DE1442309A1

DE1442309A1 - Verfahren zur Herstellung der freien Saeuren oder Ester der BC-Faktoren A,B,C1 und C2

Info

Publication number: DE1442309A1
Application number: DE19651442309
Authority: DE
Inventors: Jaeger Herbert Karl
Original assignee: Upjohn Co
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Priority date: 1964-09-23
Filing date: 1965-09-22
Publication date: 1969-05-14
Also published as: JPS491875B1; NL6512313A; GB1114043A; US3522146A

Description

The Upjphn Company Kalamaaoo (Miohigan, USA).

Verfahren zur Herstellung* der freien Säuren oder Eater der BC-tfaktoren A, B, O₁ und C₂

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer Säure verbindungen, die als BQ-Pak-

toren A, B,

und CL bezeichnet werden.

Die Erfindung beruht auf der Entdeckung, daß Permentationen unter Verwendung von gemischten Stämmen von Blakesiea trispora bisher unbekannte ohemisohe Verbindungen in dem Piltrat enthalten. Wenn diese Verbindungen oder Derivate zu einer Blakealea tribpora-Permentation unter Verwendung von gemischten Stämmen oder nur des negativen Stammes gegeben werden, so beobachtet man eine Zunahme der Ausbeute an Karotinoid-Pigmenten. Das Ausmaß der Stimulation hängt von den jeweils angewendeten lermentationsbedingungen ab. Sei Fermentationen mit gemischten Stämmen wurde eine Zunahme des Karotinoidproduktes um den Paktor 2 beobachtet, während bei Permenta-

90982071300

- 2. - ■ - ■': ■' ■ ■ ■:■::

1442J09

tionen unter Verwendung dea- negativen Stammes Zunahmen ι» den Jaktor 20 feetgestellt wurden»

Ia Verlauf der Reinigung und Isolierung dieser Tier eng miteinander zusammenhängenden BO-faktor-Säuren wurde gefunden» defl sie in ihrer Säureform verhältnismäSig unbeständig sind, in Form ihrer Seter jedoch leicht gereinigt und gewonnen werden können. Die Beter haben die gleiche Aktivität wie die Säure bezüglich der förderung der Produktion von Karotinoid-Pigmenten.

Sie neuen BO-faktoren der vorliegenden Erfindung können in einer Fermentation erhalten werden, bei der gemischte Stämme von heterothallisehen Fungi, die zur Klasse Phyoomyoetes und der Ordnung Mucoralea gehören, verwendet werden. Von besonderer Bedeutung sind diejenigen der Arten Muoor. Bläkeslea. Ohoanephora. Phyoomyoes und Parasitella, wie z.B. Muoor hiemails. Blakeslea trispora« Ohoanephora oiroinans. Ohoanephora oon.iunota und Ohoanephora ot»tourbltarum» Andere Fungi der Ordnung Muooralea können gleichfalls verwendet werden. Title dieser fungi sind in behördlichen Sammlungen von Pilz-Kulturen erhältlich} andere können aus der Luft, dem Boden, verwesenden Pflanzen und anderen natürlichen Materialien nach üblichen, dem Pilzforscher bekannten Verfahren isoliert werden, fermentationen der in den U.S.-Patenten Hr. 3.025.221 und 3.079.380 beschriebenen Art können zur Gewinnung der neuen erfindungsgemäßen BC-Faktoren verwendet werden.

Bei der Herstellung von Xarotinoid-Pigmenten unter Verwendung von gemischten Stämmen von Blakeslea trispora wurden bisher die Pigmente aus dem Myoel gewonnen, während das filtrat der ffermentationsbrühe verworfen wurde. Es wurde nun gefunden, daß das filtrat der fermentatiohsbrühe den großten Seil der neuen BO-faktoren der vorliegenden Erfindung enthält. Diese BO-faktoren, die vorwiegend in dem filtrat der fermente ti onsbrühe gefunden werden, können

ORIGINAL

-S-

Η42ΪΜ

verwendet «erden, die Ausbeute an Iarotinoid-Pigmenten In Karotinoid-FerMentationen unter Verwendung TO& gemischten Stämmen oder des negativenStammes ^τοη Blakeslea trlepora bu erhöhen. Dae Piltrat kann in der rohen form oder konsentriert verwendet werden, oder die neuin BO-PaIc tor en können gereinigt oder in reiner form gewonnen und dann tu einer Fomentation tugegeben werden»

Sie erflndungegemäSen Bö-Faktor-Bäuren »ind in vielen «it Wasser misehbaren organieohen Löeungemitteln lüelioh, e.B. in Methanol, Ethanol, Aceton, Dloxan und in mii fässer nicht mieohbaren organieohen Löeunge- ; J mitteln, wie chlorierten niederen Allcanen, e.B. Methylen- ™ ohlorid, Chloroform, Äthylendichlorid und dergleichen, niederen Alkylestern von niederen ilkyloarbonoäuren, e.B· ithylaoetat, n-Butylaoetat, Allylacetat und dergleichen, Ben«öl, Toluol und Äther. Hethylenohlorld, . ' Toluol und ithylacetat sind die beroreugten Löeungsmittel für die Extraktion der BO-Faktoren.

