DD211582A5 - Verfahren zur herstellung von ergopeptinderivaten - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von cyclischen 9'-Thiapeptidergotalkaloiden, die von fermentativ herstellbaren 9'-Methylen-peptidergotalkaloiden abgeleitet sind. Das erfindungsgemaesse Verfahren zeichnet sich dadurch aus, dass man einer fluessigen Kultur eines die entsprechende 9'-Methylen-Verbindung produzierenden Stammes L-Thiazolidin-4-carbonsaeure oder ein Salz dieser Saeure zugibt und die erhaltene Verbindung gewuenschtenfalls in ein Saeureadditionssalz ueberfuehrt. Die erfindungsgemaess hergestellten Verbindungen weisen Dopaminrezeptoren stimulierende, Prolaktin-sekretionshemmende, gefaesstonisierende, antidepressive und vigilanzerhoehende Eigenschaften auf.

Description

62 621 18 — -ή

Au s s ch e i dung sannie 1 dung

aus AP G 07 D /242 325/7

^zur Herstellung von Brgopeptinderivaten

Anwendungsgebiet der Erfindung

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein "Verfahren zur Herstellung von Ergopeptinderivaten. Die Erfindung betrifft insbesondere die Herstellung von cyclischen 9*—Thia—peptidergotalkaloiden, die von fennen— tativ herstellbaren 9'-^ethylen—peptidergotalkaloiden abgeleitet sind, in Form der freien Basen oder ihrer Säure— additionssalze»

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind in der Literatur bisher nicht beschrieben worden.

Es sind auch keine Angaben über. Verfahren zur Herstellung von 9'—Ihia—peptidergotalkaloiden bekannt.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung von neuen Verbindungen mit wertvollen pharmakologisehen Eigenschaften und einem breiten Wirkungsprofil♦

Darlegung des Yfesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Verbindungen mit den gewünschten Eigenschaften und Verfahren zu ihrer Herstellung aufzufinden.

22.7*1983 - 2 - 62 621/18

Diese Verbindungen können erhalten werden, indem man einer flüssigen Kultur eines die entsprechende 9*-Methylen-Verbinduhg produzierenden Stammes L-Thiazolidin-4-carbonsäure oder ein Salz dieser Saure zugibt*

Insbesondere gelangt man zu den Verbindungen der Formel 1,

worin entweder

R^ für Methyl steht und R₂ Isobutyl oder Benzyl bedeutet

oder R₁ für Äthyl steht und R₂ Benzyl bedeutet

oder R₁ für Isopropyl steht und R₂ Isopropyl, sek_#-Butyl₄

Isobutyl oder Benzyl bedeutet,

und ihren Säureadditionssalzen, indem man einer flüssigen Kultur eines die entsprechende 9'-Methylen-Verbindung produzierenden Stammes L-Thiazolidin-4-carbonsäure oder ein Salz dieser Säure zugibt und die erhaltenen Verbindungen gewünschtenfalls in ihre Säureadditionssalze überführt»

22.7.1983 - 3 - 62 621/18

FQr die Salzbildung geeignete Sauren sind z» B. die Chlorwasserstoffsaure« Schwefelsaure, Maleinsäure« Fumarsäure und Weinsäure.

Als Stämme, die 9'-Methylenderivate der Verbindungen der Formel Z produzieren« können Stämme von Claviceps purpurea verwendet werden sowie solche, die aus einem Ausgangsstamm von Claviceps purpurea durch Mutation unter Einwirkung von Strahlen oder Behandlung mit mutagenen Substanzen oder durch Selektion gewonnen werden können.

Zur Herstellung von 9,*-Thia-ergotamin und 9^§-Thia-ergotaminin zum Beispiel wird als bevorzugter Ergotarain/Ergotarainin produzierender Stamm die Claviceps purpurea Mutante NRRL 12043 verwendet. Eine Kultur davon wurde am 20. 9. 1979 beim United States Department of Agriculture (Northern Regional Research Center)« Peoria, 111., USA, unter der Kulturnummer NRRL 12043 deponiert.

Zur Herstellung von 9*-Thia-ergocristin und 9'-Thia-ergocristinin wird als bevorzugter Ergocristin/Ergocristinin produzierender Stamm die Claviceps purpurea Mutante NRRL 12044 verwendet. Eine Kultur davon wurde am 20. 9. 1979 bei der oben erwähnten Deponierungssteile unter der Kulturnummer NRRL 12044 deponiert.

