Verfahren zur Herstellung eines Mutterkornalkaloids Die vorliegende Erfindung bezieht sieh auf ein Verfahren zur Herstellung eines Mutterkornalkaloids, nämlich von Ergokryp- tinin. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeich net, dass man einen auf Elymus mollis Trin. parasitisch wachsenden Mutterkornpilz oder einen Alutanten davon saprophytisch züchtet, wobei ein Ergokryptinin,
Agroclavin und Elymoclavin enthaltendes Alkaloidgemisch erzeugt wird, und dass man aus der Kultur das Ergokryptinin abtrennt.
Im Jahre 1943 haben A. .Stoll und A. Hof mann gezeigt, dass das von G. Barger und F. 11 Carr [J. Chem. Soc., 91, 377 (1907) ] iind F.
Kraft [Arch. Pharm., 244, 336 (1906)] usw. beschriebene Ergotoxin nichts anderes als ein Gemisch der drei Alkaloide Ergo- eristin, Ergokryptin und Ergocornin ist, und dass das von C. Tanret [C.
R. Acad. Sei., 81, 896 (1875) ] beschriebene Ergotinin ebenfalls ein Gemisch ist, nämlich von Ergoeristinin, Ergokryptinin und Ergocorinin, die Isomere der obigen .drei Alkaloide sind.
Gegenwärtig sind somit zehn soggenannte peptidische Mutterkornalkaloide bekannt, nämlich: Ergotamin, Ergosin, Ergocristin, Ergokryptin, Ergocornin, Ergotaminin, Ergo- sinin, Ergocristinin, Ergokryptinin und Ergo- corninin, von denen die letzten fünf Alka,
loide Isomere der entsprechenden ersten fünf A lkaloide sind.
Alle diese Alkaloide werden als solche oder in Form ihrer Derivate für klinische Zwecke in grossem Umfang verwendet. Die Versor gungslage auf dem Gebiet der Alkaloide ist jedoch in allen Ländern sehr ungünstig, da einerseits zum Züchten des Mutterkorns grosse Landflächen und zahlreiche Arbeitskräfte er forderlich sind und anderseits das Wachstum des Mutterkorns durch die klimatischen Be dingungen sehr stark beeinflusst wird. Wenn:
es nun möglich wäre, Mutterkornpilze künst lich zu züchten und aus der Kultur pepti- dische Alkaloide zu gewinnen, so könnte das natürliche Mutterkorn durch gezüchtetes Mut terkorn ersetzt werden, wodurch eine günstige Flussicht auf die Massenproduktion der Alka loide eröffnet würde, nicht zusprechen von der sich daraus ergebenden Erleichterung der wissenschaftlichen Kontrolle der Mutterkorn alkaloidproduktion.
Im Hinblick auf dieses Ziel haben viele Forscher die künstliche Züchtung von Mutter kornpilzen erforscht, bisher allerdings mit negativem Resultat. Tatsächlich konnte bis jetzt einzig das Agroclavin, ein nieht-pepti- disches Mutterkornalkaloid, das ebenfalls von den Urhebern der vorliegenden Erfindung entdeckt wurde [Annual Reports of Takeda Research Laboratory,. 10, 145,.
162, 171 (1951) ], durch künstliche Züchtung von Mut terkornpilzen in grösserer Menge dargestellt werden.
Aus einer Reihe von Mitteilungen, z. B. von A. McCrea [Amen. Jour. Bot., 18, 50 (1931) ], H. Kreitmair und W. Küssner [Bio- chem. Zeitschrift, 239, 189 (1931)], R. Ja- retzky [Archiv d. Pharmazie, 273, 348 (1935) ],. E. Baldaeei [Fa.rma,co. Sei. e. Tee. L., 1, 187 (1941) ], S.
K. Sim und I3. W. Young- ken, Fr. [tour. Amer. Pha,rmac. Ass. Sei. Ed., 40, 344 (1951) ] usw., geht eindeutig hervor, dass bis jetzt keine peptidischen Mutterkorn alkaloide in grösserer Menge durch künstliche Züchtungsverfahren hergestellt worden sind.
Die Erfinder, die schon seit vielen Jahren an der Lösung des Problems der künstlichen Züchtung von Mutterkornpilzen arbeiten, haben gefunden, da13 im allgemeinen Elymo- clavin, ein neues Mutterkornalkaloid,
im AZutterkorn und in Kulturen von Mutterkorn pilzen vorkommt und dass einige Arten von Mutterkornpilzen bei der künstlichen Züch tung verhältnismässig grosse Mengen Elymo- chavin und Agroclavin und gleichzeitig ausser ordentlich grosse Mengen Ergokryptinin er zeugen.
Sie haben ausserdem festgestellt, dass die Kultur .der obigen Mutterkornpilze nur wenig Alkaloidarten und keine schwer abzu trennenden Verunreinigungen enthält, so dass die Anreicherung von Ergokryptinin sehr leicht ist.
Die mittels des erfindungsgemässen Ver fahrens erzielbaren Ausbeuten an Ergokryp- tinin sind abnorm hoch. So kann z. B. die Ausbeute aus 100 g Trockensubstanz, die durch Trocknen des unter Verwendung eines flüssigen Kulturmediums erzeugten Kultur materials erhalten werden, etwa 1-2 g be tragen. Die; in Betracht fallenden. Mutterkorn pilze wachsen auf El@rmus mollis Trin und auch auf verwandten Pflanzen parasitisch.
Ferner kann man auch Mutanten dieser Pilze verwenden.
Unter gewissen Bedingungen verlieren die Pilze ihre Eigenart der parasitischen Gebun- denheit an. die ursprüngliche Wirtpflanze und damit einhergehend die Eigenschaft, Alka loide, insbesondere Ergokryptinin, zu erzeii- gen. Anderseits gibt es einige Abarten, die die Eigenschaft, Ergokryptinin in grossen Mengen zu produzieren, beibehalten, obwohl sie nicht mehr parasitisch an die ursprüng liche. Wirtpflanze gebunden sind.
Es ist oft schwer, diese Pilze m.orphol.o- gisch von andern Pilzen zu unterscheiden. MQrphologische Eigenschaften der Pilze: Die Sklerotien sind zylindrisch bis spindel- förmig, weisen wenig oder keine Furchen auf und messen 3-20 mm in der Länge und 1-7 mm in der Breite. Die Perithezien sind eiförmig bis birnenförmig und messen 130 bis 250 A.t in der Höhe und 30-160,u in der Breite.
Die Asci sind geradlinig und mehr oder weniger zylindrisch; sie weisen eine Länge von 70-165,u und eine Breite von 2 bis 4,5,u auf. Die Ascosporen sind faden- förmig und weisen eine Länge von 40-140 ,u und eine Breite von 0,3-1,2"u . auf. Die jün geren Mycelien sind dicker, das heisst 2-7,u im. Durchmesser.
