungen /Γϋη bei 3ⁿ"C geröhrt, ^T.-"hrend der pH-Viert bei 5 gehalten v/ird und eine n-Taraffinschicht in einer Menge \^ron durchschnittlioli 2,5 ral/h ]continuierlich in den Fermenter eingeführt wird. -15-

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1 'jⁿ !L'tundon Kultiv.i erun/rr-zeit betragt die Gecng? pt eingeführten Kohlenwasserstoffen 140 g/l,

^T.-'"hr?nrl di° Konzentration des Gärungsnediums an ausgerohiecler^n I'roduktcn folgende ist:

Citronensäure 1 Zo β/1 Isocitronensäure ^0,5 g/l Glutaminsäure 1,8 g/l

Der Geholt an L-Lysin in der erhaltenen Biomasse beträgt bezogen auf die Proteine 1/--15 C' , gemessen an eiren ZeT !hydrolysat m.it einem automatischen Aminon'aircnnn^l3^rsator' JEOL.

Wenn man zum Vergleich unter den gleichen Bedingungen Candida-Zellen kultiviert, die gegenüber einem toxischen L-Lysinanalogon nicht resistent sind, betragen die im Gärungsmedium ausgeschiedenen !!engen an Zitronen-,Tsocitronen ~ oder Glutaminr"n.re iv~^Tger 1 Gramm oder Hull, während der Gehalt vo]i Lysin bezogen auf die Zellproteine 3-9% beträgt.

Die in Fei spiel 1 beschriebene Gärung v.-ird mit vergleichbaren Resultaten wiederholt, venn man Candida-lipolytica Zellen verv/endet, die gegenüber Amino-3-oyclohexylalanin, S-/--Amino - Hthylzystein, 2,C- DT-^Tnino-heptansMure, Oxalysin^ Amino- 3- methylcyclohexan-glycin, Aza-A-lysin, IIeth3O.-5-lysin, ·' - Amino-" - hydroxycapronsäure und S-IIydroxylysin resi.?tent sind, und dabei analog Beispiel 1a arbeitet.

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Ein? vn.e in Beispiel 1 behandelte Vorkultur wird in einem 4-Liter-Fermenter, der 21 des Nährbodens A mit der in Beispiel 1 b angeführten Zusammensetzung enthält, eingeimpft.

Dier.em Loden wird die C,^- ^c oq~ Fraktion so zugesetzt, daß die Konzentration 15 g/l beträgt, man beginnt die Kultivierung bei 30 C und einem pH- V/ert von 5 durch Zusatz von 4N Ammoniak unter Belüftung.

Nach 40 Stunden beträgt das Trockengewicht etwa 25 g/l. In diesem Augenblick beginnt man die Kultivierung Indem man kontinuierlich einerseits den ITänrboden A und andererseits ?g/i C^_n- C__o Kohlen- vrr.snrrtof.f pro Sti-inde einspritzt.

! Man entnimmt ein dem Nährboden entsprechendes Volumen.

Die Verdünnung beträgt 0,070 , die stund! .i ehe Froduk-• tivit'it betragt 0,^-7 g/l an Zellen und 0,49 g/lGitronens"ure.

Es sei doran erinnert, daß die Verdünnung bezogen ist auf eine vorgegeben Gärungszone:

Menge der Einführung ( oder der Entnahme)eines Gärungsmediums ausgedrückt in Volumen pro Stunde

' Volumen des Reaktors

Das ist folglich das Gegenteil der Verweilzeit.

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Beispiel 4

Die Vorkultur wird wie in Beispiel 1 behandelt. Man impft mit dieser Vorkultur einen "einstufigen" Reaktor mit einer Kapazität von 41, der 31 des Nährbodens 1b enthält und beginnt die Kultivierung wie in Beispiel 3.

Nach 40 Stunden bei einem pH-Wert von 4,5 und einer Temperatur von 30⁰C ist der Boden in dem Moment in dem das Trockengewicht etwa 25 g/l beträgt, kontinuierlich durchsetzt. Die

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Verdünnung beträgt 0,05 h . Die stündliche Kohlenwasserstoffmenge beträgt 1,5 g/l.

ι Man entnimmt den Nährboden in einer Menge die der Beschickungsmenge gleich ist. Unter diesen Bedingungen stabilisiert sich die erste Stufe bei einer Konzentration an Zellen von 10,2 g/l und Ci tronensäure von 1,3 g/l.

Der der ersten Stufe entnommene Boden wird in einen zweiten Fermenter die "Ausscheidungsstufe" gegeben, dessen Volumen 61 beträgt.

Der zweite Fermenter enthält ein Medium, dessen Zusammensetzung ; der des Mediums A gleich ist.

Zu Beginn der Hefeinjektion in die zweite Stufe werden n-Paraf-

; fine in einer stündlichen Menge von 0,4 g/l eingespritzt. ι
j
Man entnimmt den Boden in einer Menge, die der Beschickungsj menge gleich ist. Der zweite Fermenter stabilisiert sich j bei einer Konzentration an Zellen von 17 g/l bei einer Ver-

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dünnung von 0,03 h .

Die am Ausgang der 2. Stufe kontinuierlich entnommene Flüssigkeit enthält 15,5 g/l Citronensäure.

Die stündliche gesamte Produktivität an Citronensäure beträgt also 0,46 g/l und an Zellen 0,51 g/l.

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Claims (9)

1. Patentansprüche

   η j Verfahren zur Herstellung von mit L-Lysin angereicherten Hefen, die selbst organische Säuren, 7..Ώ. CitronensMure produzieren, dadurch gekennzeichnet, daß man

   - in einer ersten Stufe mindestens eine

   Hefe der Art Candida lipolytica der Wirkung eines mutagenen Mittels aussetzt

   - in einer zweiten Stufe die erhaltene : Hefe in ein^m Medium kultiviert, das

   ein Lysinanalogon in einer Konzentration enthölt, die 50- 100 mal höher ist als die Konzentration , gegen die ; die Ausgangszellen der Hefe empfindlich

   ; sind,

   - und in einer dritten Stufe die erhaltene . resistente Hefe auf Kohlenwasserstoff-

   Substraten kultiviert.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als mutagenes Mittel chemische mutagene Mittel oder muto.gene Strahlungsmittel verwendet.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch" gekennzeichnet, daß die Konzentration des Lysin,?.ii?.logons im Nährboden der zweiten Phase des Verfahren.¹" mindestens 10"""KoI beträgt.

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4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3> dadurch gekennzeichnet, daß das in der zweiten Stufe des Verfahrens verwendete Lysinanalogon das Analogon ist, gegen das die kultivierte Hefe am sensibelsten ist.
5. 3« Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das in der dritten Stufe verwendete Kohlenwasserstoffmedium mindestens ein normales Parafin mit 10-20 C-Ätonen enthält.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet, daß das Medium eine assimilierbare Stickstoffquelle enthält.
7. 7. Verfahren nach Anspruch 5 und/oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Nährboden Kationen und Anionen, die das Hefewachstum begünseigen, enthält.
8. 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7» dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung bei einem PH-Wert zwischen 3 und 6 bei einer Temperatur zwischen 25 und 30 C in einem bewegten und belüfteten Medium erfolgt.
9. 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 ^is 8, dadurch gekennzeichnet, daß man am Schluß der Kultivierung die L-Lysinreiche Hefe vom Reaktionsmedium abtrennt, das nützliche Säuren, z. B. Gitronen-, Isocitronen- und gegebenenfalls Glutaminsäure enthält, die anschließend auf bekannte Weise abgetrennt werden.

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