Die zur Herstellung der übrigen Verbindungen der Formel I verwendbaren Stämme sind bekannt und stehen ebenfalls der Öffentlichkeit zur Verfugung.

22.7.1983 - 4 - 62 621/18

Charakterlstikum und fermentative Gewinnung der Stämme NRRL 12043 und 12044

^a) !£^^r2^S.r

Der Ausgangspilzstarara wurde aus einem auf Brotnus im Wallis (Schweiz) gefundenen Sklerotium, welches Ergotamin enthielt! isoliert» Durch mehrere mutagene Behandlungsschritte unter Verwendung von Ultra-Violett-Strahlen und Chemikalien gelangte man zu dem erfindungsgemäß verwendeten Stamm NRRL 12043» welcher folgendermaßen charakterisiert werden kann:

Es wird ein kleines Mycelstück des Stammes NRRL 12043 im Zentrum einer Agarplatte mit einem Medium der nachfolgend angegebenen Zusammensetzung ausgeimpft:

60 g Saccharose^ 10 g Asparagin» 0^5 g Casamino-Acids (Oifco)i 0i»25 g KH₂PO₄V O^25 g MgS0_4#7 H₂O; 0,125 g KCl, 16 mg FeSO₄,7 H₂O, 10 mg ZnSO₄.7 H₂O, 15 g Agar und dest. Wasser ad 1 Liter* Der pH-Wert wird mit einer 25%igen Ammoniak-Lösung auf 6,0 eingestellt. Das Medium wird 20 Minuten bei 120 ⁰C sterilisiert. Bei 24 ⁰C ist nach 7 Tagen eine Kolonie von etwa 3 cm Durchmesser, nach 14 Tagen von etwa 5 cm und nach 20 Tagen von etwa 8 cm Durchmesser entstanden« Die Kolonie ist gewölbt und leicht gefaltet* Der Rand ist diffus. Die Farbe der Kolonie ist im Zentrum beige-violett und am Rand beige-grau. Eine 20 Tage

2 8 alte Kolonie enthält pro cm ca. 1,10 Konidien. Diese sind oval und haben Dimensionen von 6-12x4-7iu

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b) Charakteristikuin des Stammes 12044

Oer Ausgangspilzstamm wurde aus einem auf Roggen in Nordamerika gefundenen Sklerotium, welches Ergocristin ent·» hielt, isoliert« Durch mehrere mutagene Behandlungsschritte unter Verwendung von Ultra-Violett-Strahlen und Chemikalien gelangte man zu dem erfindungsgemäß verwendeten Stamm NRRL 12044» welcher folgendermaßen charakterisiert werden kann:

Es wird ein kleines Mycelstück des Stammes NRRL 12044 im Zentrum einer Agarplatte mit einem Medium der nachfolgend angegebenen Zusammensetzung ausgeimpft:

70 g Malzextrakt (Wander)-« 30 g Kartoffeln (Stocki, Knorr), 15 g Agar und dest* Wasser ad* 1 Liter» 0er pH-Wert betragt 5*3 - 5,7· Das Medium wird 20 Minuten bei 120 ⁰C sterilisiert. Bei 24 C ist nach 7 Tagen eine Kolonie von etwa 2 cm Durchmesser⁵, nach 14 Tagen von etwa 4 cm und nach 20 Tagen von etwa 5 cm Durchmesser entstanden·

Das Mycel ist flach gewölbt und mit einem weißen, in den Luftraum ragenden, watteartigen Hyphengeflecht bedeckt» Im Zentrum wird ein kraterförmiger Hocker von etwa 1 cm Durchmesser ausgebildet· Von ihm gehen radiale Falten aus· Das dem Agar aufliegende Mycel ist violett gefärbt· Es entstehen konzentrische Zonen mit stärkerer und solche mitschwächerer Pigmentierung· Der Rand ist diffus· Ein 20 Tage

2 8 altes Mycel enthält pro cm ca_# 1,10 Konidien* Diese streuenin ihren Dimensionen ziemlich stark (5 - 12 χ 3 < », 7*jj;meist jedoch 5 - 6 -x 3 Jj), Das Mycel enthält keine Alkaloide«

