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Verfahre. zur Gewinnung eines Mutterkornalkaloidgemisches Die Erfindung
bezieht sich auf ein Verfahren zur Gewinnung eines Mutterkornalkaloidgemisches,
das im wesentlichen Ergocryptinin, Agroelavin und Elymoelavin enthält und aus dem
diese Mutterkornalkaloide in hohen Mengen abgetrennt werden können.
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Im Jahre 1943 haben A. S t o 11 und A. Hofmann gezeigt, daß das von
G. Barger und F, H. farr (J. Chem. Soc., gi, S.377, 1907) und F. K r a f
t (Asch. Pharm., Zq.q., S.336, igo6) usw. beschriebene Ergotoxin nichts anderes
als ein Gemisch der drei Alkaloide Ergocristin, Ergoeryptin und Ergocornin ist und
daß das von C. T a n r e t, C. It. AEad. Sei., 81, S. 891 (1875), beschriebene Ergotinin
ebenfalls ein Gemisch von Ergocristinin, Ergocryptinin und Ergocorninin darstellt,
die Isomere der obigen drei Alkaloide sind.
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Gegenwärtig sind somit zehn sogenannte peptidische Mutterkornalkaloide
bekannt, nämlich Ergotamin, Ergosin, Ergocristin, Ergocryptin, Ergocornin, Ergotaminin,
Ergosinin, Ergocristinin, Ergocryptinin und Ergocorninin, von denen die letzten
fünf Alkaloide Isomere der entsprechenden ersten fünf Alkaloide sind.
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Alle diese Alkaloide werden als solche oder in Form ihrer Derivate
für klinische Zwecke in großem Umfang verwendet. Die Versorgungslage auf dem Gebiet
der Alkaloide ist jedoch in allen Ländern
sehr ungünstig, da einerseits
zum Züchten des Mutterkorns auf Getreide, insbesondere Roggen, große Landflächen
und zahlreiche Arbeitskräfte erforderlich sind und andererseits das Wachstum des
Mutterkorns durch die klimatischen Bedingungen sehr stark beeinflußt wird. Wenn
es nun möglich wäre, Mutterkornpilze künstlich zu züchten und aus der Kultur peptidische
Alkaloide zu gewinnen, so könnte das natürliche Mutterkorn durch gezüchtetes Mutterkorn
ersetzt werden, wodurch eine günstige Aussicht auf die Massenproduktion der Alkaloide
eröffnet würde, nicht zu sprechen von der sich daraus ergebenden Leichtigkeit der
wissenschaftlichen Kontrolle der Mutterkornalkaloidproduktion.
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Im Hinblick auf dieses Ziel haben viele Forscher die künstliche Züchtung
von Mutterkornpilzen erforscht, bisher allerdings mit negativem Resultat. Tatsächlich
kann einzig das Agroclavin, ein nichtpeptidisches Mutterkornalkaloid, das ebenfalls
von den Urhebern der vorliegenden Erfindung entdeckt wurde (Annual Reports of Takeda
Research Laboratory, 10, S. 45, 162, 171 [195i]), durch künstliche Züchtung von
Mutterkornpilzen in größerer Menge dargestellt werden.
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Aus einer Reihe von Mitteilungen, z. B. von A. McCrea (Ameri. Jour.
Bot., 18, S. So [1951]), H. Kreitmair und W. Küssner (Biochem. Zeitschrift, 239,
S. 189 [1931]), R. Jaretzky (Archiv der Pharmazie), 273, S. 348 (1935) E. B a l
d a c c i (Farmaco Sei. e. Tec, L., 1, S. 187 [1941]), S. K. Sim und H. W. Youngken
(Fr. Jour. Amer. Pharmac. Ass. Sci. Ed., 40, S.344 [195i]) usw., geht hervor, daß
es diesen Verfassern nicht gelungen ist, sogenannte peptidische Mutterkornalkaloide
in größerer Menge durch künstliche Züchtungsverfahren herzustellen.