Zut Gewinnung'der Bö-Paktoren aus der fermentationebrühe 1st en von Torteil, die Üyoelmasse von der Flüssigkeit abzutrennen. Dies kann nach verschiedenen, dem Fachmann bekannten Verfahren, wie z.B. Filtrieren oder Zentrifugieren erreioht werden. Sie filtrierte Brühe λ wird voreugsweiee bei unter etwa 50⁰O auf etwa 5 bis 20 Jt ihres ursprünglichen Volumens eingeengt* Bei Zugabe von j einem bie drei Volumen eines mit Wasser mieohbaren organischen lesungsaittels, wie e.B. Aceton (das bevorBUgt wird), Methanol, Äthanol und dergleichen tu diesem Konzentrat, werden unerwünschte Materialien, die in dem organischen Lösungemittel unlöslich sind, niedergeschlagen. Bie klare, oben schwimmende Flüssigkeit kann dekantiert und voreugsweise Im Vakuum unter 50°Ö eingeengt werden, bis der größte Teil des organieohen Lösungβ- ; mittels verdampft ist. Die BO-Faktoren können aus diesem Konzentrat dadurch gewonnen werden, daß man tunäohst das Konzentrat mit einer Mineralsäure^beispielsweiee

909Ö20/1300 " V

BAD ORIGINAL

Schwefelsäure, Salzsäure, Phpsphorsäure und dergleichen ansäuert und dann das Konzentrat mit einem mit Wasser nicht mischbaren lösungsmittel für den BÖ-Fafctor extrahiert.

Die BO-Faktoren können weiter gereinigt werden, indem man sie aus dem organischen Lösungsmittel mit einer Base, wie,z.B. Natriumhydroxydf KaliumhydroxydT Natriumcarbonat- oder Natriumbicarbonatlösungen (die bevorzugt wird) extrahiert* Der alkalische Extrakt wird durch Zugabe einer Mineralsäure, wie vorstehend beschrieben, angesäuert, bis ein pH-Wert von etwa 2 erreicht ist, und der angesäuerte Extrakt wird dann erneut nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel extrahiert. Die auf diese Weise erhaltene BO-Faktor-Lösung kann mit einer kleinen Menge Wasser gewasohen, getrocknet und zu einem lösungsmittelfreien Ul eingedampft werden, das ale "BO-Faktor-Konzentrat" bezeichnet wird.

Die BC-Faktoren können weiter gereinigt und voneinander durch chromatographische Adsorptionsverfahren getrennt werden, wobei adsorbierende Mittel, wie z.B. Kieselsäuregel, !Eonerde oder Florisil verwendet werden (ein synthetisches Silikat der in dem TJ.S.'-Patent Hr. 2.393.625 beschriebenen Art, das von der Floridin Company verkauft wird). Kieselsäuregel (Merck AGr.) und Plorisil sind die bevorzugten adsorbierenden Mittel. Die adsorbierten BG-Faktoren können durch Auswaschen mit geeigneten organischen Lösungsmittelgemischen, teilweise getrennt voneinander und in verhältnismäßig reiner Form , aus dem adsorbierenden Mittel entfernt werden.

Um eine gute Abtrennung der BÖ-Faktoren in ihrer Säureform von dem adsorbierenden Mittel zu erzielen, ist es notwendig, kleine Mengen, d.h. 0,1 bis 3 # einer niederen Fettsäure, wie z.B. Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure, Valeriansäure und dergleichen, dem zum Aus-

909820/1300

H42309

waschen verwendete Iiösungsmittelgemisch zuzusetzen.

Ein bevorzugtes Lösungsmittelgemiach zum Auswaschen der BC-Faktoren aus Kieselsäuregelkolonnen ist Methylenehlorid-Methanol-Essigsäure (95*5*0,3). Jedoch können auch solche Kombinationen, wie Toluol, Butanol-Bsaigsäur· (84*12*0,3)» Toluol-Aoeton-Propionsäure (65*35*1) und dergleichen verwendet werden.