22»7»1983 - 6 - ' 62 621/18

a) NRRl.^12043

Vermehrung und Impfstoffherstellung des Stammes NRRL 12043 können in der Weise erfolgen, daß man von einer der oben beschriebenen Kolonien die Konidien in sterilem Wasser abschwemmt und damit Schrägagarröhrchen mit des Agarmedium beimpft;^ bestehend aus: 70 g Malzextrakt (Wander)i 30 g Kartoffeln (Stocki, Knorr)> 15 g Agar und dest. Wasser ad 1 Liter» Der pH-Wert beträgt 5V3 - 5γ7. Das Medium wird 20 Minuten bei 120 ⁰C sterilisiert» Nach 14 Tagen enthält eine solche Schragagarkultur (12 ml Medium in einem Reagenz glas von 18 mm Durchmesser und 20 cm Länge* keilförmig ausgelegt) etwa 1*10 Konidien» Von einer solchen Schragagarkultur werden Konidien in sterilem Wasser aufgeschwemmt, und dabei wird eine Konzentration von 10° - 10 Sporen/ml hergestellt» Mit je 0,5 ml dieser Suspension werden Schrägagarröhrchen mit dem gleichen Medium gleichmäßig beimpft» Diese Kulturen werden bei 24 ⁰C während 14 Tagen bebrütet» Hierauf werden sie bei -40 ⁰C gelagert»

b) NRRL_-12044

Vermehrung und Impfstoffherstellung des Stammes NRRL 12044 können in der Weise erfolgen^ daß man von einer der oben beschriebenen Kolonien die Konidien in sterilem Wasser abschwemmt und damit Schrägagarröhrchen mit dem oben beschriebenen Agarmedium beimpft. Nach 18 Tagen enthält eine solche Schragagarkultur (12 ml Medium in einem Reagenzglas von

22 «7 .1983 - 7 - 62 621/18

18 mm Durchmesser und 20 cm Länge* keilförmig ausgelegt) etwa 1 - 2«10 Konidien« Von einer solchen Schrägagarkultur werden Konidien in sterilem Wasser aufgeschwemmt, und dabei wird eine Konzentration von 10 ^ 10 Sporen/ml hergestellt. Mit je 0,5 ml dieser Suspension werden Schräg agarröhrchen mit dem gleichen Medium gleichmäßig beimpft. Diese Kulturen werden bei 24 ⁰C während 14 Tagen bebrütet· Hierauf werden sie bei -40 C gelagert·

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens hat es sich als vorteilhaft erwieasen, die Sporen erst über Vorstufe(n) heranzuzüchten, bevor das Produktionsmedium angeimpft wird* Anfänglich soll man ein Medium wählen, in welchem gute Sporenkeimung und ein schnelles Mycelwachstum stattfinden« Für ein solches Medium sind geeignet: eine Kohlenstoffquelle in reichlicher Konzentration in Form eines Mono- oder Disaccharide» gegebenenfalls in Kombination mit einem Polyalkohole eine Stickstoffquelle in Form einer Aminosäure oder eines Ammoniumsalzes« ferner Mineralsalze¹, Spurenelemente und komplexe Zusätze aus pflanzlichen Samen« Das pH wird vorteilhaft zwischen 5 und 7 eingestellt« Das Medium wird in der ersten Stufe mit Konidien reichlich beimpft und auf der Schüttelmaschine oder in Fennentern von verschiedenen Größen bei 22 - 26 ⁰C während 4-7 Tagen inkubiert. Es entsteht eine dichte Kultur aus lockeren, watteartigen, 2 - 3 mm messenden, unpigmentierten Mycelflocken, welche aus langen Hyphen von 3 - 6 ρ Durchmesser bestehen*

22.7.1983 ~ 8 ~ 62 621/18

Hauptkulturen

«MriHia«Hia»Hia>i

Mit einem Teil der in einer oder gegebenenfalls mehreren Vorstufen erhaltenen Kultur wird das Produktionsmedium beimpft» welches vorteilhaft eine solche Zusammensetzung aufweist» daS in kurzer Zeit ein hohes Mycelgewicht erreicht wird. Als beste und billigste Kohlenstoffquelle hat sich Saccharose erwiesen, als Stickstoffquelle Ammoniumsalze^ wie Oxalaty Zitratv Succinat und Formiat* Ferner sollen Mineralsalze und als Spurenelements Eisen und Zink zugegen sein. Die Kulturen werden entweder in Erlenmeyerkolben oder in Fermentarn von verschiedenen Größen durchgeführt. Wichtig ist eine gute Belüftung. Die optimale Temperatur liegt bei 24 °C»

