DE2440931C2

DE2440931C2 - Verfahren zur N-Demethylierung von Indolalkaloiden durch Streptomyces albogriseolus

Info

Publication number: DE2440931C2
Application number: DE2440931A
Authority: DE
Inventors: Donald Ray Pittsboro Ind. Brannon; Norbert Indianapolis Ind. Neuss
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1973-09-19
Filing date: 1974-08-27
Publication date: 1986-03-13
Also published as: US4082754A; BE819078A; IE39605B1; US3989593A; CA1023289A; GB1483292A; ZA744485B; FR2243996A1; DE2440931A1; FR2243996B1; IL45283A; IL45283A0; AU7126274A; HU167750B

Description

bedeutet, mit Streptomyces albogriseolus NRRL 5748 in eine N-demethylierte Verbindung umwandelt, in der R für Wasserstoff steht und R' die oben angegebene Bedeutung hat.

i t

si

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Demethylierung von Vindolin und Vinbiastin durch submerse Fermentation mit Streptomyces albogriseolus.

Verschiedene natürlich vorkommende dimere Alkaloide, die sich aus Vinca rosea erhalten lassen, sind wirksam zur Behandlung experimentell hervorgerufener Erkrankungen bei Tieren. Hierzu gehören Leurosin, Vincaleukoblastin (Vinbiastin oder VLB), Leurosidin (Vinrosidin) und Leurocristin (VCR oder Vincristin). Zwei dieser Alkaloide, nämlich VLB und Vincristin, befinden sich nun als Heilmittel zur Behandlung von Erkrankungen, insbesondere Leukämien und damit verwandten Erkrankungen beim Menschen, auf dem Markt. Vinbiastin und Vincristin lassen sich durch die folgende Formel I angeben, der sich ebenfalls das übliche Numerierungssystem für die dimeren Indolalkaloide entnehmen läßt.

ir

CH₃-O

-CH₂-CH₃ Q-C-CH₃

Falls der Substituent R in obiger Formel I fur Methyl steht, dann handelt es sich bei dieser Verbindung um Vinblastin, falls der Substituent R. Formyl bedeutet, dann ist die Verbindung Vincristin.

Bei den Verbindungen der Formel I wird das untere Ringsystem normalerweise als der Vindolinteil bezeichnet, da Vinblastin ein in Stellung 15 substituiertes Vindolin ist und Vincristin ein in Stellung 15 substituiertes Derivat eines modifizierten (eher in Stellung 1 formylierten als in Stellung 1 methylierten) Vindolins ist. N-Desmethylvinblastin (l-Desmethylvinblastin) oder Desformylvincristin ist ferner ein in Stellung 15 substituiertes modifiziertes Viidolin. In Stellung 15 substituierte Vindoline werden hergestellt, indem man Vindolin mit verschiedenen Indolderivaten, wie P~rivinol, 18-Hydroxydihydrocleavamin, 18-Hydroxyibogamin oder Vobasinol, umsetzt.

Die Fermentation von Vindolin rut Streptomyces albogriseolus zur Herstellung anderer Metaboliten wurde von Mallet et al. in den Abstracts der 151. Tagung der American Chemical Society (1967) in Pittsburgh, Pa. berichtet.

N-DesmethyI-(l-Desmethyl)-vindolin wurde bisher nicht beschrieben.

Erfindungsgemäß wird nun ein Verfahren zur N-Demethylierung von Indolalkaloiden mit Streptomyces albogriseolus in einer submersen Fermentation und Abtrennen derN-demethylierten Verbindung aus dem Fermentationsmedium geschaffen, das darin besteht, daß man eine Verbindung der Formel II

--CH₂-CH₃ 0-C-CH₃

Il

OH O C-O-CH₃

Il ο

worin R für Methyl steht und R' Wasserstoff oder den Rest

OH
[-CH₂-CH₃

C-O-CH₃

bedeutet, mit Streptomyces albogriseolus NRRL 5748 in eine N-demethylierte Verbindung gemäß obiger Formel Il umwandelt, in der R Tür Wasserstoff steht und R' die oben angegebene Bedeutung besitzt.

15

20

25

30

35

40

(Π) 45

50

55

60

65

Der Organismus Streptomyces albogriseolus NRRL 5748 ist beim Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois, unter der angegebenen Nummer hinterlegt. Er ist im übrigen in Antibiotics and Chemotherapy, 4, 653-6 (1954) und in Int. J. Syst. Bact., 18, 279-392 (1968) erschöpfend beschrieben.

Falls bei der obigen Formel II der Substituent R' Wasserstoff bedeutet, dann bezeichnet man diese Verbins dung als Vindolin, und falls der Substituent R' den komplexen Indolrest (ein Cleavaminderivat) darstellt, dann wird diese Verbindung als Vinblastin bezeichnet.