Die BC-yalctoren A und B können voneinander und von den Faktoren C-, und 0« nach den vorstehend beschriebenen Verfahren in Form ihrer Säuren getrennt werden; jedoch ist es notwendig, die BC-Faktoren C, und 0« ^zu verestern, bevor eine Auftrennung an einer Adsorptionssäule vorgenommen wird. Umgekehrt können die BC-Faktoren A und B an einer Adsorptionssäule nicht wirksam getrennt werden, wenn sie in Form ihrer Ester vorliegen.

Die Veresterung der ^OBC-Faktor-Konzenträte" oder der BC-Faktor-Säuren, die an einem adsorbierenden Mittel der vorstehend beschriebenen Art erhalten werden, kann durch Behandeln des Ausgangsmaterials mit einem Diazoalkan, beispielsweise Diazomethan, Diazoäthan und dergleichen, nach in der Technik bekannten Verfahren erfolgen.

Salze der Bö-Faktoren A, B, C-. und Cp können durch Umsetzung der BC-Faktor-Säuren mit einer qsio*ganisehen oder organischen Base nach bekannten Verfahren erhalten werden. BG-Faktor-Salze, die gebildet werden können, sind z.B. die Natrium-, Kalium- und Kalziumsalze sowie die Salze mit organischen Basen, wie primären, sekundären und tertiären Mono-, Di- und Polyaminen. Die auf diese Weise erhaltenen Salze sind für die gleichen Zwecke brauchbar wie die BC-Faktor-Säuren und -Ester.

Werden die neuen erfindungsgemäßen BO-Faktoren zu Fermentationen von gemischten Stämmen von

909820/1300

Blakesiea trispora oder zu- einer Fermentation zugegeben, bei der nur der negative Stamm von Blakeslea trispora verwendet wird, ao wird eine wesentliche Zunahme der Ausbeute an karotinoiden Pigmenten erzielt. Der Gehalt an Karotinoid-Pigmenten kann leicht durch bekannte spektrophotometrische Verfahren verfolgt werden. Beispielsweise können Fermentationsbrühen, die ß-Karotin enthalten, dadurch untersucht werden, daß man (1) die Karotinoide qualitativ mit einem lösungsmittel für Karotinoide nach in der Technik "bekannten Verfahren extrahiert, (2) die Absorptionskurve zwischen 300 und 600 mk> dieses Extraktes aufzeichnet und (3) den Pigmentgehalt des Extraktes unter Verwendung des Spektrums einer Lösung von reinem kristallinem b-Karotin im gleichen Lösungsmittel und bekannter Konzentration als Bezugsgröße berechnet. -

Die BÖ-Faktoren sind auch zur Stimulation der Biosynthese von Sterolen in Mikroorganismen und zur Regulierung der Biosynthese von Steroid-Verbindungen brauchbar. "

Die nachfolgenden Beispiele erläutern das Verfahren und die Produkte der vorliegenden Erfindung.

Beispiel It Bö-Paktoren.

Die gesamte Brühe einer 250 1 - Fermentation, die unter Verwendung von gemischten Stämmen von Blakeslea triapora erhalten wurde, wurde filtriert und das Myoel, da» die Karotinoid-Pigmente enthielt, wurde verworfen. Die klare Brühe wurde im Vakuum bei unter 30⁰O auf etwa 50 1 eingeengt, und unter Rühren wurden 100 1 Aceton au diesem Konzentrat zugegeben. Ein viskoses, wasserlösliches Material fiel; aus und die klare, oben schwimmende Flüssigkeit wurde dekantiert und beiseite gestellt .--Der ITiedersohlag wurde in 5 1 Wasser gelöst und erneut -

H42309

mit 10 1 Aceton ausgefällt. Die erhaltene klare» überstehende Flüssigkeit wurde von dem Niederschlag durch Dekantiefen abgetrennt und mit der beim ersten Mal erhaltenen, überstehenden Flüssigkeit vereinigt. Diese beiden Flüssigkeiten wurden dann im Vakuum unter 3O⁰C auf etwa 40 bis 45 1 eingeengt. Diese, die BO-Faktoren . enthaltende, acetonfreie Lösung wurde mit 4 H Salzsäure auf einen pH-Wert von 2 eingestellt und zweimal mit je. 30 1 Methylenchlorid extrahiert. Die Methylenchloridextrakte wurden vereinigt, im Vakuum auf 5 1 eingeengt und dann zweimal mit je 3 1 IH Natriumbicarbonatlösung extrahiert. Der Bicarbonatextrakt, der alle BO-Faktoren enthielt, wurde mit 4 N Salzsäure auf einen pH-Wert von 2 angesäuert und zweimal mit je 3 1 Methylenchlorid extrahiert. Die organischen Schichten wurden vereinigt, mit 500 ecm destilliertem Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum zu einem lösungsmittelfreien braunen Öl eingedampft, das 233 S wog und als ^MBC-Faktor-Konzentrat" bezeichnet wurde. Der gesamte BO-Faktor-Gehalt dieses Konzentrates wurde spektrophotometrisch zu 4315 J* bestimmt (unter Verwendung von E^_m « 805).