Die Conidiosporen sind ei förmig bis ellipsoidförmig und weisen eine Länge von 3-18,u und eine Dicke von 2-8 y auf. Die Conidiosporenproduktion der ver schiedenen Stämme ist unterschiedlich; die einen erzeugen reichlich Conidiosporen, wäh rend andere wenig Conidiosporen produzieren.
Die Pilze erzeugen .ausser Ergokryptinin auch die Alkaloide AgToclavin, Elymoclavin, Ergokryptin, Ergosinin, Ergometrin und even tuell Spuren anderer Alkaloide. Bei festen Kulturen beträgt das Verhältnis der Ausbeuten von Ergokryptinin, Agroclavin und Elymocla- vin gewöhnlich @etwa,100 : 3<B>5:</B> 10.
Das Verhältnis der Ausbeuten ist auch. in flüssigen Kulturen im grossen und ganzen immer dasselbe. Wer den die Alkaloidausbeuten flüssiger Kulturen im Zellenmaterial und im flüssigen Teil ge sondert bestimmt, so zeigt sich, da-ss .das Ver hältnis der Ausbeuten in jedem der beiden Teile der Kultur je nach den Kulturbedin gungen, insbesondere je nach der Menge und Art des Stickstoff liefernden Materials, und der Zeit schwankt. Ergokryptin, Ergosinin, Ergometrin usw. werden im allgemeinen in beiden Arten von Kulturen in sehr kleinen Mengen produziert.
Die Züchtung kann sowohl auf festen Kulturen als auch auf flüssigen Kulturen er folgen. Die letztere Methode ist jedoch der ersteren, die im allgemeinen unter Verwen- dung von mit Nährflüssigkeit getränkten Zuckerrohrrückständen (Bagasse) oder an lern porösen Substanzen durchgeführt wird, hinsichtlich der Ausbeute an Ergokryptinin überlegen. Das unter Verwendung flüssiger Kulturen durchgeführte Verfahren ist auch insofern sehr günstig, als es im grossen Mass stab durchgeführt werden kann.
Bei flüssigen Kulturen ist es zweckmässig, die das Ergokryptinin enthaltende Kultur flüssigkeit sukzessive nach dem sogenannten Pilzdecken-Kulturverfahren, bei welchem die unter der Pilzdecke befindliche Nährflüssig keit von Zeit zu Zeit durch eine andere Flüssigkeit ersetzt wird, herzustellen.
Das nährstoffliefernde Material des Me- diums wird je nach den Kulturbedingungen und dem physiologischen Zustand des Pilzes gewählt. So ist :es z. B. in gewissen Fällen zweckmässig, die Zahl der N ährstoffarten auf ein bestimmtes Mass zu beschränken, während in andern Fällen der Bereich der verwend baren Nährstoffarten ziemlich breit ist.
Für das erste Kulturmedium im Pilz decken-Kulturverfahren eignen sich als Koh lenstoff liefernde Materialien schwer assimi- lierbare Substanzen, wie z. B. Mannst, wäh rend als Stickstoff lieferndes Material leicht assimilierbare Substanzen, wie z.
B. Aspara- ginsäure, Glutaminsäure, Asparagin, Glut amin oder die Ammoniumsalze der Asparagin- säure, Bernsteinsäure, Fumar- säure, Maleinsäure, Apfelsäure und Wein säure geeignet sind.
Im zweiten oder in den nachfolgenden Kulturmedien russ jedoch die Zusammensetzung des Nährmaterials nicht notwendigerweise gleich wie im ersten Medium sein. Die Zusammensetzung des Nährmate rials kann weitgehend variiert werden Das Kulturmedium weist zweckmässig ein pti von 3,2-8,4 auf. Am günstigsten ist ein pFI von 6,6-6,8.
Bei :einem p$ von weniger als 3,2 oder von mehr als 8;4 ist die Vermeh- rung :der Pilze erschwert. Die für die Ver mehrung; der Pilze günstige Kulturtempera- tur liegt zwischen 10 und 34 C,
wobei. die optimale Temperatur in .der Nähe von 280 C liegt. Die für die Vermehrung des Pilzes gün stigen Bedingungen stimmen jedoch mit den für -die Bildung von Mutterkornalkaloiden günstigen Bedingungen nicht überein. Durch Hemmung der Vermehrung des Pilzes in einem gewissen Ausmass.
wird eine Verbesse- rung der Alkaloidausbeute bewirkt. Für die sen Zweck eignen sieh vorzugsweise die fol genden Behandlungen:
(A) Man erhöht in abnormer Weise die Menge eines oder mehre- rer der Kohlenstoff und Stickstoff liefern den Materialien und anorganischen Salze im Medium oder versetzt das Medium vor dem Impfen mit dem Pilz oder während der In kubation mit Substanzen, die die Vermehrung des Pilzes hemmen. (B) Die Kulturtempera: tur wird etwas Luster der für die Vermehrung des Pilzes optimalen Temperatur gehalten.
(C.") Man verwendet ein Medium mit einem PH, das etwas grösser oder kleiner ist als das für die Vermehrung des- Pilzes optimale PR. (D) Die Menge des Impfmaterials, die Tiefe des Kulturmediums, die Variierung der Zu- sammensetzung, des Nährmaterials, die Regu lierung der Luftzufuhr oder der Bestrahlung mit sichtbarem und unsichtbarem Licht usw. üben den gleichen Einfluss aus.
Es sind sehr viele Substanzen bekannt, die die Vermehrung von derartigen Pilzen hemmen. Als Beispiele solcher Substanzen seien genannt: Salze von Schwermetallen, wie z. B. Mangan, Kupfer und Zink, Salze der Fluorwasserstoffsäure, Satzsäure, Blau säure und Arsensäure, substituierte oder un- substituierte aromatische Säuren und Fett säuren, wie z. B.
Ameisensäure, Monohalogen essigsäuren, Benzoesäure, Aminobenzoesäure, Phenylessigsäure, Naphthylessigsäure, Sub stanzen mit alkoholischen oder phenolisehen Hydroxylgmupp.en, aromatische basische Ver bindungen, wie z. B. Anilin, Diphenylamin, Indol, Chinolin und deren Derivate, aroma tische Kohlenwasserstoffe. und, synthetische oder aus Bakterien erhältliche Antibiotika und andere mehr.
Diese Substanzen sind im allgemeinen in kleiner Menge wirksam. So genügen beispielsweise Mengen von weniger als 0,01% einer dieser Substanzen im Medium zur Erzielung der angestrebten Hemmutig. Substanzen, die die Vermehrung :des Pilzes nur schwach hemmen, wie z.
