DD200571A1

DD200571A1 - Verfahren zur herstellung von ergopeptinen mit modifiziertem prolinteil

Info

Publication number: DD200571A1
Application number: DD23197881A
Authority: DD
Inventors: Alfred Baumert; Dieter Erge; Detlef Groeger
Original assignee: Alfred Baumert; Dieter Erge; Detlef Groeger
Priority date: 1981-07-22
Filing date: 1981-07-22
Publication date: 1983-05-18

Abstract

Die Erfindung ist fuer die Medizin und fuer die pharmazeutische Industrie von Bedeutung. Ziel ist es, durch Bereitstellung neuer stabiler Ergopeptine eine Verbesserung bekannter Therapiemoeglichkeiten bzw. eine Ausdehnung auf neue Indikationen zu erreichen. Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, durch gelenkte Fermentation Ergopeptine herzustellen, in denen der Prolinteil des Peptidfragmentes durch ein Analogon dieser Aminosaeure ersetzt ist. Erfindungsgemaesz wird einem submers Ergopeptine bildenden Stamm in der Wachstumsphase des Mycels eine dem Prolin analoge Aminosaeure zugesetzt und der Stamm in Gegenwart dieser Aminosaeure kultiviert; die modifizierten Ergopeptine werden aus dem Naehrmedium isoliert. Beispielsweise werden Ergosin bildende Staemme von Claviceps purpurea verwendet. Zur Herstellung von 1'sz-Methyl-5'Alpha-isobutyl-9'thiaergopeptin (Thiaergosin) wird als dem Prolin analoge Aminosaeure 1,3-Thiazolidin-4-carbonsaeure eingesetzt.

Description

Verfahren zur Herstellung von Ergopeptinen mit modifizier,-tem Prolinteil

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Ergopeptinen mit modifiziertem Prolinteil.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Von den bislang über 50 bekannten natürlichen Mutterkornalkaloiden besitzen die Vertreter der Peptidalkaloide eine große Bedeutung in der inneren Medizin und Gynäkologie, wie etwa Ergotamin und die Vertreter der Brgotoxingruppe (Ergocornin, Ergocristin, Ergokryptin). Ergosin steht dem Ergotamin sehr nahe und unterscheidet sich vom letzteren durch Austausch der Aminosäure Phenylalanin gegen die Aminosäure Leucin in der Peptidseitenkette. Ergosin wirkt gleichfalls uterotoniach sowie vasokonstriktorisch. Das Ergosin und seine 9,10-Dihydroderivate sowie weitere partialsynthetische Derivate können als Mittel gegen Migräne, arterielle Hypertonie sowie periphere Gefäßerkrankungen eingesetzt werden. Thiazolidin-4-oarbonsäure ist ebenfalls eine hochwirksame Verbindung, die mit Erfolg zur Krebsbekämpfung eingesetzt wird.

Die Erfindung ist für die Medizin und die pharmazeutische Industrie von Interesse. Durch eine Kombination der Lysergsäure-Derivate mit der Thiazolidin-4-oarbonsäure sollen neue Therapie- und Indikationsmöglichkeiten erschlossen werden.

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Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Im Peptidteil der Ergopeptine modifizierte Alkaloide sind bekannt und prinzipiell auf zwei Wegen zugänglich. Einmal läßt sioh die Peptidaeitenkette totalsynthetisch aufbauen (J. Rutsohmann u. P.A. Stadler, Handbuch der experimentellen Pharmakologie Bd. 49, S. 29 (1978)). Zum anderen ist es möglich, durch gelenkte Fermentation die Zusammensetzung des Alkaloidgemisches qualitativ zu beeinflussen. Die chemische Synthese von Homologen des Ergotamine (Ersatz des Prolins durch Pipecolinsäure) ist langwierig und führt zu instabilen Präparaten. Eine gelenkte Fermentation durch Zufütterung von cyclolspezifischen Aminosäuren sowie Aminosäure-Analogen, parasitisch und submers, ist wiederholt beschrieben worden. Eingesetzt wurden dafür Claviceps purpurea-Stamme, die Ergotamin oder Ergotoxine bilden bzw. davon erhaltene Aminosäure-auxotrophe Mutanten (BRD-Offenlegungsschrift 28 16 773, Int. Cl²: C 07 D 257/08; H. Kobel u. J.J· Sanglier in "Antibiotics and other secondary metabolites", 5. FEMS-Symposium, Academic Press p. 233 (1978); E. Beacco et al·, Experientia 3£, 1291 (1978); N, Crespi-Perellino, Ebcperientia 32, 217 (1981))· Bisher wurden dem Kulturmedium während der Fermentation solche Aminosäuren bzw. Analoga zugesetzt, die in dem aus drei Aminosäuren bestehenden Peptidteil der Peptidalkaloide die der Lysergsäure benachbarte Aminosäure sowie die zweite Aminosäure ersetzen können.