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M c C r e a (Schweizer Apothekerzeitung, Nr. 17, 1931, S. 193/194)
beschreibt die Züchtung des gewöhnlichen Ergot-Fungus Claviceps purpurea, der parasitisch
auf Roggen wächst, und behauptet dabei, Ergotoxin erhalten zu haben. Es ist jedoch
anzunehmen, daß es sich hier um Alkaloidgemische handelte, die nur geringe Mengen
der wertvollen Alkaloide Ergotoxin oder Ergotamin lieferten. Jaretzky (Archiv der
Pharmazie und der Deutschen Pharmazeutischen Gesellschaft, Bd. z73, Jg. 45, 1935
S. 348 bis 357) beschreibt ein Verfahren zur quantitativen Alkaloidbestimmung bei
bekannten., auf saprophytischen Nährböden gezüchteten Mutterkornpilzen.
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Die Erfinder des vorliegenden Verfahrens hatten schon früher erkannt,
daß eine Pilzart, die parasitisch auf Agopyrum semicostatem Nees, Trisetum befidum
ohwi, Festuca rubra L. usw. wächst, bei künstlicher Züchtung ausschließlich das
Mutterkornalkaloid Agroclavin erzeugt.
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Erfindungsgemäß wird eine hohe Ausbeute der wertvollen Alkaloide Ergocryptinin,
Agroclavin und Elymoclavin erreicht durch saprophytische Züchtung eines Mutterkornpilzes
oder seiner Mutanten, der auf Elymus mollis Trinius in der Natur parasitisch wächst
und der mit Claviceps purpurea nicht identisch ist. Die Alkaloide werden aus der
Kultur oder dem Kulturfiltrat in üblicher Weise gewonnen. Die Aufarbeitung ergibt
eine verhältnismäßig große Menge Agroclavin und -Elymoclavin und gleichzeitig eine
außerordentlich große Menge Ergocryptinin, eines Alkaloids vom Peptid-Typus. Die
Ausbeute an Ergocryptinin beträgt bis etwa i bis 2 g auf ioo g durch Trocknen des
Kulturmaterials erhaltener Trockensubstanz.
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Die Erfinder stellten ferner fest, daß Agroclavin und Elymoclavin
aus der Kultur dieses Mutterkornpilzes leicht gewonnen werden können und daß das
Ergocryptinin ebenfalls leicht aus der Kultur abgetrennt werden kann, weil Ergocristinin
und Ergocorninin nicht darin enthalten sind, deren Anwesenheit die Abtrennung des
Ergocryptinins schwierig gestälten würde.
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Die morphologischen Eigenschaften der Pilze sind im folgenden angegeben.
Die Sklerotien sind zylindrisch bis spindelförmig, weisen wenig oder keine Furchen
auf und messen 3 bis 2o mm in der Länge und i bis 7 mm in der Breite. Die Perithezien
sind eiförmig bis birnenförmig und messen 13o bis 25o #t in der Höhe und 3ö bis
16o #L in der Breite. Die Asci sind geradlinig und mehr oder weniger zylindrisch,
sie weisen eine Länge von 7o bis 165 R, und eine Breite von 2 bis 4,5 #t auf. Die
Ascosporen sind fadenförmig und weisen eine Länge von 4o bis 140 #t und eine Breite
von 0,3 bis 1,2 g, auf. Die jüngeren Mycelien sind dicker, d. h. 2 bis 7
R, im Durchmesser. Die Conidiosporen sind eiförmig bis ellipsoidförmig und weisen
eine Länge von 3 bis 18 #t und eine Dicke von 2 bis 8 g, auf. Die Conidiosporenproduktion
der verschiedenen Stämme ist unterschiedlich, die einen erzeugen reichlich Conidiosporen,
während andere wenig Conidiosporen produzieren.
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Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zu verwendenden Ergotpilze
können durch ihre physiologischen Eigenschaften einwandfrei erkannt werden. Nur
Elymus mollis Trinius wird in der Natur von den Sclerotien des Ergotpilzes, der
nach der Erfindung verwendet werden soll, befallen. Dieser Ergotpilz kann daher
leicht erkannt und von den befallenen Pflanzen gesammelt werden. Aus den Stämmen
der so erhaltenen Ergotpilze oder deren künstlichen Mutanten können dann die Stämme,
die genetisch vollkommen sind und eine hohe Alkaloiderzeugung haben, ausgewählt
und zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens benutzt werden.