B. Natriumehlo- rid, sind natürlich in grösseren. Mengen zu verwenden.
Im Gegensatz zu den Mutterkornkulturen, die bis jetzt zur Herstellung von peptidischen Mutterkornalkalolden verwendet wurden, ent halten die mit den in Betracht stehenden Pilzen erzeugten Kulturen eine ausserordent lich grosse Menge Ergokryptinin, dagegen weder Ergocristinin noch Ergocorninin, deren Vorhandensein die Abtrennung des Ergo kryptinins erschweren, würde.
Das Gesamtgemisch :der erhaltenen Alka, loide kann in bekannter Weise von Verun reinigungen abgetrennt werden, bevor das Ergokryptinin aiis dem Gesamtgemisch abge trennt wird.
Die Löslichkeit von Ergokryptinin, Agro- clavin und Elymoclavin in Wasser steigt in der Reihenfolge ihrer Aufzählung. Die Ver teilungskoeffizienten dieser drei Alkaloide zwischen wässrigen und organischen Lösungs mitteln sind deutlich voneinander verschie den. Diese Alkaloide können deshalb auf Grund der Unterschiede ihrer Löslichkeit in Wasser oder organischen Lösungsmitteln oder auf Grund ihres Verhaltens bei der Ab trennung aus ihren Lösungen voneinander getrennt werden.
Der Unterschied ihrer Ver teilungskoeffizienten zwischen zwei miteinan der nicht mischbbaren Lösungsmitteln kann für diesen Zweck ebenfalls ausgewertet. wer den. Ausserdem kann man für den gleichen Zweck auch die Methoden der Dialyse, der Elektrodialyse, der Elektrophorese, der Ad- sorption mittels Kationsaustausehharzen USW- anwenden, allerdings mit weniger Erfolg.
Um. die Alkaloide vom festen Material, z. B. von dem aus festen Kulturen erhaltenen Kulturmaterial oder von dem aus flüssigen Kulturen erhaltenen Zellenmaterial, abzutren nen, wird zweckmässig wie folgt vorgegangen: Das Material wird im Rohzustand oder nach Trocknen und Pulvern, mit einem organi schen Lösungsmittel, wie z.
B. Äther, Benzcl, Methanol, Äthanol, Aceton, Chloroform oder Äthylessigester, unter sauren, neutralen oder alkalischen Bedingungen extrahiert, wenn nötig nach vorgängiger Entfernung von Fetten mittels Ligroin oder Benzin.
Der mit tels eines mit Wasser nicht mischbaren orga nischen Lösungsmittels erhaltene Extrakt wird mit auf ein pH von weniger als 4 an,-e- säuertem Wasser ausgeschüttelt. Falls der Extrakt mittels eines mit Wasser misehbaren organischen Lösungsmittels erhalten worden ist, wird der Extrakt zuerst getrocknet und dann wie oben behandet. Wird die saure Lö sung mit Ammoniak, Natriumbiearbonat oder dergleichen alkalisch gestellt,
so scheiden iicli das Ergokryptinin und der grösste Teil des Agroclavins ab, während das Elymoclavin nahezu vollständig in der Lösung, zurück bleibt, aus welcher das Elymoclavin durch Extraktion mit einem organischen Lösungs mittel, wie z. B. Äther oder Chloroform, und anschliessendes Einengen des Extraktes abge trennt werden kann.
Wird der obige Niederschlag, in einem ge eigneten organischen Lösungsmittel, wie z. B. Chloroform oder Äthylessigester, gelöst und die Lösung mit angesäuertem Wasseraus geschüttelt, so wird nur das Agroclavin in das angesäuerte Wasser aufgenommen. Die Ergokryptininfraktion wird somit .aus der organischen Lösung erhalten, während die Agroclavinfraktion ausfällt, wenn das ange säuerte Wasser alkalisch gestellt wird.
Die Agroclavinfraktion wird auch erhalten, wenn die obige saure Lösung alkalisch gestellt und mit einem organischen Lösungsmittel ausge schüttelt wird, um das Alkaloid darin zu lösen, und die organische Lösung einer Ge genstromextraktion oder der Verteilungs- chromatographie unterworfen wird. In diesem Fall wird auch eine kleine Menge Elymo- clai in gewonnen. Wird die oben genannte saure wUrige Lösung des Gesamtgemisches der Alkaloide mit einem organischen Lösungsmittel, wie z. B.
Chloroform oder Äthylessigester, ausge schüttelt, so tritt das Ergokryptinin in das organische Lösungsmittel über, während Agro- elavin und Elymoelavin in der sauren Lösung zurückbleiben.
Somit erhält man aus der or ganischen Lösung durch Einengen die Ergo kryptininfraktion, während die Agroclavi.n- fraktion aus der sauren Lösung ausfällt, wenn diese alkalisch gestellt wird, und die Elynio- clavinfraktion aus der Mutterlauge des Agro- elavins gewonnen werden kann.
Das aus festen Kulturen erhaltene Kultur material und das aus Flüssigen Kulturen er haltene Zellenmaterial kann auch, allenfalls nahe Entfernung des Fettes, direkt finit Wasser extrahiert werden, -vorauf der Ex trakt als solcher oder nach erfolgter Ein- engting zweckmässig alkalisch gestellt wird.
Die alkalische Lösung kann dann entweder mit einem mit Wässer nicht mischbaren or_ra- nischen Lösungsmittel extrahiert oder mit einem Adsorptionsmittel, wie z. B. saurein japanischem Ton, behandelt werden, worauf mit einem organischen Lösungsmittel eluiert werden kann. Aus der organischen Losung können die einzelnen Fraktionen von Ergo kryptinin, Agroclavin und Elymoelavin nach den oben erwähnten Methoden abgetrennt werden.
Gemäss einer andern Arbeitsweise extra hiert man das aus einer festen Kultur erhal tene Kulturmaterial und das aus einer fliissi- gen Kultur erhaltene Zellenmaterial mit an gesäuertem Wasser und schüttelt den Extrakt mit einem organischen Lösungsmittel, wie z.
B. Chloroform, Äthylessigester und der gleichen, aus, wobei der grösste Teil des 'Crgo- kryptinins in das organische Lösungsmittel übertritt, während der grösste Teil des Agro- clavins und das Elymoclavin in der sauren wässrigen Lösung verbleiben.
Wird festes Kulturmaterial während meh rerer Stunden vorsichtig mit Wasser oder einem wässrigen Lösungsmittel extrahiert, so wird ein Teil .der Alkaloide ausgezogen, näm- lich vorwiegend Agroclavin und Flymoclavin; aus dem Extrakt können die Alkaloide bei spielsweise . auf Grund ihrer verschiedenen Löslichkeiten in Wasser abgetrennt werden.