Durch gelenkte Fermentation hergestellte Ergopeptine mit modifiziertem Prolinteil sind bislang nicht bekannt.

Ziel der Erfindung;

Es ist das Ziel der Erfindung, durch Bereitstellung neuer stabiler Ergopeptine mit modifiziertem Peptidteil eine Verbesserung bekannter Therapiemöglichkeiten bzw. die Erschließung neuer Indikationsstellungen zu erreichen.

- 3 Darstellung des Wesens der Erfindung

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Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Ergopeptine durch gelenkte Fermentation herzustellen, in denen der Prolinteil des Peptidfragmentes durch ein Analogon dieser Aminosäure ersetzt ist.

Erfindungsgemäß wird zur Herstellung von Ergopeptinen mit modifiziertem Prolinteil ein submers Ergopeptine bildender Stamm verwendet, dem in der Wachstumsphase des Mycels eine dem Prolin analoge Aminosäure zugesetzt wird, und der Stamm in Gegenwart dieser Aminosäure kultiviert. Beispielsweise werden Ergosin bildende Stämme eingesetzt, insbesondere der Stamm Claviceps purpurea (Fr.) TuI. IBP 179» seine Mutanten oder Varianten· Dieser Stamm ist beim Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften der DDR in Jena unter der Bezeichnung IMET PA 136 sowie bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen in Göttingen unter der Nummer DSM 1871 hinterlegt. Seine Verwendung zur Herstellung von Ergosin/Ergosinin ist bekannt (vgl. z. B. Europäische Patentanmeldung 0 022 973; Int· Cl³: C 12 P 17/18). Der Stamm ist in der Lage, saprophytisch Ergosin zu bilden, das nahezu frei von Nebenalkaloiden ist, und zeichnet sich durch Stabilität, gute Fermentationseigenschaften und hohe Alkaloidproduktion aus, wobei 95 % der gebildeten Alkaloide in die umgebende Nährlösung ausgeschieden werden. Ein anderes Beispiel für einen Stamm, der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden kann, ist Claviceps purpurea (Fr.) TuI. MUT 168. Er ist beim Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften der DDR in Jena unter der Bezeichnung IMET PA 134 hinterlegt. Auoh er produziert, wie auch seine Mutanten oder Varianten, in sübmerser Kultur Ergosin/Ergosinin (vgl. DDR-Patentschrift 129 801, Int. Cl²: C 12 D 13/02).

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Pur die Herstellung des Ergosin analogen Alkaloids mit modifiziertem Prolinteil erfolgt die aerobe Fermentation des Filzes zweckmäßigerweise in flüssigem Nährmedium in submerser Kultur. Die Nährmedien enthalten eine assimilierbare C-Quelle, wie z. B. Saccharose, Glucose, Mannit, Sorbit, Glycerin, Zitronen- oder Bernsteinsäure, eine assimilierbare N-Quelle, wie beispielsweise Ammoniak, Asparagin, Pepton, Caseinhydrolysat oder ein Ammoniumsalz, sowie Mineralsalze·

Die Kultivation erfolgt beispielsweise im Schüttelkolben oder im Fermenter, sie wird ein- bis dreistufig durchgeführt. Es ist vorteilhaft, wenn die Vorkultur 4 - 14 Tage alt ist und das Impfverhältnis Vor- : Hauptkultur 1 : 5 bis 1 : 20 beträgt. Die Dauer der Haupt kultur beträgt 7-18 Tage. Der pH-Wert kann zwischen 4»0 und 6,2, die Temperatur zwischen 20 und 30 ⁰C liegen. Vorteilhaft ist die Fermentation bei 22 - 25 '⁰C und pH 5,2 - 5,9.

Die dem Prolin analoge Aminosäure wird dem Kulturmedium in einer Konzentration von 1-10 g/l, vorzugsweise 3-6 g/l Nährlösung in der Wachstumsphase des Myceis zugesetzt, das ist im allgemeinen am 1. - 5· Tag der Hauptkultur. Geeignete Aminosäuren sind insbesondere 1,3-Thiazolidin-4-carbonsäure, 3,4-Dehydroprolin und 4-Hydroxyprolin. Beispielsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der neuen Verbindung 2^lß-Methyl-5'cC-isobutyl-9'-thiaergopeptin ("Thiaergosin") verwendet.

Zur Feststellung des geeigneten Zeitpunktes zur Beendigung der Umsetzung wird einerseits die Alkaloidkonzentration spektrophotometrisch nach Färbung mit van Urk's Reagenz bei 560 nm bestimmt und andererseits das Verhältnis zwischen unmodifizierten und modifizierten Alkaloiden nach dünnschichtchromatographischer Auftrennung, Elution und Anfärbung ermittelt. Im allgemeinen beendet man die Umsetzung nach einer Gesamtkulturdauer von 14 - 25 Tagen.