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Bei festen Kulturen beträgt das Verhältnis der Ausbeuten von Ergocryptinin,
Agroclavin und Elymoclavin gewöhnlich etwa 100: 35 : io. Das Verhältnis der Ausbeuten
ist auch in flüssigen Kulturen im großen und ganzen immer dasselbe. Werden die Alkaloidausbeuten
flüssiger Kulturen im Zellenmaterial und im flüssigen Teil gesondert bestimmt, so
zeigt sich, daß das Verhältnis der Ausbeuten in jedem der beiden Teile der Kultur
je nach den Kulturbedingungen, insbesondere je nach der Menge und Art des Stickstoff
liefernden Materials und der Zeit schwankt. Ergocryptin,
Ergosinin,
Ergosin usw. werden im allgemeinen in beiden Arten von Kulturen in sehr kleinen
Mengen produziert.
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Als Züchtungsmethoden eignen sich sowohl solche mit festen Kulturen
als auch solche mit flüssigen Kulturen. Die letzteren Methoden sind jedoch den ersteren,
die im allgemeinen unter Verwendung von mit Nährflüssigkeit getränkten Zuckerrohr
rückständen (Bagasse) oder anderen porösen Substanzen durchgeführt werden, hinsichtlich
der Ausbeute an Ergocryptinin überlegen. Das unter Verwendung flüssiger Kulturen
durchgeführte Verfahren ist auch insofern sehr günstig, als es im großen Maßstab
durchgeführt werden kann.
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Bei Verwendung flüssiger Kulturen ist es zweckmäßig, die das Ergocryptinin
enthaltende Kulturflüssigkeit sukzessive nach dem sogenannten Pilzdecken-Kulturverfahren,
bei welchem die unter der Pilzdecke befindliche Nährflüssigkeit von Zeit zu Zeit
durch eine andere Flüssigkeit ersetzt wird, herzustellen.
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Das nährstoffliefernde Material des Mediums wird je nach Kulturbedingungen
und dem physiologischen Zustand des Pilzes gewählt. So ist z. B. die Zahl der Nährstoffarten
in gewissen Fällen auf ein bestimmtes Maß beschränkt, während in anderen Fällen
der Bereich der verwendbaren Nährstoffarten ziemlich breit ist.
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Für das erste Kulturmedium im Pilzdecken-Kulturverfahren eignen sich
als Kohlenstoff liefernde Materialien schwer assimilierbare Substanzen, wie z. B.
Mannit, während als Stickstoff lieferndes Material leicht assimilierbare Substanzen,
wie z. B. Asparaginsäure, Glutaminsäure, Asparagin, Glutamin oder die Ammoniumsalze
der Asparaginsäure, Glutaminsäure, Bernsteinsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Apfelsäure
und Weinsäure, geeignet sind. Im zweiten oder in den nachfolgenden Kulturmedien
muß jedoch die Zusammensetzung des Nährmaterials nicht notwendigerweise gleich wie
im ersten Medium sein. Die Zusammensetzung des Nährmaterials kann weitgehend variiert
werden.
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Zum Züchten der Mutterkornpilze nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
eignet sich ein Kulturmedium mit einem PH von 3,a bis 8,q.. Am günstigsten ist ein
piI von 6,6 bis 6,8. Bei einem pH von weniger als 3,2, oder von mehr als
8,4 ist die Vermehrung der Pilze erschwert. Die für die Vermehrung der Pilze günstige
Kulturtemperatur liegt zwischen io und 3q.° C, wobei die optimale Temperatur in
der Nähe von a8° C liegt. Die für die Vermehrung des Pilzes günstigen Bedingungen
stimmen jedoch mit den für die Bildung von Mutterkornalkaloiden günstigen Bedingungen
nicht überein. Durch Hemmung der Vermehrung des Pilzes in gewissen Ausmaßen wird
eine Verbesserung der Alkaloidausbeute bewirkt. Für diesen Zweck eignen sich vorzugsweise
die folgenden Behandlungen: (A) Man erhöht in abnormer Weise die Menge eines oder
mehrerer der Kohlenstoff und Stickstoff liefernden Materialien und anorganischen
Salze im Medium oder versetzt das Medium vor dem Impfen mit dem Pilz oder während
der Inkubation mit anderen Substanzen, die die Vermehrung des Pilzes hemmen. (B)
Die Kulturtemperatur wird auf einer etwas unter der für die Vermehrung des Pilzes
optimalen Temperatur liegenden Stufe gehalten. (C) Man verwendet ein Medium mit
einem pH, das etwas größer oder kleiner ist als das für die Vermehrung des Pilzes
optimale pH. (D) Die Menge des Impfmaterials, die Tiefe des Kulturmediums, die Variierung
der Zusammensetzung des Nährmaterials, die Regulierung der Luftzufuhr oder der Bestrahlung
mit sichtbarem und unsichtbarem Licht usw. üben den gleichen Einfluß aus.