Der flüssige Teil des aus flüssigen Kul turen erhaltenen Kulturmaterials kann wie folgt aufgearbeitet werden: Die Flüssigkeit als solche oder ein durch Einengung erhaltenes Konzentrat wird auf ein pg von weniger als 4 eingestellt und nach dem Filtrieren mit einem organischen Lö sungsmittel, wie z. B.
Chloroform oder Äthyl essigester; ausgeschüttelt, wobei das Ergo- kryptinin in das organische Lösungsmittel übertritt, während Agroclavin und. Elyrno- clavin in der sauren Flüssigkeit z-LLriickblei- ben. Wird diese Flüssigkeit unter nahezu neutralen Bedingungen mit einem organi schen Lösungsmittel extrahiert, so treten das Ergokryptinin und das Agroclavin in das organische Lösungsmittel über,
wobei nur das Elymoclavin in der Flüssigkeit zurückbleibt.
Man kann auch die saure Flüssigkeit, wenn nötig nach Einengung, alkalisch stellen und dann mit einem mit Wasser nicht misch baren organischen Lösungsmittel extrahieren, oder mit einem Adsorptionsmittel, wie z. B: saurem japanischem Ton, behandeln und dann das Adsorptionsmittel mit einem organischen Lösungsmittel der Bluierung unterwerfen. Aus diesen Lösungen können die Fraktionen von Ergokryptinin, Agxoclavin und Elymo- clavin nach den für das feste Material ange wendeten Methoden abgetrennt.
Von den auf dem Unterschied der Vertei lungskoeffizienten der zwischen zwei Lösungs mitteln verteilten Substanzen beruhenden Trennungsmethoden sind die Gegenstrom extraktion und die Verteilungschromatogra- phie für die Durchführung des erfindungs gemässen Verfahrens besonders wichtig. Gross technisch wird :die Verteilungschromatogra- phie am besten in Kolonnendurchgeführt.
Die Gegenstromextraktion wird gewöhn lich unter Verwendung von angesäuertem Wasser und eines mit Wasser nicht misch baren Lösungsmittels durchgeführt. Eine Lö sung einer anorganischen oder organischen Säure oder einer ändern, sauren Substanz in Wasser wird als angesäuertes Wasser verwen det. Eine Pufferlösung kann für diesen <I>Zweck</I> ebenfalls verwendet werden. Als orga nisches Lösungsmittel, das mit Wasser nicht mischbar ist, kann z. B. Äther, Chlorororm, Butanol, Äthylessigester usw., verwendet wer den.
Die einzelnen Alkaloidfraktionen können auf Grund ihrer Farbreaktion abgetrennt werden.
Für die Verteilimgschromatographie in Kolonnen kommen als Adsorbantien z. B. Fil terpapier oder andere Fasermaterialien, A1n- miniumoxyd, Calciumcarbonat, Silicagel, Stärke in Betracht. Die Alkaloide können in Wasser oder wäl3rige Lösungen anorganischer oder organischer Säuren auf die Kolonne ge geben werden, während organische Lösungs mittel, wie z.
B. Äther, Chloroform, Butanol, Am3lalkohol, Äthylessigester, mit Wasser oder einer der oben genannten sauren Lösun gen gesättigt, als Entwicklungslösungsmittel verwendet werden können. Das Entwick- lungsmittel kann frei ablaufen gelassen oder durch Absaugen nach unten geleitet --erden.
Wird der Gesamtalkaloidextrakt durch Verteilungschromatographie in einer Kolonne zerlegt, so bilden sich in der Kolonne drei dem Ergokryptinin, Agroclavin und Elymo- elaviii entsprechende Bänder. Diese Bänder werden getrennt herausgenommen und mit einem organischen Lösungsmittel oder ange säuertem Wasser extrahiert. Die Alkaloide können aber auch gesondert aus den Bändern herausgewaschen werden.
Die Unterscheidung der Bänder wird besser auf Grund von Fluoreszenzerscheinun- gen als von Farbreaktionen vorgenommen.
Die nach den oben beschriebenen Metho den erhaltenen Fraktionen von Ergokrypti- nin, Agroclavin und Elymoclavin enthalten noch Verunreinigungen und müssen deshalb einer weiteren ReinigLmg unterworfen wer den, um in vollständig reinem Zustand er halten zu werden.
So löst man beispielsweise die Ergokrypti- ninfraktion .in einem organischen Lösungs mittel, wie z. B. Benzol, Äthylessigester oder Chloroform, und schüttelt die Lösung mit alkalisch gestelltem Wasser, z. B. mit Na trium- oder Kaliumhydroxydlösung, aus, wo bei das Ergokryptinin im organischen Lö sungsmittel zurückbleibt, während Verunrei nigungen, wie Ergosinin, Ergokryptin und andere, in das alkalisch gestellte Wasser über treten.
Wird die organische Lösung zur Trockne eingedampft und,der Rückstand mit einem organischen Lösungsmittel, wie z. B. Methanol, behandelt, so erhält man das Ergo- kryptinin in kristalliner Form.
Man kann auch die Ergokryptininfraktion in einem mit Wasser nicht mischbaren orga nischen Lösungsmittel lösen und die Lösung mit angesäuertem Wasser ausschütteln, wobei sich das Alkaloid im letzteren löst. Die saure Lösung wird alkalisch gestellt, worauf der abgeschiedene Niederschlag, nach dem Trock nen, in einem organischen Lösungsmittel, wie z. B. Methanol, Äthanol oder Äthylessigester, gelöst und die Lösung eingeengt wird, wo durch das Ergokryptinin in kristalliner Form erhalten wird.
Beispiel <I>1</I> Mau beschickt einen Kolben mit flachem Boden von 3 Liter Inhalt mit 1,2 Liter eines aus Mannit (5%), Ammoniumglutamat (1%-), Magnesiiimsiilfat (0,03%) und Leitungs- wasser bestehenden Kulturmediums, dessen pH mit Salzsäure auf 5,2 eingestellt ist.
Das Kulturmedium wird mit einem parasitisch auf Elymus mollis Trin. wachsenden Stamm von. 1VTutterkornpilzen geimpft, worauf .die Pilze in Oberflächenkultur bei 26 C gezüch tet werden. Nach 40 Tagen wird die Kultur flüssigkeit .ausgegossen und mit Schwefel säure angesäuert. Das zurückbleibende Zellen material wird wiederholt mit verdünnter Schwefelsäure extrahiert.