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Das Mycel wird nach Abtrennung der Nährlösung verworfen· Diese wird mit Ammoniak oder Natriumhydroxid bis pH 9-10 alkalisch gemacht und mit geeigneten organischen Lösungsmitteln, vorzugsweise chlorierten Kohlenwasserstoffen, extrahiert. Die organische Phase wird eingeengt und das Alkaloidgemisch chromatographisch in die einzelnen Komponenten zerlegt. Die Identifizierung der einzelnen Alkaloide erfolgt nach den üblichen Analysenverfahren (UV, IR, MS, NMR).

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht erstmals die Herstellung stabiler Brgopeptine mit modifiziertem Prolinteil durch gelenkte Fermentation und damit die Verbesserung bekannter Therapiemöglichkeiten bzw. die Erschließung neuer Indikationsstellungen. Die neue Verbindung ThIaergosin wirkt blockierend auf of-Rezeptoren und beeinflußt die chronisch arteriellen peripheren Durchblutungsstörungen.

Ausführun^sbeispiele

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern. Die verwendeten Nährmedien sind in Tab. 1 zusammengestellt.

Beispiel 1;

Ausgehend von Konserven des Stammes Claviceps purpurea

(Fr.) TuI. IBP 179 werden Vorkülturen von 100 ml Medium NL 849 in 500 ml-Schüttelkolben beimpft. Die Kolben wer- . den 7 Tage bei 24 ⁰C ± 1 ⁰C bei 240 UpM bebrütet. 10 500 ml-Kolben, die je 100 ml des Mediums NL 720 enthalten, werden mit je 10 ml der Vorkultur beimpft. Nach 1 Tag Fermentation werden den Kolben 5 g/l L-1_t3-Thiazolidin-4-carbonsäure zugesetzt. Nach weiteren 10 Tagen Bebrütung werden die Kulturen abgeerntet und die Nährlösung aufgearbeitet. Aus 1 1 Kulturmedium werden 250 mg Peptidalka-

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loidgemisch erhalten, welches zu 75 % aus Ergosin/Ergosinin und 25 % Thiaergosin/Thiaergosinin besteht.

Beispiel 2:

10 500 ml-Kolben, die je 100 ml Nährlösung NL 833 enthalten, werden mit 10 ml der im Beispiel 1 genannten Vorkultur beimpft. Am 2. Tag der Fermentation werden den . Kolben 5 g/l L-1 ^-Thiazolidin^-carbonsäure zugesetzt. Am 14. Tag der Fermentation werden die Kolben unter den in Beispiel 1 genannten Bedingungen aufgearbeitet. Die Nährlösung enthält 400 mg/1 eines Peptidalkaloidgemisches.

Beispiel 3:

Zur qualitativen Bestimmung der Alkaloide werden 10 ml der Nährlösung alkalisiert und mit Chloroform extrahiert. Der Extrakt wird auf 5 ml eingeengt und aliquote Teile .durch Schichtchromatographie getrennt.

Lösungsmittelsysteme:

I Chloroform : Methanol (9:1)

II Chloroform : Methanol : Eisessig (80 : 15 : 5) III Ethylacetat : Methanol (95 : 5)

Rp-Werte in System I, II, III entsprechends Ergosin: 0,45; 0,52, 0,22. Thiaergosin: 0,51;, 0,54; 0,44. Ergosinin: 0,76, 0,66; 0,59. Thiaergosinin: 0,85; 0,77; 0,69. Thiaergosin und Thiaergosinin können ineinander umgewandelt werden. Sie zeigen im UV-Licht eine starke Fluorescenz und geben mit van ürk*s Reagenz eine tiefblaue Färbung·

Die nach SchichtChromatographie an Kieselgel getrennten Zonen werden ausgeschabt, extrahiert und anschließend mit van Urk's Reagenz versetzt. Nach Zentrifugation wird eine

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gefärbte Lösung erhalten, die in der üblichen Weise kolorimetrisch bestimmt wird. In 1 ml des nach Beispiel 2 erhaltenen Kulturfiltrats konnten 300 /Ug Ergosin/Ergosinin und 100 /Ug Thiaergosin/Thlaergosinin ermittelt werden.