Säulenohromatographie:

Eine Chromatographiersäule wurde wie folgt präpariert: 1200 g Kieselsäuregel wurden unter Rühren in 3500 ecm eines Gemisches aus 950 Seilen Methylenchlorid, 50 Teilen Methanol und 3 Teilen Bisessig gegeben. Die erhaltene Dispersion wurde in ein Glasrohr (Durohmesser: 6,2 cm) gegeben und nach dem Absetzen bildet sich eine Säule von 89 cm.

17 g des BG-Falctor-Konzentrates, das nach dem vorstehenden Verfahren erhalten war, wurden gleichmäßig an 35 g Kieselsäuregel adsorbiert, indem man sie zuerst in 200 ecm Methylenchlorid löste, das adsorbierende Mittel zugab und das Lösungsmittel in einem rotierenden Vakuum-

909820/1300

Π42309

rerdampfer abdampfte. Sas erhaltene trockene Pulver wurde oben auf die Säule gegeben und die Entwicklung des Ohroma togramms wurde sofort ohne Änderung des Lösungsmittels begonnen. Der BO-Faktorgehalt der gesammelten Traktionen (250 oom-Mengen) war wie folgt1

fraktion 3Ir. Volumen BO-Paktor-flehalt Komponenten

1000 oom keinen . -

5-8" 1000 oom 1220 mg ⁰I + °2

9-XO 500 00» 270 jag (O₁) + (O₂) +B

1250 oom 2280mg B

16-17 500 oom 322 mg B + A

18-29 300000m 3520 ing A

Jede Fraktionsgruppe wurde im Vakuum unter 40⁰O auf etwa 20 oom eingeengt, ein gleiches Volumen destilliertes Toluol wurde zugegeben und die Verdampfung im Vakuum wurde fortgesetet. !Der Rückstand enthielt Spuren ron Sssigsäur· und wurde deswegen erneut mit 20 com eines lsi·" GeMiβone8 yon destilliertem Toluol und destilliertem n-Heptan eingedampft. Durch dieses Verfahren wurden die BO-Paktortn A und B ale klares, hellgelbeβ öl erhalten. Durch weiter·· Ohromatographier·» dieser öle wurden BO-Paktoren A und B in hoher Reinheit erhalten.

Beispiel 2» Veresterung der BO-Paktoren O₁ und Og.

!line Itherlösung τοη 2,3 g eines uemisohes der BC-Paktoren O₁ und O₂, das an der vorstehend beeohriebenen Säule erhalten wurde und eusätzlich etwas inaktives -Material enthielt, wurde loot Bisbad temp era tür mit einer kalten Ätherlösung von Diaeomethan titriert, das nach de» von A.P. MoKay u.a. in Canadian Journal of Research, 6Ο3, I95O beschriebenen Verfahren erhalten worden war.

909820/1300 _r .

' "te ii'

/ Sobald die Zugabe der Diazomethanlösung nicht langer zu ! einer Gasentwicklung führte» wurde ein 10 ji-igtr Überschuß auf einmal zugegeben und das Gemisch 10 Minuten bei Raumtemperatur abgestellt. Übersohüssiges Diazomethan und das Lösungsmittel wurden im Vakuum entfernt, wobei ein Gemisch der Methylester der BG-Faktoren O^ und CU übrig blieb.

. Die Methylester der BO-Faktoren Ä und B können nach dem vorstehenden Verfahren erhalten werden. Die Äthylester der BO-Faktoren A, B, C^ und Og können gleiohfalls nach dem vorstehenden Verfahren hergestellt werden, wobei man Diazoäthan anstelle von Diazomethan verwendet.

Beispiel 3: Säulenchromatographie der Methylester der BC-Faktoren O₁ und Og.