Die vereinigten sauren Flüssigkeiten wer den zwecks Adsorption der darin enthaltenen Alkaloide mit japanischem saurem Ton aus geschüttelt. Das Adsorptionsmittel wird mit Ammoniak bef euchtet,und wiederholt mit Äther extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden eingeengt, worauf das Konzentrat mit mehre ren Portionen von 1/1o seinesVolumens an 1 bis 3 %iger Lösung von Bernsteinsäure in Wasser ausgeschüttelt wird.
Die saure Lösung wird mit Ammoniak auf ein px von etwa 8 alka: lisch gestellt, worauf der abgeschiedene Nie derschlag .durch Filtrieren von der Mutter lauge (A) abgetrennt wird. Man löst den Nie derschlag in einer ziemlich grossen Menge Chloroform und schüttelt die Lösung i:iit 3 Portionen von 1/3 ihres Voliunens 0,1-n Schwefelsäure aus, um in der sauren Lösung lösliche Substanzen zu entfernen.
Man stellt die saure Lösung (B) zur Seite und dampft die Chloroformlösung nach erfolgter Trock nung mit Caleiumchlorid zur Trockne ein.
Der Rückstand wird ammoniakalkalisch in Benzol gelöst. Nach Ausschütteln mit 1%iger Natriiunhydroxydlösung zwecks Entfernung von in der .alkalischen Lösung gelösten Sub stanzen [die alkalische Lösung (C) wird zur Seite gestellt] wird die Benzollösung zur Trockne eingedampft, worauf der Rückstand tropfenweise mit Methanol versetzt wird, wo bei sich Kristalle abscheiden.
Die Kristalle werden in heissem Methanol gelöst, worauf die Lösung nach Abfiltrieren unlöslichen Ma, terials eingeengt wird. Das Ergokryptinin scheidet sich dann beim Stehen in kristalliner Form ab. Die Ausbeute beträgt etwa 260 mg. Die Mutterlauge (A) wird wiederholt mit Äther ausgeschüttelt. Die ätherische Lösung wird eingeengt und mehrmals mit einer klei nen Menge 0,1-n Schwefelsäure ausgeschüt telt. Man stellt ,die vereinigten sauren Lösun gen mit Natriumbicarbonat .alkalisch -und fil triert den abgeschiedenen Niederschlag (D) ab.
Man schüttelt,die Mutterlauge wiederholt mit Benzol aus und engt ,die Benzollösung auf 20 ems ein. -Man lässt die eingeengte Lösung während einiger Zeit an einem kühlen Ort stehen und filtriert den abgeschiedenen Nie derschlag ab. Die Mutterlauge wird bei Raum temperatur stehengelassen, wobei sich Elymo- clavin in kristalliner Form abscheidet.
Man löst das auf diese Weise erhaltene Elymocla- vin in etwas heissem Aceton und engt die Lö sung nach Abfiltrieren unlöslichen Materials ein. Die abgeschiedenen Kristalle werden durch Waschen mit wenig kaltem Aceton und Umkriställisieren aus Ithylessigester weiter gereinigt. Die Ausbeute beträgt etwa 6 mg.
Man stellt die saure Lösung (B) finit Ammoniak alkalisch und trennt den abge schiedenen Niederschlag von der Mutterlauge (E) ab. Der Niederschlag wird in Aceton ge löst, worauf die Lösung nach erfolgtem Fil trieren eingeengt und dann mit -destilliertem Wasser versetzt wird, bis die Lösung trübe wird. Die Lösung wird dann bei Raumtempe- ratLtr stehengelassen, wobei sich Agroclavin in kristalliner Form abscheidet.
Man löst die Kristalle in heissem Äthylessigester und engt die Lösung nach Abfiltrieren unlöslichen Ma terials ein, wobei reines Agroclavin in kri stalliner Form erhalten wird. Die Ausbeute beträgt etwa 90 mg.
Aus dem Niederschlag (D), der Mutter lauge (E) und der alkalischen Lösung (C) lassen sich in kleinen Mengen Agroclavin,. Elymoclavin bzw. Ergosinin, Ergokryptin und Ergokryptinin gewinnen.
<I>Beispiel 2</I> Man beschickt einen .Kolben mit flachem Boden von 3 Liter Inhalt mit 1,3 Liter eines aus Mannit (50/0), Ammoniumglutamat (0,8%), Kaliumbiphosphat (0,1,1/o.), Magne- siumsulfat (0,03%) und Leitungswasser be- stehenden Kulturmediums, .das finit Salzsäure auf ein pH von 5,
2 eingestellt ist. Das Kulturmedium wird ungefähr in der im Bei spiel 1 beschriebenen Weise mit Mutterkorn pilzen geimpft, kultiviert und aufgearbeitet.
Die durch Extraktion des Adsorptionsmittels erhaltene ätherische Lösung der Gesamtalka loide wird auf ein Liter eingeengt und wie derholt mit Portionen von 50 em3 einer 1- bis 3 %igen Lösung von Zitronensäure in Wasser ausgeschüttelt. Die saure Lösung wird alka lisch gestellt und erneut mit Äther ausge schüttelt, worauf die ätherische Lösung ein gedampft wird, um .den Äther vollständig zu vertreiben.
Der Rückstand wird in heissem ammonakalkalischem Aceton gelöst, worauf die Lösung auf 1/3 ihres Volumens eingeengt und, nachdem sie während einiger Zeit an einem kühlen Ort stehengelassen worden ist, filtriert wird. Das Filtrat wird mit einer grossen Menge Wasser versetzt und der abge schiedene Niederschlag (A) erbfiltriert.
Das Filtrat wird wiederholt mit reinem Äther ausgeschüttelt. Die vereinigten ätherischen Lösungen werden unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft; -worauf der harz artige Rückstand in siedendem Benzol gelöst und die Lösung filtriert und eingeengt wird. Die konzentrierte Lösung wird rasch abge kühlt und ,der abgeschiedene Niederschlag erb- filtriert. Das Filtrat wird bei Raumtempera tur stehengelassen, wodurch die Abscheidtrag von Elymoclavin bewirkt wird.
Aus der Mut terlauge wird eine kleine Menge Agroclavin gewonnen.
Der Niederschlag (A) wird in heissem ammoniakalkalischem Alkohol gelöst. Die Lö sung wird filtriert und mit einer grossen Menge destillierten Wassers versetzt, worauf der abgeschiedene Niederschlag (B) erbfil triert wird. Das Filtrat wird wiederholt mit reinem Äther ausgeschüttelt.
Man dampft die vere<U>inig</U>ten ätherischen Lösungen zur Trockne -unter vermindertem Druck ein und löst den harzartigen Rückstand in siedendem Benzol. Die Benzollösung wird nach erfolgtem Fil trieren eingeengt und 'stehengelassen, wobei sich Elymoclavin abscheidet. Aus der Mutter lauge wird eine kleine Menge Agroelavin ge wonnen.