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Es sind viele Substanzen bekannt, die die Vermehrung des Pilzes hemmen.
Als Beispiele solcher Substanzen seien genannt: Salze von Schwermetallen, wie z.
B. Mangan, Kupfer und Zink, Salze der Fluorwasserstoffsäure, Salzsäure, Blausäure
und Arsensäure, substituierte oder unsubstituierte aromatische Säuren und Fettsäuren,
wie z. B. Ameisensäure, Monohalogenessigsäuren, Benzoesäure, Aminobenzoesäure, Phenylessigsäure,
Naphthylessigsäure, Substanzen mit alkoholischen oder phenolischen Hydroxylgruppen,
aromatische basische Verbindungen, wie z. B. Anilin, Diphenylamin, Indol, Chinolin
und deren Derivate, aromatische Kohlenwasserstoffe und synthetische oder aus Bakterien
erhältliche Antibiotika u. a. m. Diese Substanzen sind im allgemeinen in kleiner
Menge wirksam. So genügen beispielsweise Mengen von weniger als o,oi°/o einer dieser
Substanzen im Medium zur Erzielung der angestrebten Hemmung. Substanzen, die die
Vermehrung des Pilzes nur schwach hemmen, wie z. B. Natriunichlorid, werden natürlich
in größeren Mengen verwendet.
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Im Gegensatz zum parasitisch gewachsenen Mutterkorn, das bis jetzt
zur Herstellung von peptidischen Mutterkornalkaloiden verwendet worden ist, enthält
die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erzeugte Kultur eine außerordentlich große
Menge Ergocryptinin. Die Kultur enthält dagegen weder Ergocristinin noch Ergocorninin,
deren Vorhandensein die Abtrennung des Ergocryptinins erschweren würde. Die Trennung
der einzelnen Alkaloide ist somit sehr erleichtert.
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Das Gesamtgemisch der erhaltenen Alkaloide wird in bekannter Weise
von Verunreinigungen abgetrennt, worauf die einzelnen Alkaloide aus dem Gesamtgemisch
isoliert werden.
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Die Löslichkeit von Ergocryptinin, Agroclavin und Elymoclavin in Wasser
steigt in der Reihenfolge ihrer Aufzählung. Die Verteilungskoeffizienten dieser
drei Alkaloide zwischen wäßrigen und organischen Lösungsmitteln sind deutlich voneinander
verschieden. Diese Alkaloide werden deshalb auf Grund der Unterschiede ihrer Löslichkeit
in Wasser oder organischen Lösungsmitteln oder auf Grund ihres Verhaltens bei der
Abtrennung aus ihren Lösungen voneinander getrennt. Der Unterschied ihrer Verteilungskoeffizienten
zwischen -zwei miteinander nicht mischbaren Lösungsmitteln wird für diesen Zweck
ebenfalls ausgewertet. Außerdem
kann man für den gleichen Zweck
auch die Methoden der Dialyse, der Elektrodialyse, der Elektrophorese, der Adsorption
mittels Kationenaustauschharzen usw. anwenden, allerdings mit weniger Erfolg.
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Um die Alkaloide vom festen Material, z. B. von dem aus festen Kulturen
erhaltenen Kulturmaterial, oder von dem aus flüssigen Kulturen erhaltenen Zellenmaterial
abzutrennen, werden sie im Rohzustand oder nach dem Trocknen und Pulvern des Materials
mit einem organischen Lösungsmittel, wie z. B. Äther, Benzol, Methanol, Äthanol,
Aceton, Chloroform oder Essigsäureäthylester, unter sauren, neutralen oder alkalischen
Bedingungen extrahiert, wenn nötig nach vorgängiger Entfernung von Fetten mittels
Ligroin oder Benzin.
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Der flüssige Teil des aus flüssigen Kulturen erhaltenen Kulturmaterials
wird wie folgt aufgearbeitet Die Flüssigkeit als solche oder ein durch Einengung
erhaltenes Konzentrat wird auf ein pH von weniger als 4 eingestellt und nach dem
Filtrieren mit einem organischen Lösungsmittel, wie z. B. Chloroform oder Essigsäureäthylester,
ausgeschüttelt, wobei das Ergocryptinin in das organische Lösungsmittel übertritt,
während Agroclavin und Elymoclavin in der sauren Flüssigkeit zurückbleiben.