Am Anfang der Alkaloidbildung, normalerweise zwischen dem 3» und &φ Tag der Hauptkultur* werden 1-5 g/Liter L-Thiazolidin-4-carbonsäure oder von einem Salze dieser Säure* wie z_# B. das Kalium-« Natrium- oder Ammoniumsalze zur Hauptkultur gegeben. Hierauf werden die Kulturen reiter während 5-12 Tagen bebrütet* Es entsteht im Verlaufe von 9-18 Tagen eine dichte Kultur, die hauptsächlich aus 0,5 - 3 mm langen und Oil - 1 mm dicken zylindrischen kompakten Mycelpartikeln neben feinen Flocken besteht. Die Mycelpartikel zeigen in ihrer Struktur das Bild eines plectenchymatischen Gewebes aus kugeligen oder polyedrischen bis kurzzylindriechen, dickwandigen und stark vakuolisierten Zellen von 6 < » 12 χ 5 - 14 p_t vornehmlich 8x9 μ, welches von bis zu 100 y langen Hyphen durchzogen ist«, Sie sind bräunlich pigmentiert. Das Kuliurfiltrat ist ebenfalls bräunlich gefärbt.

22_#7«1983 - 9 - 62 621/18

Wenn sich die Zunahme des Gewichtes und des Alkaloidgehaltes des Hycels verringert, können nach an sich bekannten Methoden die Alkaloide mit organischen Lösungsmitteln aus dem gesamten Kulturbrei extrahiert werden, oder man trennt das Mycel durch Filtration oder Zentrifugation vom Filtrat und extrahiert beide Teile separat« Der H_aüptanteil der Peptidalkaloide ist im Mycel angereichert«

Isolierung der Verbindungen der Formel^I

Diese Schwefel enthaltenden Ergotpeptine lassen sich aus der Kulturbrühe, aus dem Kulturfiltrat oder as dem Mycel durch bekannte extraktive Verfahren isolieren« Die Reinigung erfolgt unter Anwendung üblicher Reinigungsschritte-»; wie zum Beispiel durch Fällungen aus aktiven mit inaktiven Lösungsmitteln oder durch Oberführen in schwerlösliche Salze. Besonders geeignet sind bekannte Reinigungsverfahren, wie z» B, Chromatographie an Aluminiumoxiden; Kieselgelen» Sephadex LH-20 usw. in den jeweils geeigneten Lösungsmittelsystemen« Wie die bekannten Ergotpeptine sind auch diese neuen 9*-Thia-ergopeptine gegen Tageslicht empfindlich« In freier Form und in polaren Lösungsmitteln isomerisieren sie bis zu einem bestimmten Gleichgewicht in die jeweils andere Form«

In Salzform, wie sie z« B« mit Methansulfonsäure hergestellt werden können, sind 9*-Thia-ergotamin und 9*-Thiaergocristin über längere Zeit stabil«

Erfindungsgemäß erhaltene Verbindungen können, falls er-

22_#7,1983 - 10 - 62 621/18

wünscht^ nach an sich bekannten Methoden in weitere Verbindungen überfuhrt werden.

So können die Verbindungen der Formel Ia in Stellung 1 und/oder 2 und/oder 6 alkyliert werden·

Ferner können die Verbindungen der Formel Ia in Stellung 9^ 10 reduziert werden»

Außerdem können die Verbindungen der Formel Ia in Stellung 2 halogeniert werden«

Die erfindungsgemäß hergestellten Verbindungen sind in der Literatur bisher nicht beschrieben worden, Sie weisen im Tierversuch interessante pharinakologische Eigenschaften auf und können daher als Heilmittel verwendet werden.