Die vereinigten Elymoclavinfraktio- nen werden mit einer kleinen Menge kalten Acetons gewaschen und zwecks Erzieluug eines reinen Produktes aus Alkohol umkristal lisiert. Die Ausbeute beträgt 6 mg.
Man löst den Niederschlag (B) in Äthyl- essigester und :dampft die Lösung, nachdem diese wiederholt mit verdünnter Essigsäure ausgeschüttelt worden ist, unter verminder tem Druck zur Trockne ein [die verdünnte essigsaure Lösung (C) wird zur Seite ge stellt].
Man löst den Rückstand in ammoniak- alkalischem Benzol und dampft die Lösung, nachdem .diese wiederholt mit wenig Kalium hydroxydlösung ausgeschüttelt worden ist, zur Trockne ein [die alkalische Lösung (D) wird zur Seite gestellt]. Der aus Ergokrypti- nin bestehende Rückstand wird wie im. Bei- spiel 1 mit Methanol behandelt und durch Umkristallisation gereinigt. Die Ausbeute be trägt 180 mg.
Man stellt die saure Lösung (C) mit Am moniak alkalisch und löst den abgeschiedenen Niederschlag in der halben Gewichtsmenge an konzentrierter Bernsteinsäurelösung auf.: Agroclavin scheidet sich als Succinat aus der Lösung ab. Aus der Lösung des Succinats wird Agro.clavin durch Alkalisierung mit Ammoniak gefällt. Man löst den Niederschlag in wenig Methanol und versetzt die Lösung , mit destilliertem Wasser, um Kristalle von Argoelavin auszufällen.
Die Ausbeute beträgt etwa 45 mg.
Eine kleine Menge Ergokryptin und Ergo- kryptinin kann aus der alkalischen Lösung , (D) gewonnen werden. <I>Beispiel 3</I> Man beschickt einen Kolben mit flachem Boden von 3 Litern Inhalt mit 1,2 Liter eines aus Mannit (5%), Asparagin (1,50/a), Ka- humbiphosphat (0,8%), Magnesiumsulfat (0,05%)
und Leitungswasser bestehenden Kulturmediums, das mit Schwefelsäure auf ein pjj von 5,4 eingestellt ist. Das Kultur lnedium wird mit einem auf Elymus mollis Trin. parasitisch wachsenden Stamm von <B>1</B> MU tterkornpilzen geimpft, worauf die Pilze in Oberflächenkultur bei 26-28 C gezüchtet werden.
Nach 36 Tagen trennt man die Kul turflüssigkeit vom Zellenmaterial ab und wäscht das Zellenmaterial mit 0,1-n Schwefel säure, bis die Waschflüssigkeit nicht mehr alkalisch reagiert. Die Kulturflüssigkeit wird mit der Waschflüssigkeit vereinigt, mit Am moniak alkalisch gestellt und unter Verwen- dung :eines Ejektors zweimal mit Äther extrahiert.
Der ätherische Extrakt wird ein geengt und wiederholt mit etwa '-/1o seines Volumens an verdünnter Essigsäure ausge schüttelt. Die saure Lösung wird mit 2 Por tionen von etwa der Hälfte ihres Volumens an Chloroform ausgeschüttelt, wobeiiu das Ergoa- kryptinin in das Chloroform übertritt, wäh rend Agroclavin und Elymoelavin in der sauren Lösung (A) verbleiben.
Die Chloro- formlösung wird, nachdem sie mit Calcium- chlorid getrocknet worden ist, zur Trockne eingedampft, worauf der Rückstand unter ammoniakallialischen Bedingungen mit Äther behandelt wird. Die ätherische Lösung wird wiederholt mit einer kleinen Menge 0,1-n Essigsäure ausgeschüttelt, worauf die saure Lösung mit Ammoniak auf ein pH von 8,0 eingestellt und der abgeschiedene Nieder schlag abfiltriert wird.
Nach dem Trocknen wird der Niederschlag in einer ziemlich grossen Menge heissen Methanols gelöst. Die Lö sung wird: filtriert, eingeengt und bei Raum- temperatur stehengelassen, wodurch die Ab scheidung von rohem Ergokryptinin bewirkt wird, welches durch Umkristallisation aus Äthylessigester gereinigt wird. Die Ausbeute beträgt etwa 240 mg. Eine kleine Menge Ergokryptin, Ergokryptinin und Ergosinin wird aus der Mutterlauge gewonnen.
Die saure Lösung (A) wird mit Ammo niak alkalisch gestellt und nach Abfiltrieren des abgeschiedenen Niederschlages (B) wie derholt mit Benzol ausgeschüttelt. Die Benzol lösung wird eingeengt und heiss filtriert. Wird das Filtrat bei Raumtemperatur stehen gelassen, so scheiden sich Kristalle von Elymoclavin ab, die am Boden des Gefässes festhaften, während Verunreinigungen in Form eines leichten Niederschlages abgeschie den werden. Der erstere Niederschlag wird deshalb vom letzteren durch Abdekantieren der Flüssigkeit getrennt.
Das rohe Elymo- clavin wird mit kaltem Benzol gewaschen und in heissem Chloroform gelöst. Die Lösung wird filtriert, eingeengt und stehengelassen, wobei sich reines Elymoclavin abscheidet. Die Ausbeute beträgt etwa 8,0 mg.
Der Niederschlag (B) wird unter ammo- niakalkalisehen Bedingungen in Äther ge löst, worauf die Lösung, nachdem sie mit Na- triumsulfat getrocknet worden ist, eingeengt wird, um Agroclavin abzuscheiden, welches. ,durch Umkristallisieren aus Äther weiter ge reinigt wird. Die Ausbeute beträgt etwa 80 mg.
<I>Beispiel 4</I> Ein Kolben mit flachem Boden von 3 Li ter Inhalt wird mit 1,2 Liter eines aus Mannit (5%.), Asparaginsäure (0,80/a), Ka- liumbiphosphat (0,10/a), Magnesiumsulfat (0,05 /o) und Leitungswasser bestehenden Kulturmediums, das mit 30 0higem Ammoniak auf p. 5,0 eingestellt ist, beschickt.
Das Kul- turmedium wird mit einem Mutanten, der aus dem auf Elymus mollis Trin. parasitisch wachsenden Mutterkornpilz durch Bestrah lung mit Radium erhalten wurde, geimpft, worauf der Pilz in Oberflächenkultur bei 26 bis 28 C gezüchtet wird.