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Wird die Kulturflüssigkeit unter nahezu neutralen Bedingungen mit
einem organischen Lösungsmittel extrahiert, so treten das Ergocryptinin und das
Agroclavin in das organische Lösungsmittel über, wobei nur das Elymoclavin in der
Flüssigkeit zurückbleibt.
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Gemäß einer weiteren Arbeitsweise wird die Flüssigkeit, wenn nötig
nach Einengung, alkalisch gestellt und dann mit einem mit Wasser nicht mischbaren
organischen Lösungsmittel extrahiert. Man kann auch die Flüssigkeit mit einem Adsorptionsmittel,
wie z. B. saurem japanischem Ton, unter sauren Bedingungen behandeln und dann das
Adsorptionsmittel mit einem organischen Lösungsmittel der Eluierung unterwerfen.
Aus diesen Lösungen werden die einzelnen Fraktionen von Ergocryptinin, Agroclav
in und Elymoclavin nach den für das feste Material angewendeten Methoden abgetrennt.
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Die nach den oben beschriebenen Methoden erhaltenen Fraktionen von
Ergocryptinin, Agroclavin und Elymoclavin enthalten noch Verunreinigungen und müssen
deshalb einer weiteren Reinigung unterworfen werden, um in vollständig reinem Zustand
erhalten werden zu können.
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Elymoclavin ist ein neues Alkaloid, das die folgenden Eigenschaften
besitzt: Es kristallisiert aus Benzol, Chloroform, Äther, Äthylessigester, Aceton,
Methanol, Äthanol oder Wasser in Form farbloser Prismen aus. Die aus Methanol erhaltenen
Kristalle sind monokline Prismen mit dem monoklinen Achswinkel ß = 96° und den Brechungsindizes
a'= 1,62 und ß'= 475 t für die D-Linie. Es schmilzt unter Zersetzung bei 248 bis
252° C. [a]D' = -59°. [a]H -= -98° (Äthanol), [a]n = - i36°, [DJH = - 166° (Pyridin).
Das Elymoclavinmolekül enthält eine N-CH.- Gruppe und besitzt laut den analytischen
Daten die Summenformel Cl. H18 O N2. Wie Agroclavin weist Elymoclavin in seinem
Absorptionsspektrum bei 2S2 m[, ein Maximum und bei 246 m[, ein Minimum auf. Es
wird durch Wolframsäure, Meyers Reagenz und andere Alkaloidreagenzien ausgefällt
und ist in verschiedenen anorganischen und organischen Säuren leicht löslich. Die
Lösungen geben nicht nur die Keller-Reaktion, sondern auch purpurrote und rötlichblaue
Farbreaktionen mit den Lösungen von Vanillin bzw. p-Dimethyl-amino-benzaldehyd in
Schwefelsäure. Elymoclavin ist leicht löslich in Pyridin, löslich in Aceton, Methanol,
Äthanol und Butanol, schwer löslich in Benzol, Toluol, Chloroform und Äther und
unlöslich in Petroläther und Ligroin. Es ist ziemlich löslich in Wasser. Die wäßrige
Lösung reagiert alkalisch. Es ist gegen Sonnenlicht empfindlich. Lösungen von Elymoclavin
in verschiedenen Lösungsmitteln werden braun und beginnen mit der Zeit zu fluoreszieren.
Wie Agroclavin liefert Elymoclavin bei Behandlung mit Säuren oder Alkalien keine
Isomere. Es läßt sich in eine Dihydroverbindung vom F.239 bis 24o° C (unter Zersetzung)
hydrieren [a]D' -143°, [a]x = -I82° (Pyridin). Elymoclavin kann chromatographisch
identifiziert werden. Wird es nach der Fallmethode auf Toyo-Filterpapier Nr. 131
bei 24° C während 13 bis 15 Stunden mit einem durch Schütteln eines Gemisches von
4 Teilen n-Butanol, 5 Teilen Wasser und i Teil Essigsäure und Entfernung der unteren
Schicht hergestellten Lösungsmittel entwickelt, so bildet sich ein Fleck mit dem
Rf-Wert o,67. Manchmal bildet sich ein fluoreszierender Fleck vom Rf-Wert
0,59, der für das Zersetzungsprodukt des Elymoclavins charakteristisch ist.