Insbesondere zeigen diese Verbindungen eine popaminreZeptoren stimulierende Wirkung* Die dopaminergen Eigenschaften konnten an Ratten*, bei denen durch eine 6-Hydroxydopamin·· Injektion in die substantia nigra eine unilaterale Verletzung der nigro-neostriatalen Dopaminbahn erzeugt wurde, mit Dosen zwischen etwa 0,5 bis 100 mg/kg festgestellt werden /"Methode nach ü_# Ungerstedtv Acta physiol. 3cand_# Supply 367« 69 - 93 (197I)J, Nach Verabreichung des Wirkstoffes war eine deutliche Aktivierung dadurch erkennbar, daß die Ratten in Richtung der nicht denervierten Seite rotierten* Die neuen Substanzen können aufgrund ihrer dopaminergen Eigenschaften zur Behandlung von Parkinsonismus Anwendung finden♦

22.7.1983 - 11 - 62 621/18

Ferner besitzen die neuen Verbindungen eine Prolaktin*· sekretions-hemmende Wirkung· So hemmen sie bei der Ratte die Implantationen nach subkutaner Applikation von Dosen zwischen 0,01 und 1 mg/kg und die Laktation mit Dosen von 1 bis 10 rag/kg p_# o. fLit.: Experientia 34, 1330 (1978)J. Die neuen Substanzen können aufgrund ihrer Prolaktin« sekretions-hemmenden Eigenschaften z. B. zur Laktations*- hemraung, Galaktorrhoehemmung, zur Behandlung des hyperprolaktinaemischen Hypogonadismus und der Akromegalie oder zur Behandlung von Prolaktinomen Anwendung finden· Ferner bewirken die neuen Substanzen am Schlaf/Wachzyklus bei der chronisch implantierten Ratte ab ca« 3 mg/kg i„ p. oder 10 rag/kg ρ_# ο· eine Reduktion der Dauer des paradoxalen Schlafes und eine Verlängerung des Wachzustandes £siehe 0* M_# Vigouret et al·, Pharmacology l&V 1* 156 (1978)}· Überdies bewirken sie bei 0,3 mg/kg i· p· eine Erhöhung des Glukosestoffwechsels in Hirnnervenkernen sensorischer Informationsverarbeitung (Methode nach L· Solokoff, Oournal of Cerebral Blood Flow and Metabolism 1981, 1, 7 - 36;I H* E· Savaki et al.V Brain Research 1982, 233« 347 und D. McCulloch et al., Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism 1981; 1./ 133 - 136).

Aufgrund dieser Resultate sind die neuen Substanzen für die Behandlung der senilen Demenz, insbesondere im Frühstadium und zur Vigilanzerhöhung geeignet.

Außerdem besitzen die erfindungsgemäß hergestellten Verbindungen vasokonstriktorische Aktivität, welche in vitro an Spiralst reifen der Arteria carotis externa des Hundes

22.7*1983 - 12 - . 62 621/18

ζΈ_Φ Müller-Schweinitzer, Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol*, 292^ 113 - 118 (1976)^ rait Dosen ab IO nM/Liter gezeigt werden kann»

Aufgrund ihrer vasokonstriktorischen Wirkung werden die neuen Substanzen zur Behandlung der Migräne verwendet.

Ferner bewirken sie an der Ratte mit zerstörtem Gehirn und Rückenmark £BrIt^ Cf. Phanaac. Chemother. 3£ (1967); 78 « 87j mit einer Dosis von etwa 5 bis etwa 50 jjg/kg i. v* einen langanhaltenden pressorischen Effekt verbunden mit einer Blutdrucksteigerung. An der Mellander-Katze /"Angiologica 3 (1966)* 77 - 99j bewirken sie eine starke, dosisabhängige und langanhaltende Konstriktion der Kapazitätsgefäße in Dosen von etwa 0_r5 bis etwa 50 jpg/kg i. a.

Aufgrund dieser Aktivität können die Substanzen als venentonisierende Mittel Anwendung finden.

Schließlich bewirken die erfindungsgemäß hergestellten Verbindungen aufgrund der Ergebnisse am Schlaf/Wach-Zyklus eine serotoninerge Wirkung. Im Hinblick auf diese Wirkung und die Ergebnisse am Ungerstedt~Modell können sie als Antidepressiva vor allem bei älteren Leuten Anwendung finden.

Ausführunqsbeispiele

In den nachfolgenden Beispielen, die die Erfindung näher erläutern» erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden und sind unkorrigiert.