Zur Identifizierung wird das Rohalkaloidgemisch von 1 1 Kulturfiltrat durch wiederholte SchichtChromatographie an Kieselgel unter Verwendung der Lösungsmittelsysteme I, II, III aufgetrennt. Vom 2^lß-Methyl-5^foT-isobutyl-9'-thiaergopeptin (Thiaergosin) konnten 50 mg erhalten werden. Die Keller'sehe und van Urk'sche Reaktion waren positiv, und die Verbindung zeigte die für Lysergsäure typische. UV-Absorption: UV??°^H 240, 312 nm und ein Minimum bei 270 nm. Die alkalische Hydrolyse ergab Lysergsäure und Pyruvat. Im Massenspektrum wurden folgende charakteristischen Fragmente erhalten: m/e kein M⁺-Peak, 298 (Cyclolgruppe); 267 (Lysergsäureamid)j 228 (Lactam); 221; 207; 196; 185; 180; 172; 164; 154; 88.

Die Schwefel enthaltenden Schlüsselfragmente des Peptidteils unterscheiden sich von den entsprechenden Peaks des Ergosine um 18 Masse-Einheiten: m/e 298 (C^H^gNgO^S, gef.: 298.0981, ber.: 298.0973); 228 (C₁₀H₁₆N₂O₂S, gef.: 228.0923, ber.: 222.0918); 185 (C₇H₉N₃O₂S, gef.: 185.0386, ber.: 185.0388); 172 (CgHgN^S, gef.: 172.0307, ber.: 172.0301); ferner m/e 88 verglichen mit m/e 70 im Ergosin.

... 231978 8

Tabelle 1: Zusammensetzung der verwendeten Nährlösungen Angaben in g/l

	NL 849	NL 720	15,0	NL 833	20,0
Saccharose	300,0	200,0	1,0	300,0	1,0
Magermilch	100 ml	-	0,25	-	0,25
Ammoniumeitrat	10,0	0,3	0,3
Ca(NOo)₂		0,010	0,010
KH₂PO₄	0,25	0,0308	0,0308
MgSO₄ . 7 H₂O	0,3	0,1	r -.
PeSO₄ . 7 H₂O		1000,0	1000,0
ZnSO₄ . 7 H₂O
KCl	- -	5,8-6,0	5,4
Aqua dest ad·	1000,0	NaOH	NaOH
pH vor dem		einheitlich	30 min 110 ⁰C
Sterilisieren	5,4
pH Einstellung mit	NaOH
Autoklavieren	Jeweils

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CH₃ OH

H CO-NH c

CH₃

CH.

2¹ p-Methyl-5'oC-isobutyl 9'-thiaergopeptine

99.1111

Claims

-&- 231978

Erfind ungsana pruch

.1. Verfahren zur Herstellung von Ergopeptinen mit modifiziertem Prolinteil, dadurch gekennzeichnet, daß man einen submers Ergopeptine bildenden Stamm verwendet, dem in der Wachstumsphase des Mycels eine dem Prolin analoge Aminosäure zugesetzt wird, den Stamm in Gegenwart dieser Aminosäure kultiviert und die modifizierten Ergopeptine aus dem Nährmedium isoliert.
2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die dem Prolin analoge Aminosäure in einer Konzentration von 1-10 g/l Nährlösung zugesetzt wird.
3. Verfahren nach Punkt 2, dadurch gekennzeichnet, daß die dem Prolin analoge Aminosäure in einer Konzentration von 3-6 g/l Nährlösung zugesetzt wird.
4. Verfahren nach Punkt 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß als dem Prolin analoge Aminosäure 1,3-Thiazolidin-4-carbonsäure eingesetzt wird.
5. Verfahren nach Punkt 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß ein submers Ergosin bildender Stamm verwendet wird.
6. Verfahren nach Punkt 5, dadurch gekennzeichnet, daß man den Stamm Claviceps purpurea (Pr.) TuI. IBP 179, seine Mutanten oder Varianten, verwendet.
7. Verfahren nach Punkt 5,dadurok gekennzeichnet, daß man den Stamm Claviceps purpurea (Pr.) TuI. MUT 168, seine Mutanten oder Varianten, verwendet.
8. Verfahren nach Punkt 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß man den Stamm in aerober Fermentation in einem flüssigen Nährmedium, welches eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, eine assimilierbare Stickstoffquelle und Mineralsalze enthält, in submerser Kultivation bei einer

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Temperatur von 20 - 30 ⁰C und einem pH-Wert von 4»0-6,2 kultiviert, am 1.. - 5· Tag der Hauptkultur eine dem Prolin analoge Aminosäure zusetzt, in Gegenwart dieser Aminosäure weitere 7-18 Tage kultiviert und die modifizierten Ergopeptine aus dem Nährmedium isoliert·
9. Verfahren nach Punkt 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentation bei 22 - 25 ⁰C und pH 5,2 - 5,9 durchgeführt wird.
10. Verfahren nach Punkt 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß Thiaergosin hergestellt wird.

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