Nach 32 Tagen wird die Kulturflüssigkeit ausgegossen und die Unterseite des Zellen- materials mit .einer Lösung von in Wasser (pH etwa 5,0) so lange ge waschen, bis die Waschflüssigkeit nicht mehr alkalisch reagiert. Das Zellenmaterial wird nach Beispiel 6 weiter verarbeitet.
Die Kulturflüssigkeit wird mit der Wasch flüssigkeit vereinigt, mit Ammoniak alkalisch gestellt und unter Verwendung eines Ejek_ tors zweimal mit Benzol extrahiert.
Der Extrakt wird eingeengt und wiederholt mit einer kleinen Menge 30/aiger Milchsäurelösung ausgeschüttelt. Man stellt die saure Lösung mit Natriumhicarbonat alkalisch und filtriert den abgeschiedenen Niederschlag ab.
[die Mutterlauge (A) wird zur Seite gestellt]. Man löst den Niederschlag in n-Butanol bei Raumtemperatur und giesst die Lösung in eine Glaskolonne von etwa 45 ein Höhe und etwa 10 cm Breite, die mit 1,6 kg reiner Kar toffelstärke, die mit 2 Liter destilliertem Wasser angeteigt ist, beschickt ist.
Nachdem die Butanollösung in die Stärkeschicht einge- ,drungen ist, wird von oben durch die Stärke schicht ein Entwicklungslösungsmittel frei durchsickern gelassen, welches durch kräfti ges Schütteln eines Gemisches von 4 Teilen n-Butanol,
1 Teil Essigsäure und 5 Teilen destilliertem Wasser und Abtrennen der untern Schicht hergestellt wird. Nach 18 Stunden wird das Lösungsmittel über der Stärkeschicht verworfen und die Kolonne während einiger Zeit sich selbst überlassen, wobei das Lösungsmittel eine Höhe von etwa 20 ein unterhalb des obern Endes der Stärke schicht erreicht. Wird die Kolonne im ultr a: violetten Licht betrachtet, so sind mehrere fluoreszierende Zonen feststellbar.
Die un terste purpurrötlichblau fluoreszierende Zone zwischen den Grenzen von 10 und 15 cm un terhalb des obern Endes der Stärkeschicht wird herausgeschnitten und wiederholt mit einer möglichst kleinen Menge 10 o/oiger Essigsäure extrahiert.
Der Extrakt wird zwecks Entfernung des Butanols mit Äther ausgeschüttelt und dann mit Ammoniak alka lisch gestellt. Der abgeschiedene Niederschlag; wird abfiltriert. Der Niederschlag wird ge trocknet und in einer grossen Menge heissen Äthylessigesters gelöst.
Die Lösung wird nach Abfiltrieren unlöslichen Materials eingeengt, Zoobei sich rohes Ergokryptinin abscheidet, das durch Umkristallisieren aus Methanol einer weiteren Reinigung -unterzogen wird.
Die Ausbeute beträgt 230 mg pro Liter der Kulturflüssigkeit. Der zwischen 7 und 9 cm unterhalb des obern Endes der Stärkeschicht befindliche Teil, der gelblichgrün und pur purrötlichblau fluoreszierende Zonen auf weist, wird herausgeschnitten -Lind wiederholt mit einer möglichst kleinen Menge 0,1-n Schwefelsäure extrahiert.
Der Extrakt wird in der oben beschriebenen' Weise aufgearbei- tet. Der erhaltene Niederschlag wird unter ammoniakalkalischen Bedingungen in Äther gelöst., worauf die ätherische Lösung nach dem Trocknen eingeengt und wiederholt mit 1-3o/oiger Bernsteinsäurelösumg ausgeschüt- telt wird.
Der Äther wird aus der sauren Lö sung vertrieben, worauf die saure Lösung mit Ammoniak alkalisch gestellt und der sich ab scheidende Niederschlag abfiltriert wird. Wie im Beispiel 1 wird der Niederschlag in Aceton gelöst und die Lösung mit Wasser versetzt, um Agroclavin anuszufällen, das durch Umkristal- lisieren aus Äthylessigester einer weiteren Rei nigung unterzogen wird.
Die Ausbeute be trägt 80 mg pro Liter Kulturflüssigkeit. Die Mutterlauge (A) wird zwecks Gewinnung von Elymoclavin gleich wie die Mutterlauge (A) im Beispiel 1 behandelt. Die Ausbeute be trägt etwa 5 mg pro Liter Kulturflüssigkeit. ; Wie im Beispiel 1 wird auch hier eine kleine Menge Agroclavin gewonnen.
Aus dem zwi schen etwa 5 und 7 cm unterhalb des obern Endes der Stärkeschicht befindlichen Teil wird durch Behandlung in der im Beispiel 5 beschriebenen Weise eine kleine Menge Elymo- clavin gewonnen.
Beispiel <I>5</I> Die Kultivierung erfolgt unter Verwen- dung des gleichen Mediums und des gleichen, Stammes wie im Beispiel 1 in Oberflächen- kultur bei. 26-28 C. Nach 35 Tagen wird die Kulturflüssigkeit vom Zellenmaterial abge trennt. Die Extraktion mit verdünnter Schwe felsäure, die Adsorption mittels japanischem saurem Ton und die Eluierung mit Äther werden in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise ausgeführt.
Die ätherische Lösung wird eingeengt und wiederholt mit 1/l0, ihres Volumens an 0,1-n Schwefelsäure ausgeschüt telt. Der sich abscheidende Niederschlag wird abgetrennt. Man stellt die saure Lösung mit Ammoniah auf ein pH von 4,2 ein und trennt den sich abscheidenden Niederschlag von der Mutterlauge ab. Der mit dem oben genannten Niederschlag vereinigte Niederschlag wird in wenig Aceton gelöst. Man versetzt die Lösung mit einer grossen Menge Wasser und trennt den erhaltenen Niederschlag (A) von der Mutterlauge ab.
Die letztere wird mit der oben genannten Mutterlauge vereinigt, mit Ammoniak alkalisch gestellt und wiederholt mit Äther ausgeschüttelt. Die ätherische Lö sung wird zur vollständigen Vertreibung des Äthers eingedampft, worauf der Rückstand in n-Bütanol gelöst wird. Die Butanollösung wird in eine Glaskolonne von etwa 45 cm Höhe und 10 cm Breite, die mit 1,6 kg reiner Kartoffelstärke, welche mit 2 Litern 5 /oiger Essigsäure angeteigt wurde, be schickt ist, eingegossen.
Nachdem die B.iitanol- lösung in die Stärkeschicht eingedrungen ist, wird das gleiche Lösungsmittel wie im Bei spiel 4 während 16 Stunden durchsickern ge lassen. Nach Ablauf dieser Zeit wird das über der Stärkeschicht befindliche Lösungsmittel abgegossen und die Kolonne so lange sieh selbst überlassen, bis am untern Ende der Ko lonne kein Lösungsmittel. mehr abtropft. Wie im Beispiel 4, sind fünf fluoreszierende Zonen sichtbar.