22*7.1983 - 13 - 62 621/18

Beispiel 1;

gVThia-ergotamin und g'-Thia-ergotaminin

1. Züchtung des Stammes NRRL 12043

Öle Konidien einer Schrägagarkultur des Claviceps purpurea Stammes NRRL 12043 (etwa 10⁹) werden in 10 ml sterilem Wasser suspendiert♦ Mit 1 ml dieser Konidien-Suspension werden 200 ml eines Vorkulturmediums folgender Zusammensetzung

g/Liter

Saccharose 100

Proflo 10

Ammoniumoxalat 3

Ca (NO₃J₂,4 H₂O 1

KH₂PO₄ 0,25

MgSO₄. 7 H₂O 0,25

KCl 0,125

FeSO₄. 7 H₂O 0,0166

ZnSO₄. 7 H₂O 0,0068 destilliertes Wasser ad 1 Liter ,

welches sich in 500-ml-Erlenmeyerkolben befindet, angeimpft; das pH wird mit NH₄OH auf 6,5 eingestellt. Das Medium wird 20 Minuten bei 120 ⁰C sterilisiert. Diese Vorkultur wird bei 24 ⁰C rotierend 5 Tage geschüttelt (180 UpMy 5 cm Kreis) Am Ende des Wachstums hat die Kultur ein pH von 5,3 und ein Myceltrockengewicht von 22 g/L.

22·7·1983 62 621/18

Mit 10 nil der Vorkultur werden 50 ml eines Hauptkultur mediums folgender Zusammensetzung

Saccharose Amiaoniumoxalat Ca (NO₃J₂.4 H₂O MgSO₄. 7 H₂O

KH₂PO₄ KCl

g/Liter MMMlMMMMM

240 9,6 2V5 OV625

FeSO₄· 7 ZnSO

₄.

H₂O H₂O

destilliertes Wasser

0,625 .0,312 0,0252 CE_#0102 1 Liter _t

welches sich in SOO-ml-Erlenmeyerkolben befindet, angeimpft das pH wird mit NH₄0H-25%ig auf 6,2 eingestellt· Das Medium wird 20 Minuten bei 110 ° sterilisiert»

Dies© Kultur wird bei 24 ° auf einer Rundschöttelmaschine (180 UpM, 5 cm Kreis) inkubiert· Nach 4 Tagen Bebrütungszeit werden pro Kultur 90 mg L~Thiazolidin~4~cärbonsäure zugegeben. Die Kulturen werden noch 10 Tage auf der Rundschuttelmaschine inkubiert· Nach beendeter Fermentation werden die Kulturen abfiltriert· Das Mycelium wird schonend getrocknet» Das Trockenraycelgewicht der Hauptkultur beträgt 85 g/L. Der Alkaloidgehalt beträgt 12 mg/g· Der Anteil an 9*-Thia-ergotamin + 9*-Thia-ergotaminin beträgt 10 % des Gesamtalkaloidgehaltes·

22.7,1983 - 15 - 62 621/18

2» Isolierung der Titelverbindungen

500 g Trockenraycel werden zweimal mit je 1600 ml Methanol + 2 % konz. Ammoniak sowie zweimal mit je 1200 ml Methanol während je 5 Minuten mit einem Ultra-Turrax-Gerät homogenisiert und die vereinigten Filtrate im Vakuum bei max. 40 Badteraperatur eingedampft (ca. 50 g weinroter Rückstand). Dieser Rückstand wird in 500 ml Methanol gelöst und in einem Chromatographie-Rohr von 10 cm Durchschnitt durch 500 g Aluminiumoxid der Aktivitätsstufe II (Woelm) filtriert« mit 2000 ml Methanol nachgewaschen und das gesamte Filtrat im Vakuum zur Trockne eingedampft (25 g gelber Schaum). Dieser Ruckstand wird nun an der 200fachen Menge Kieselgel 60 (Merck) in Methylenchlorid + 2 % Methanol chromatographisch aufgetrennt. Die Fraktions-Rückstände werden dünnschichtchromatographisch untersucht und diejenigen Fraktionen, welche nur Substanzflecke entsprechend 9'-Thia-ergotamin enthielten (vgl. Rf-Werte in Tabelle I)* vereinigt.

Die Fraktionen, die nach dünnschichtchromatographischer Analyse und entsprechend ihrem Rf-Wert nur 9,'-Thia-ergotamin enthalten, werden in Essigester gelöst, durch eine Talkschicht blankfiltriert und nach Konzentrierung im Vakuum mit wenig Hexan versetzt, wobei das Alkaloid auskristallisiert» Ümkristallisation aus dem gleichen Lösungsmittel liefert reine Kristalle von weißer bis gelblicher Farbe» Srop.: ab 199 ° langsame Zersetzung; *° = -165 ° (c = 0,5 in Chloroform).