Eine Chromatographiersäule wurde wie folgt präpariert: 300 g Kieselsäuregel wurde in einen Liter eines Gemisches aus 950 ecm destilliertem Hexan und 50 ecm absolutem Äthanol eingerührt. Die erhaltene Dispersion wurde in ein Glasrohr (Durchmesser: 4,13 cmj Länget 76,2 om) ge-, gössen und nach dem Absetzen bildete sich eine 63,5 cm hohe Säule.

Bin Gemisch der Methylester der Bö-Faktoren G^ und Cp (2,3 g), das nach Beispiel 2 hergestellt wurde, wurde gleichmäßig an 6 g Kieselsäuregel adsorbiert, indem man es zunächst in 30 ecm destilliertem Methylenchlorid löste, das Adsorptionsmittel zugab und das Lösungsmittel in einem rotierenden Vakuumverdampfer abdampfte. Das erhaltene trockene Pulver wurde oben auf die Säule gegeben und die Entwicklung des Ohromatogramms wurde unmittelbar ohne Änderung des Lösungsmittels begonnen. Der BG-Faktor-Gehalt der Fraktionen (50 ecm-Mengen) war wie folgt:

S09820/13Ö0

Fraktion Hr.	1442309 Volumen BC-Faktor-Gehalt Komponenten	573 mg 232 mg	* MeO₁ MeO₁ + MeO₂
1-27 28-32 - 33-35	1450 ocm 250 ecm 150 com	439 mg -■\-375- ag'	MeO₂ " MeG** + Verunreini gungen
36-38 39-45	150 ocm 350 com

Jede Fraktionsgruppe wurde im Vakuum unter 40⁰O

zu klaren gelben ölen eingedampft. Die Fraktionen 28-32 I die Fraktionen 36-38 enthielte] in reiner Form als Methylester.

und die Fraktionen 36-38 enthielten BO-Faktoren O₁ bzw.

Beispiel 4t

Zwei 20 oem-Portionen des von R.F. Anderson, M. Arnold, Y.B.U. ISTelson und A. Oigler [Agricultural and Food öhem., Bd. 6, S. 543-5 (1958)] beschriebenen Fermentationsmediums wurden mit 1 ecm einer drei Tage alten Kultur von Blakeelea triapora [(-)URRL 2457] inokuliert und unter mechanischem Rühren bei 25⁰Q inkubiert. Nach. 1-1/2 Tagen wurden etwa 150 g BC-Faktor-Konzentrat, das etwa 20 mg BO-Faktoren enthielt, zu einem der beiden Kolben zugegeben, und die Inkubation wurde fortgesetzt. Bereits 12 Stunden später war das Mycel in den Kolben, die die BÖ-faktoren erhalten hatten, wesentlich dunkler gelb als das Myeel im Kontrollkolben. Hach einer Gesamtinkubationszeit yon 5-1/2 Tagen wurde das Mycel aus beiden Kolben durch Filtrieren isoliert, dann wurde mit Methanol und Methylenchlorid extrahiert und spektrophotometrlsch an*lysiert» .

Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle I angegeben.

Das vöretehehd« Verfahren wurde mit der Abweichung witdirholt, daß ein «inue-C(^)MHRIi 2457A und «in plus-

9098 2071300

--11 - -

C(+)IHEL 2456]-Stamm τοη Blak·alga trieρora but Inokulation (Gemischt β tammfermentation) Terwendet wurde. Sie Ergebnisse sind in Tabelle I angegeben»

Tabelle It Frhd*ht§ ,!"uTotinoid—Bildwe/t nach Zugabe τοπ. BQ-fuktorsn«

-tarotinoidgehalt τοη 20 oom Brtihe Zunahme

Inokulation ohne BO-Faktoren alt BO-Faktoren faktor

(-1 HBBL 120 Lt g. 2160 ag. 18,0

2457 ^r ^r ■

(-) ΙΤΒΗί

und 3420^g. 7000 Ug. 2,0

(4-) IRRL * 2^56

KurBJkalisohe und ohenlaohe Kennzeiohen der BO-faktoren» BO-Paktor A in Fora der Säuret

Molekulargewioht, durch UaBsenspektroakopie bestimmt» 306» Durch Maaaenepektroskopie und Verbrennunga -analyae beetimute Molekularformelt <^σΐθ^Η26°4*

BO-Paktor A als Methylester t

Durch Masaenapektroakopie beatimmteaMolekulargewichts 320. Durch Maasenapektroakopie und Verbrennungs-¹ analyae bestimmte Molekularforael ι

Verbrennungaanalyeet 0« 70,34», H* 8,84. Methoxylbeatimaungt 10,32.

Optiache Drehungt tot!²/¹" « + 34° (0,8786 g/100 com Methanol).