Nebenbei sei bemerkt, da.ß die Rf-Werte von Lvsergsäure, Ergometrin. Agroclavin
und Ergocryptin unter den gleichen Bedingungen 0,50, o;66, o,82 bzw. o,92
betragen. Elymoclavin ist natürlich wie die anderen Mutterkornalkaloide physiologisch
wirksam und ruft auf den isolierten Kaninchenuterus selbst in einer Verdünnung von
i : 1o ooo ooo eine Reizwirkung hervor. Beispiel i Man beschickt einen Kolben mit
flachem Boden von 31 Inhalt mit 1,21 eines aus Mannit (5 %), Ammoniumglutamat (1
°/o), Magnesiumsulfat (0,03«/o) und Leitungswasser bestehenden Kulturmediums, dessen
pg mit Salzsäure auf 5,2 eingestellt ist. Das Kulturmedium wird mit dem parasitisch
auf Elymus mollis Trin. wachsenden Mutterkornpilz geimpft, worauf die Pilze in Oberflächenkultur
bei 26° C gezüchtet werden. Nach 4o Tagen wird die Kulturflüssigkeit ausgegossen
und mit Schwefelsäure angesäuert. Das zurückbleibende Zellenmaterial wird wiederholt
mit verdünnter Schwefelsäure extrahiert.
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Die vereinigten sauren Flüssigkeiten werden zwecks Adsorption der
darin enthaltenen Alkaloide
mit japanischem saurem Ton ausgeschüttelt.
Das Adsorptionsmittel wird mit Ammoniak befeuchtet und wiederholt mit Äther extrahiert.
Die so erhaltene ätherische Lösung enthält Ergocryptinin, Agroclavin und Elyinoclavin.
Die Aufarbeitung ergab eine Ausbeute von etwa 26o mg reinem Ergocryptinin, 6 mg
reinem Elymoclavin und 9o mg reinem Agroclavin.
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Beispiel e Man beschickt einen Kolben mit flachem Boden von 31 Inhalt
mit z,31 eines aus Mannit (5%), Ammoniumglutamat (o,8%), Kaliumbiphosphat (o,i%),
Magnesiumsulfat (0,030/0) und Leitungswasser bestehenden Kulturmediums, das mit
Salzsäure auf ein p$ von 5,2 eingestellt ist. Das Kulturmedium wird ungefähr in
der im Beispiel i beschriebenen Weise mit Mutterkornpilzen, die auf Elymus mollis
Trin. wachsen, geimpft, kultiviert und aufgearbeitet. Die durch Extraktion des Adsorptionsmittels
erhaltene ätherische Lösung der Gesamtalkaloide wird auf 1 1 eingeengt und wiederholt
mit Portionen von 50 em3 einer i- bis 3 %igen Lösung von Zitronensäure in Wasser
ausgeschüttelt. Die saure Lösung wird alkalisch gestellt und erneut mit Äther ausgeschüttelt,
worauf die ätherische Lösung eingedampft wird, um den Äther vollständig zu vertreiben.
Dabei wird ein Rückstand erhalten, der Ergocryl)tinin, Agroclavin und Elymoclav
in enthält. Die Aufarbeitung ergab eine Ausbeute von 6 mg reinem Elymoclavin, i8o
mg reinem Ergocryptinin und 45 mg reinem Agroclavin.
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Beispiel 3 Man beschickt einen Kolben mit flachem Boden von 31 Inhalt
mit i,21 eines aus Mannit (5%), Asparagin (1,5%), Kaliumbiphosphat (o,8%), Magnesiumsulfat
(o,o5%) und Leitungswasser bestehenden Kulturmediums, das mit Schwefelsäure auf
ein pH von 5,4 eingestellt ist. Das Kulturmedium wird mit dem auf Elymus mollis
Trin. parasitisch wachsenden Stamm von Mutterkornpilzen geimpft, worauf die Pilze
in Oberflächenkultur bei 26 bis 28° C gezüchtet werden. Nach 36 Tagen trennt man
die Kulturflüssigkeit vom Zellenmaterial ab und wäscht das Zellenmaterial mit o,i
n-Schwefelsäure, bis in der Waschflüssigkeit kein Alkaloid mehr nachweisbar ist.