22*7_#1983 - 15 - 62 621/18

180 mg

9*»Thia«-ergotarain werden in wenig Äthanol gelöst und mit einer alkoholischen Lösung, enthaltend 29 rag Methansulfon säure, versetzt» wobei das Alkaloid als Methansulfonat auskristallisiert· (^kristallisation aus Methanol liefert ein reines, weiBes Salz* Smp_#: ab 211 ° Zersetzung; £oO ρ =» + 76 ° (c = 0,51 in Methanol)·

Die Chronsatogrammfraktionen mit dünnscbtahtchromatographisch einheitlichem Fleck und Rf-Wert (siehe Tabelle 1) werden in Essigester gelöst, vereinigt und durch eine Talkschicht klarfiltriert* Die konzentrierte Lösung wird mit wenig Hexan versetzt» wobei das Alkaloid in weißer kristalliner Form ausfällt· Umkristallisation aus dem gleichen Lösungsmittel ergibt die reine Verbindung· Sinp«: ab 199 ° Zersetzung; C«O_D = + 343 ° (c » 0,55 in Chloroform)·

Tabelle 1

Dünnschichtchroraatographische Rf-Werte im Vergleich zu Ergotamin (Et) und Ergotaminin (Et-in),

22.7,1983 62 621/18

Schicht und Fließmittel	Th ia- Et	Et	Thia- Et-in	Et-in
Alox1) Essigester/sec»Butanol 9 : 1	0,44	0,34	0,68	0,59 j
Toluol/iso-Propanol 9:1	0,58	0,50	0,69	0,63
Toluol/iso-Propanol 19 : 1	0,30	0,24	0,58	0,46
Kieselgel2*
Toluolydso-Propanol 85 : 15	0,15	0,11	0,43	0,31
CH2Cl2ZMeOH 93 : 7	0,25	0,22	0,65	0,52

' Aluminiumoxid-Fertigplatten Merck F 254 (Typ E)

2} ' Kieselgel-Fertigplatten Merck F 254,

Auf Dünnschichtplatten erscheinen die Substanzflecke im UV-Licht 254 nm al3 blauviolette und bei 366 nrä als hell blaue Flecke· Auch können sie mit Doddämpfen als-braune Flecke erkannt werden*

Das für die Ergotpeptine typische van Urk-Reagens bewährt sich ausgezeichnet zur Detektion der Substanzflecke. Nach dem Besprühen erscheinen diese Verbindungen mit blauvioletter Farbe, die durch Einwirkung des Tageslichtes oder durch Überströmen mit einem Hauch Königswasserdämpfen intensiviert werden«

22.7.1983 - 18 - 62 621/18

Beispiel 2

9*-Thia-erq oc ids tin und 9**»Thia-erqocristinin

1. Züchtung des Stammes NRRL 12044

Der Stamm NRRL 12044 wird analog zu Beispiel 3 gezüchtet. Das Trockenmycelgewicht der Hauptkultur beträgt 80 g/L_# Der ") Alkaloidgehalt betragt 10 rag/g. Der Anteil an Titelverbindungen beträgt 8 % des Gesamtalkaloidgehaltes«

2* Isolierung der Titelverbindungen

500 g Trockenmycel werden zweimal mit je 1500 ml Methanol + 2 % konz* Ammoniak und zweimal mit je 1500 ml Methanol mit einem Ultraturrax-Gerät je 5 Minuten homogenisiert. Die vereinigten Filtrate werden im Vakuum bei max. 40 ° Badteraperatur eingedampft (190 g weinroter Rückstand). Nach dem Lösen in 900 ml Methanol wird durch eine 10 cm hohe Schicht aus 500 g Aluminiumoxid (basisch» Aktivitätsstufe 2) filtriert,, mit 2000 ml Methanol nachgewaschen und das FiItrat im Vakuum zur Trockne eingedampft. (108 g)„ Dieser Rückstand wird nun in Methanol an 3000 g Sephadex LH-20 aufgetrennt und Fraktionen zu 200 ml aufgefangen und eingedampft. Die Fraktionsrückstände» die dünnschichtchroraatographisch die neuen Thia-ergotpeptide enthielten^ werden vereinigt (526 mg) und nochmals an 120 g Sephadex LH-20 in Methanol chroraatographiert, woraus 156 mg reines Gemisch von 9*-Thia-ergocristin/-cristinin erhalten werden. Die Trennung dieser beiden Verbindungen erfolgte durch be-