Das UV-Spektrum in Oyclohexan (0,00963 g/l) hat folgende Maximat

9 0 9 8 2 0/1300 '

BAD ORIGINAL '

max.

232	(sh)	9,05
-303		20,70
315	(sh)	25,40
^329	19,95

( in Fig. II der Zeichnung abgebildet)

cm
IR-Spektrum in flüssigem FiIm* 3440 (S), 3060(W), 2950 (S),

2930 (S), 2850 (M), 1730 (S), 1660 (S), 1647 (S), 1597 (S), 1558 (M), 1450 (S), 1438 (S), 1390 (M), 1375 (S), 1353 (S), 1310 (S), 1275 (S), 1248 (S), 1188 (S), 1137 (S), 1125 (S), 1095 (S), 1060 (M), 1023 (M), 1008 (M), 990 (M), 968 (S), 945 (W), 932 (W), 908 (W), 876 (W), 845 (W), 820 (W), 800 (W), 760 (W), 718 (W), (in Pig. I der Zeichnung abgebildet.

BO-Faktor B in Form der Säure«

Durch Massenspektroskopie bestimmtes Molekulargewicht: 306. Durch Massenspektroskopie und Verbrennungsanalyse bestimmte Molekularformel O^gHpgO^

BO-Faktor B als Methylester:

Durch Massenspektroskopie bestimmtes Molekulargewicht: 320. Durch Massenspektroskopie und Verbrennungsanalyse bestimmte Molekularformel: ^cig^28°4 *

Verbrennungsanalyse: 0= 70,55; H= 9,18.

Me thoxylb e s timmung: 10,16.

²J

Optische Drehung: Ca]²J = + 29° (0,5466 g/100 ecm Methanol) UV-Spektrum in Cyclohexan (0,01770 g/l Gyclohexan):

909820/1300

9*25	90
20,	65
25,	10
20,

H42309

■ax. E /1000

231

304 (sh)

316

329 (sh)

(in Pig. 71 der Zeichnung abgebildet).

cm I.E.-Spektrum (in Nujol-Mull): 3440 (M), 3070 (W), 2950 (öl)

(S), 2870 (Öl) (M), 1730 (S), 1660 (S), 1625 (M), f

1592 (S), 1558 (M), 1460 (öl) (S), 1452 (S), 1433 (S), 1420 (M), 1375 (Öl) (S), 1352 (S), 1340 (S), 1310 (S), 1275 (M), 1250 (S), 1188 (S), 1135 (S), 1098 (S), 1085 (M), 1063 (M), 1033 (M), 1024 (M), 988 (M), 968 (S), 906 (W), 875 (W), 845 (M), 800 (W), 762 (W), 715 (W),

(in Pig. Ill der Zeichnung abgebildet).

BC-Paktor O₁ als Methylestert

Durch Massenspektroskopie bestimmtes Molekulargewicht! 318. Durch Massenspektroskopie und Verbrennungsanalyse bestimmte Molekularformels ^Giq^26⁰4 '

Verbrennungsanalyse: 0= 70,48j H= 8,30.

MethoxylbeStimmung: 10,40.

Optische Drehung: [a]|j⁴ = + 35° (0,7848 g/100 com Methanol).

UV-Spektrum in Oyclohexan (0,01133 g/l Oyclohexan).

p^ max. £/100

232	(sh)	7,00
'-^ 306		21,00
318		25,30
333	18,85

(in Pig. VI der Zeichnung abgebildet) 909820/ 1300

H42309 ;

Das IR-Spektrum In flüssigem film» 3430 (W), 3300 (W), 3080 (W), 2945 (M), 1725 (S), 1662 (S), 1625 (M), 1593 (M), 1557 (M), 1515 (W), 1507 (W), 1457 (M), 1450 (M), 1432 (M), 1374 (M), 1350 (S), 1340 (M), 1308 (S)," 1270 (M), 1247 (S), 1186 (S), 1157 (M), 1135 (S), 1125 (M), 1097 (M), 1030 (M), 1022 (M), 988(M), 945 (W), 923 (W), 910 (W), 875 (W), 843 (W), 815 (W), 766 (W), 745 (W), 760 (W), 738 (W), 717 (W), 670 (W), ( in Pig. V der Zeichnung abgebildet).

BC-Paktor O₂ als Methylester»

Durch Massenspektroskopie bestimmtes Molekulargewicht»318. Durch Massenspektroskopie und Verbrennungsanalyse bestimmte Molekularformel» ^G-\q&o6^QM- *

Verbrennungsanalyse». 0= 70,37«. H= 8,03.

MethozylbeStimmung: 10,42.