Der grösste Teil des Elymoclavins ist in der zweiten und der dritten Zone vor handen, welche herausgeschnitten und wieder holt mit einer kleinen Menge 0,1-n Schwefel säure, die etwas n-Butanol enthält, ausge schüttelt werden.
Das Butanol wird aus der sauren Lösung vertrieben, worauf die letztere mit Ammoniak alkalisch gestellt und wieder holt mit Äther ausgeschüttelt wird. ;Han dampft die ätherische Lösung zur Trockne ein und löst den Rückstand in einem grossen Menge siedenden Benzols. Nach Abfiltrieren unlöslichen Materials wird :die Benzollösiuig zur Trockne eingedampft und der kristalline Rückstand. mit Aceton versetzt.
Die acetoni- sche Lösung wird nach Abfiltrieren unlösli chen Materials nahezu zur Trockne einge dampft, wobei sich aus dein harzartigen Rückstand Kristalle abscheiden. Die Kristalle werden durch Waschen mit Aceton isoliert und in heissem Äthylessigester gelöst. Die Lö sung wird eingeengt und stehengelassen, wo bei sich Elymoclav in abscheidet. Die Ausbeute beträgt etwa 10 mg. Die unterste fluoreszie rende Zone wird in der im Beispiel 4 beschrie benen Weise aufgearbeitet.
Man erhält dabei etwa 130 mg Ergokryptinin und etwas Ergo- kryptin in kristalliner Form. Aus dem zwi schen dem obern Ende der untersten Zone und den nächsten gelblichgrün und purpur- rötlichblau fluoreszierenden Zonen befind lichen Teil werden durch Behandlung in der im Beispiel 4 beschriebenen Weise etwa 80 mg Agroclavin gewonnen.
Aus dem Niederschlag (A) werden etwa 100 mg Ergokryptinin und eine kleine Menge Ergokryptin in kristalli- ner Form erhalten. <I>Beispiel 6</I> Das gemäss Beispiel 4 erhaltene, aseptisch gewaschene Zellenmaterial wird. auf die Ober- fläche von 1,2 Liter einer aus Glukose (6%), Ammoniuxnsuccinat (0,8%),
Kaliumhiphos- phat (0,1%), Magnesiumsulfat (0,030/0) und Leitungswasser bestehenden sterilisierten Lö sung zum Schwimmen gebracht. Die sterili sierte Lösung ist mit Bernsteinsäure auf ein p$ von 5,4 eingestellt.
Die Kultur wird einer Temperatur von 24-26 C unterworfen. Nach 22 Tagen wird die Kulturflüssigkeit vom Zellenmaterial abgetrennt und .das Zellen material wiederholt mit 0,1-n Essigsäure extrahiert.
Der mit der Kulturflüssigkeit ver einigte saure Extrakt wird mit Ammoniak alkalisch gestellt und unter Verwendung eines Ejektors zweimal mit Äther extrahiert. Die ätherische Lösung wird zwecks vollständiger Entfernung des Äthers eingedampft. Der Rückstand wird in n-Butanol gelöst.
Die butanolische .Lösung wird in eine Glas kolonne von etwa 40 cm Höhe und etwa 5 cm Breite eingegossen, die mit 360 g reiner Kartoffelstärke, die mit 400 ein-3 5 %iger Essigsäure angeteigt sind, beschickt ist. Nachdem.
die butanolische Lösung durch die Stärkeschicht hindurchgesickert ist, wird das im Beispiel 4 verwendete Lösungs mittel während 16 Stunden vom obern Ende der Stärkeschicht durch die Kolonne sickern gelassen. In der Stärkeschicht bilden sich fünf fluoreszierende Zonen.
Die unterste pur- purrötlichblau fluoreszierende Zone, die zwischen 10 und 14 cm unterhalb des obern Endes der Stärkeschicht liegt, wird ausge schnitten,
und wiederholt mit einer kleinen Menge 10%iger Essigsäure extrahiert. Der saure Extrakt wird zwecks Entfernung des Butanols mit Äther ausgeschüttelt und mit Ammoniak alkalisch gestellt. Der abgeschie dene Niederschlag wird abfiltriert. Der Nie derschlag wird unter ammoniakalkalischen Bedingungen in Benzol gelöst.
Die Lösung wird, nachdem sie zweimal mit 1/1o ihres Volumens an 1%iger Natriumhydroxyd- lösung geschüttelt worden ist, zur Trockne eingedampft.
Der Niederschlag wird in einer möglichst kleinen Menge: Äthanol ge löst, worauf die Lösung filtriert und auf ein kleines Volianen eingeengt wird, wobei sich das Ergokryptinin beim Stehen an einem kühlen Ort abscheidet. Das auf diese Weise erhaltene Ergokryptinin wird dann in Methanol gelöst.
Die Lösung wird nach er folgter Einengung bei Raumtemperatur stehengelassen, um die Abscheidung von rei nem Ergokryptinin zu bewirken. Die Aus beute beträgt 210 mg.
Die zwischen 4 und 7 cm unterhalb des obern Endes der Stärke- schiclit befindliche Zone wird herausge- schnitten und wiederholt mit .einer kleinen Menge 0,1-n Schwefelsäure extrahiert. Der saure Extrakt wird zur Entfernung des Bu- tanols mit Äther ausgeschüttelt,
mit Ammo niak alkalisch gestellt und wiederholt mit Äther ausgeschüttelt. Die ätherische Lösung wird zur Trockne eingedampft, worauf der Rückstand in siedendem Benzol gelöst und die benzolische Lösung filtn'ert und an einem kühlen Ort stehengelassen wird.
Der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert, worauf das Filtrat eingeengt und bei Raum temperatur stehengelassen wird, wobei sich Elymoclavin abscheidet. Die Ausbeute beträgt etwa 10 mg.
Die zwischen etwa 7 und 9 cm unterhalb des obern Endes der Stärkeschicht befind- liehe Zone wird der Extraktion mit verdünn ter Schvvefelsäure unterworfen, worauf nach einander in Äther aufgenommen und mit an gesäuertem Wasser ausgeschüttelt wird, wie im Beispiel 4 beschrieben.
Die saure Lösung wird mit Ammoniak alkalisch gestellt, worauf der abgeschiedene Niederschlag von Agrocla- vin durch Überführung in das Succinat einer weiteren Reinigung unterworfen wird. Reine Kristalle von Agroclavin werden in der im Beispiel 2 beschriebenen Weise erhalten. Die Ausbeute beträgt etwa 70 mg.