22*7.1983 - 19 - 62 621/18

kannte chromatographische Methoden an Kieselgel 60 (Merck) mit Methylenchlorid + 2 % Methanol,

Die Fraktionsrückstände, die nach dünnschichtchromatographischer Analyse und entsprechend ihrem Rf-Wert (vgl· Tabelle 2) nur. 9*-Thia-ergocristin enthalten, werden vereinigt und aus Benzol kristallisiert (28 mg)· Smp»: 146 ° Sinternunter langsamer Zersetzung j £aQg = -176 (c a 0,5 in Chloroform)*

9*-Thia-ergocristinin:

Die Chroraatograramfraktionen, die sich dünnschichtchromato— graphisch einheitlich zeigen und den Substanzfleck mit den entsprechenden Rf-Werten (siehe Tabelle 2) aufweisen, werden vereinigt und aus Äthanol-Essigester kristallisiert« Schmelzpunkt: 209 - 210 ° unter Zersetzung; + 344 ° (c = 0,51 in CHCl₃).

22.7,1983 62 621/'18

Tabelle 2

Dünnschichtchromatographische Rf-Werte im Vergleich zu Ergocristin (Ec) und Ergocristinin (Ec-in)·

Schicht und Fließmittel	Th ia- Ec	Ec	Th ia- Ec-in	Ec-in	-	0s60
Aj AM / Essigester/sec,3utanol 9 : 1	0,68	0,63	0,78	0,70
Toluol/iso-Propanol 9 : 1	0,68	0,62	0,69	0,66
Toluol/iso-Propanol 19 : 1	0^50	0,42	0,58	0,47 j
Kieselgel '				j
Toluol/iso-Propanol	0,37	0,28	0,56	0,43 j
85 : 15
, CH2Cl2/He0H 93 : 7	0,47	0,41	0,70

Aluminiumoxid-Fertigplatten Merck F 254 (Typ e) Kieselgel-Fertigplatten Merck F 254#

Zur Detektion der Substanzflecken siehe Beispiel 1,

Beispiel 3

Analog zu Beispiel 1 oder 2 können auch das 9'-Thia-«£- ergokryptin £Smp,: 203 - 205 ° (Zers*),·

= + 46

22.7.1983 - 21 - 62 621/18

(c s 0,7 in Dimethylformamid)J und das 9*~Thia-flC-ergokryptinin fSrap.: 228 - 230 ° (Zers.); ftf} ^⁰ » + 281 ° (c= 0,8 in Dimethylformamid)J hergestellt werden, indem man einen Ergokryptin/Ergokryptinin produzierenden Stamm verwendet.

Claims (2)

1. 22.7·1983 - 22 - 62 621/18

   Erfindunqsanspruch
2. 1. Verfahren zur Herstellung eines cyclischen 9'-ThiapeptidergotalkaloidsV das von einem ferinentativ herstellbaren 9*-Methylen-peptidergotalkaloid abgeleitet ist_# in Form der freien Base oder eines Säureadditionssalzes, gekennzeichnet dadurch, daß man einer flüssigen Kultur eines die entsprechende 9'-Methylen-Verbindung produzierenden Stammes L-Thiazolidin-4-carbonsäure oder ein Salz dieser Säure zugibt und die erhaltene Verbindung gewünschtenfalls in ein Säureadditionssalz überführt.

   Z₀ Verfahren nach Punkt 1_# gekennzeichnet dadurch» daß man einer flüssigen Kultur eines die entsprechende 9*- Methylen-Verbindung produzierenden Stammes L-Thiazolidin· ^carbonsäure oder ein Salz dieser Säure zugibt und die erhaltene Verbindung der Formel (Ia)

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   worin entweder

   R₁ für Methyl steht und R₂ Isobutyl oder Benzyl bedeutet oder

   R₁ für Äthyl steht und R₂ Benzyl bedeutet
   oder

   R₁ für Isopropyl steht und R« Isopropyl, sek,-Butyl, Zsobutyl oder Benzyl bedeutet*

   gewunschtenfalls in ein Säureadditionssalz überführt«