Optische Drehung [α]§* = + 43° (0,930 g/100 ecm in Methanol).

UV-Spektrum in Cyclohexan (0,01047 g/l Gyclohexan)s

A mac. ί /100

232	9,70
— 303 (sh)	21,65
314	26,35
^- 329 (sh)	20,35

(in Pig. VIII der Zeichnung abgebildet).

IR-Spektrum in flüssigem PiIm»

cm'¹
3420 (W), 3300 (W), 3060 (W), 2980 (M), 2940 (M), 1730 (S), 1662 (S), 1600 (M), 1562 (W), 1514 (W), 1462 (W), 1448 (W), 1435 (M), 1374 (W), 1352 (M), 1310 (M), 1305 (W), 1248 (M), 1190 (M), 1160 (M), 1138 (M), 1098 (M), 1078 (W), 1025 (W), 985 (W)₁ 970 (W), 945 (W), 877 (W), 842 (W), 815 (W), 762 (W), 717 (W), 667 (W), (in Pig. VII der Zeichnung abgebildet).

90 9820/1300

H42309

Me BC-Faktoren in Form der Satiren wurden auch durch Dünnsohlchtchromatographie charakterisiert, wie in flg. IZ der Zeichnung gezeigt let. Die Platte wurde eine Std. mit dem aus Methylenchloridt Methanol! Essigsäure (95:4,7*0,3) bestehenden Lösungsmittelsystem entwickelt und dann alt einer gesättigten Lösung Ton Antimontrichlorid (SbOl,) in Chloroform besprüht. Die BO-Faktoren A und B erschienen 10 Minuten nach dem Besprühen rot, während die BC-Faktoren O₁ und 0„ gelb erschienenAuch als Methylester wurden die Bö-Faktoren durch DünnschichtChromatographie unter Verwendung eines aus η-Hexan und absolutem Äthanol (95t5) bestehenden Lösungsmittelsystems charakterieiert. Die Platte wurde eine Stunde entwickelt und dann mit einer gesättigten Lösung von Antimontrichlorid in Chloroform besprüht. Alle Flecke erschienen 10 Minuten nach dem Besprühen orangefarbig. Siehe Fig. X der Zeichnung.

909820/1300

Claims

H42309 Patentansprüchet

1. Verfahren zur Herstellung der im wesentlichen wasserfreien, freien Säure oder der Ester des Bö-Faktors A der

(a) als Säure

(1) ein durch Massenspektroskopie bestimmtes Molekulargewicht von 306.

(2) eine Molekularformel von Οχ8^26^Ο4*

(3) ein charakteristisches Dünnschichtchromatogramm hat, wie es in Pig. IX der Zeichnungen gezeigt ist, und

(b) als Methylester

(1) ein durch Massenspektroskopie bestimmtes Molekulargewicht von 320.

(2) eine Molekularformel von ^cig^H28°4"

(3) eine Verbrennungsanalyse von C= 70,34-, H= 8,84-. (4·) eine MethoxylbeStimmung von 10,32.

(5) eine optische Drehung von: C«3^ = + 44° (0,8786 g/100 ecm Methanol).

(6) das folgende auch in Pig. II der Zeichnung gezeigte UV-Spektrum.

909820/1300

A aax. £ /100

232 (Bh) 9,05 ^303 20,70 315 (eh) 25,40 -329 19,95

(7) das in Jig, I der Zeichnungen gezeigte IR-Absorp-fcionespektrum und

(8) das in Fig. X der Zeichnungen gezeigte charakteristi sche dünnschichtige Chromatogramm hat, sowie des BC-Paktor8 B, der

(a) als Säure

1) ein durch Massenspektroskopie bestimmtes Molekulargewicht von 306}

2) eine Molekularformel von

3) das in figur 9 der Zeichnung gezeigte charakteristische Dünnschiclitchromatogramm hat,

und(b) als Methylester

1) ein durch Massenspektroskopie bestimmtes Molekulargewicht von 320;

2) eine Molekularformel von ^ΰΐ9^28^^

3) eine Verbrennungsanalyse von 0= 70,55, H= 9,18;

4) eine Methoxylbestimmung von 10,16;

5) eine optische Drehung [<x]²^ ■ + 29° (0,5466 g pro 100 com Methanol); ^D

6) das auch in Fig. 17 der Zeichnung gezeigte folgende UV-Spektrum:

Λ max. £ /IOOO

231 9,25

—304 (sh) 20,90

316 25,65

⁽4

- 18 - '■--...■

HA2309

7) das in Pig. Ill der Zeichnung gezeigte IH-Spektrum, und

8) das in Pig. X der Zeichnung gezeigte charakteristische Dünnschichtehromatogramm hat, sowie des BC-Faktora C-,, der als Methylester

1) ein durch Massenspektroskopie bestimmtes Molekulargewicht von 318;

2) eine Molekularfprmel von ⁰Ig¹^e°4*

3) eine Verbrennungsanalyse von C= 70,48, H= 8,30;

4) eine MethoxylbeStimmung von 10,40;

5) eine optische Drehung Ca]^ = + 35° (0,7848 g pro 100 ecm Methanol);

6) das auch in Pig. VI der Zeichnung gezeigte folgende UV-Spektrum:

Λ max> £/100

232 (eh) 7,00 .306 21,00 318 25,30 '333 18,85

7) das in Pig. V der Zeichnung gezeigte IR-Absorptionsspektrum;

8) das in Pig. X der Zeichnung gezeigte charakteristische Dünnschichtohromatogramm, und als Säure

9) das in Pig. IX der Zeichnung gezeigte charakteristisches Dünnsohiohtchromatograinm hat, sowie des BC-Paktors O₂, der als Methylester

909820/1300

1) ein durch. Massenspektroskopie bestimmtes Molekulargewicht von 318}

2) eineMolekularformel von C-iqHpgO^i

3) eine Verbrennungsanalyse von O= 70,37; H= 8,03;

4) eine Methoxylbestimmung von 10,42;

5) eine optische Drehung Dxjf^¹"« + 43° (0,930 g/100 oca Methanol); ^υ

6) das auch in FIg; VIII der Zeichnung gezeigte folgende UV-Spektrum:

A max. £ /IOOO

232 9,70

^303 (sh) 21,65 |

314 26,35 *

.^328 (sh) 20,35

7) das in Pig. VII der Zeichnung gezeigte IR-Absorptionsspektrum;

8) das in Fig. Σ der Zeichnung gezeigte charakteristische Dünnschichtchromatogramm, und als Säure

9) das in Fig. IX der Zeichnung gezeigte charakteristische Dünnschichtchromatogramm hat,

dadurch gekennzeichnet,'daß man gemischte Stämme von Blakeelea trispora in einem wässrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen kultiviert und die BC-Faktoren A, B, D-, und Ο« aus dem Filtrat gewinnt.

2. Verfahren zur Erhöhung des Karotinoidgehaltes bei der Gemischt-Stamm-Fermentation von Blakeslea trispora. dadurch gekennzeichnet, daß man ein BC-Faktor-Konzentrat zu der Fermentation zugibt.

3. Verfahren zur Erhöhung des Karotinoidgehaltes bei der Fermentation des negativen Stammes von Blakeslea trispora, dadurch gekennzeichnet, daß man ein BO-Faktor-Konzentrat zu der Fermentation zugibt.

ORIGINAL INSPECTED

909820/13 0 0

H423Q9

4. Verfahren zur Erhöhung des Karotinoidgehaltes bei der Gemiseht-Stammfermentation von Blake el ea trispora« dadurch gekennzeichnet, daß man Säuren, Ester oder Salze der BO-Faktoren A, B, CU und C„ der Fermentation zusetzt.

5. Verfahren zur Herstellung eines BO-Faktor-Konzentrats aus einer Blakesiea trispora -Fermentation unter Verwendung von gemischten Stämmen, dadurch gekennzeichnet , daß man

1) die Brühe filtriert»

2) das FiItrat einengt;

3) 1 bis 3 Volumen eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels dem Konzentrat zusetzt}

4-) die klare, oben schwimmende Flüssigkeit abdekantiert;

5) die oben schwimmende Flüssigkeit einengt;

6) das Konzentrat mit einer Mineralsäure zu einem pH-Wert von etwa 2 ansäuert;

7) das Konzentrat mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel für die BO-Faktoren extrahiert;

8) die BO-Faktoren aus dem organischen Lösungsmittel mit einer Base extrahiert;

9) das alkalische Extrakt mit einer Mineralsäure ansäuert, bis ein pH-Wert von etwa 2 erreicht ist.

10) - den angesäuerten Extrakt mit einem mit Wasser nicht

mischbaren organischen Lösungsmittel extrahiert;

11) die auf diese Weise erhaltene BG-Faktor-Lösung

909820/1300

mit Wasser wäscht und

12) die Lösung trocknet und zu einem lösungsmittelfreien öl eindampft, das als BO-Faktor-Konzentrat bezeichnet wird.

Für The Upjohn Company

Recht sai

909820/1300