Die Kulturflüssigkeit wird mit der Waschflüssigkeit vereinigt, mit Ammoniak alkalisch
gestellt und unter Verwendung eines Ejektors zweimal mit Äther extrahiert. Der ätherische
Extrakt wird eingeengt und wiederholt mit etwa einem Zehntel seines Volumens an
verdünnter Essigsäure ausgeschüttelt. Die saure Lösung wird mit zwei Portionen von
etwa der Hälfte ihres Volumens an Chloroform ausgeschüttelt, wobei das Ergocryptinin
in das Chloroform übertritt, während das Agroclavin und Elymoclavin in der sauren
Lösung verbleiben. Die Chloroformlösung enthielt Ergocryptinin, Elymoclavin und
Agroclavin. Die Aufarbeitung ergab eine Ausbeute von etwa 24o mg reinem Ergocryptinin,
etwa 8o mg reinem Elymoclavin und etwa 8o mg reinem Agroclavin. Eine kleine Menge
Ergocryptin, Ergocryptiniri und Ergocynin kann aus der Mutterlauge gewonnen werden.
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Beispiel 4 Ein Kolben mit flachem Boden von 31 Inhalt wird mit 1,2l
eines aus Mannit (5%), Asparaginsäure (o,8%), Kaliumbiphosphat (o,i0/a), Magnesiumsulfat
(0,050/0) und Leitungswasser bestehenden Kulturmediums, das mit 30%igem Ammoniak
auf pg 5,o eingestellt ist, beschickt. Das Kulturmedium wird mit einer Abart von
Mutterkornpilz, die aus dem auf Elymus mollis Trin. parasitisch wachsenden Mutterkornpilz
durch Bestrahlung mit Radium erhalten wird, geimpft, worauf der Pilz in Oberflächenkultur
bei 26 bis 28° C gezüchtet wird.
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Nach 32 Tagen wird die Kulturflüssigkeit ausgegossen und die Unterseite
des Zellenmaterials mit einer Lösung von Bernsteinsäure in Wasser (PH etwa 5,o)
so lange gewaschen, bis in der Waschflüssigkeit kein Alkaloid mehr nachweisbar ist.
Das Zellenmaterial wird mittels eines geeigneten neuen Kulturmediums einer sogenannten
»Ersatz-Züchtung« unterworfen.
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Die Kulturflüssigkeit wird mit der Waschflüssigkeit vereinigt, mit
Ammoniak alkalisch gestellt und unter Verwendung eines Ejektors zweimal mit Benzol
extrahiert. Der Extrakt wird eingeengt und wiederholt mit einer kleinen Menge 3
%iger Milchsäurelösung ausgeschüttelt. Dabei wird eine saure Lösung erhalten, die
Ergocryptinin, Agroclavin und Elymoclavin enthält.
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Beispiel s Mutterkornpilze werden unter Verwendung des gleichen Mediums
und des gleichen Stammes wie im Beispiel i in Oberflächenkultur bei 26 bis 28° C
gezüchtet. Nach 35 Tagen wird die Kulturflüssigkeit vom Zellenmaterial abgetrennt.
Die Extraktion mit verdünnter Schwefelsäure, die Adsorption mittels japanischen
sauren Tons und die Eluierung mit Äther werden in der im Beispiel i beschriebenen
Weise ausgeführt. Beispiel 6 Das gemäß Beispie13 erhaltene aseptisch gewaschene
Zellenmaterial wird auf der Oberfläche von i,21 einer aus Glukose (6%), Ammoniumsuccinat
(o,8%), Kaliumbiphosphat (o,i%), Magnesiumsulfat (0,030/0) und Leitungswasser bestehenden
sterilisierten Lösung zum Schwimmen gebracht. Die sterilisierte Lösung ist mit Bernsteinsäure
auf ein p$ von 5,4 eingestellt. Die ortsfeste Kultur wird einer Temperatur von 24
bis 26° C unterworfen. Nach 22 Tagen wird die Kulturflüssigkeit vom Zellenmaterial
abgetrennt und das Zellenmaterial wiederholt mit o, i n-Essigsäure extrahiert. Der
mit der Kulturflüssigkeit vereinigte saure Extrakt wird mit Ammoniak alkalisch gestellt
und unter Verwendung eines Ejektors zweimal mit Äther extrahiert. Die ätherische
Lösung
wird zwecks vollständiger Entfernung des Äthers eingedampft.
Auf diese Weise wird ein Rückstand erhalten, der Ergocryptinin, Agroclavin und Elyinoclavin
enthält.