Zur Durchführung der erfindungsgemäßen neuen Fermentation beimpft man ein vegetatives Maismaische-Soja-Medium mit einer Kultur von Streptomyces albogriseolus NRRL 5748 und inkubiert das Ganze dann auf einem Rotationsschüttler 2 bis 3 Tage bei 30⁰C. Am Ende dieser Zeit wird ein 8-prozentiges Inokulum der KuI-tür auf eine Reihe von Flaschen übertragen, die ein Pepton-Amin-Medium enthalten, und man läßt die Kultur in diesem Medium auf einem Rotationsschüttler etwa 24 Stunden bei 30°C wachsen. Zu diesem Zeitpunkt versetzt man das Kulturmedium mit Vindolin oder Vinblastin, und zwar normalerweise in Form einer 1 : 1 Aceton : Wasser-Lösung, die etwa 50 mg des Alkaloids auf je 2 ml Lösungsmittel enthält. Jeder Kolben enthält etwa 150 ml Medium, und das Alkaloid wird so zugegeben, daß sich 50 mg pro 150 ml Medium ergeben. Die Fermentation wird 5 bis 6 Tage unter Schütteln bei etwa 30⁰C durchgeführt. Das Ernten der Kultur erfolgt durch Ansäuern, Filtrieren, Basischstellen auf einen pH-Wert zwischen 9 und 10 und anschließendes Extrahieren des Alkaloidmaterials, das in dem alkalischen Medium unlöslich ist, mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, wie Methylendichlorid. Das durch Eindampfen des Extraktionsmittels zurückbleibende Alkaloidmaterial wird dann durch Gradienten-pH-Trennverfahren, durch Hochdruckchromatographie über Aluminiumoxid oder durch sonstige, zum Trennen eng verwandter Indolalkaloide übliche Verfahren abgetrennt. Andere Produkte, die bei der Fermentation mit Streptomyces aibogriseolus unter Verwendung von Vindolin als Substrat gebildet werden, sind in Mallet et al. (loc. cit.) beschrieben.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Des-N-methylvindolin

Streptomyces albogriseolus NRRL 5748 läßt man auf Maismaische-Soja-Schrägagar (CSS XII) wachsen, der folgende Zusammensetzung hat: 15 g Cerelose, 15 g Sojabohnenmehl (Nährsojaschnitzel), 8 ml Maismaischefeststoffe, 5 g Natriumchlorid, 2 g Calciumcarbonut, Leitungswasser auf 1 Liter aufgefüllt. Der pH-Wert des Mediums wird auf 6,0 eingestellt, und das Medium sterilisiert man durch 25 Minuten langes Behandeln im Autoklaven. Der auf diese Weise gewachsene Streptomyce albogriseolus wird von den CSS Xll-Schrägen auf ein vegetatives Medium übertragen, das 100 ml CSS XII Medium je 500 ml Kolben enthält. Die vegetative Kultur wird unter Schütteln auf einem Rotationsschüttler mit einer Geschwindigkeit von etwa 250 Umdrehungen pro Minute bei 30⁰C inkubiert. Nach 72 Stunden überträgt man ein 8-prozentiges Inokulum von so hergestelltem S. albogriseolus in 500 ml fassende Erlenmeyerkolben, die jeweils 150 ml PNZ-Medium enthalten, das wie folgt zusammengesetzt ist: 25 g Cerelose, 10 g lösliche Stärke, 40 g Pepton, 4 g NZ-Amin-A, 5 g MgSO₄ · 7 H₂0,5 g Melasse, 2 g Calciumcarbonat, Leitungswasser auf 1 Liter aufgefüllt. Der pH-Wert dieses Mediums wird auf 7,6 eingestellt, und das Medium behandelt man vor der Verwendung 25 Minuten im Autoklaven. Das mit PNZ inokulierte Medium wird bei 30⁰C auf einem Rotationsschüttler bei 250 Umdrehungen pro Minute inkubiert. Nach 24 Stunden langem Wachsen setzt man Vindolin in einer Menge von 50 mg pro Flasche als Lösung in 2 ml eines 1 : 1-Gemisches aus Aceton und Wasser zu. Die Fermentation wird 5 Tage fortgeführt, und am Ende dieser Zeit erfolgt die Ernte durch Einstellen des pH-Wertes des Mediums auf 3,4 und anschließendes Filtrieren. Der pH-Wert des Mediums wird dann atf einen pH-Wert zwischen 9 und 10 eingestellt, und die basenunlöslichen Materialien, hauptsächlich Vindolin und Vindolinfermentationsprodukte, werden hieraus mit Methylendichlorid extrahiert. Der Methylendichloridextrakt wird getrocknet, und das Methylendichlorid entfernt man hiervon im Vakuum. Die zurückbleibenden Alkaloide werden dann wie folgt weiter gereinigt: 2 g Alkaloidextrakts werden in Benzol gelöst, und die Benzollösung Chromatographie« man über 100 g Siliciumdioxid in einer 3,2 cm Säule.

Das Chromatogramm wird mit 1,5 Liter Benzol, 2 Liter eines Gemisches üus Benzol und Äthylacetat (95 : 5), 400 m!. eines Gemisches aus Benzol und Äthylacetat (3 : 1) und schließlich 1 Liter eines Lösungsmittels aus Benzol und Äthylacetat (1:1) entwickelt. Eine weitere Elution mit einem Liter des letzten Lösungsmittelgemisches ergibt vier Fraktionen, die insgesamt 95 mg Des-N-methylvindolin enthalten, das bei etwa 102 bis 104⁰C schmilzt. Das Produkt hat eine typische NH-Bande bei 3420 cm"', die beim Vindolin selbst nicht verhander;· ist.

Das NMR-Spektrum ist durch ein Fehlen von N-CH_rProtonen bei delta 2,68 ppm. und das Auftreten zweier neuer Peaks bei delta 4,50 ppm (NH Doublet) sowie delta 4,15 ppm (C-2 Protondoublet) gekennzeichnet. Der Rest des NMR-Spektrums ist wie erwartet und ähnelt im Aussehen und in chemischen Verschiebungen dem Vindolinspektrum. Die Struktur der Verbindung wurde ferner durch Mass< .!spektroskopie bestätigt, die das vorhergesagte Molekulargewicht und ein Muster für die Molekularbruchstücke ergab, welche für Verbindungen dieser Art typisch sind.

Beispiel 2
Des-N-methylvinblastin

Die Fermentation wird in ähnlicher Weise wie bei Beispiel 1 durchgeführt, wobei man anstelle von Vindolin jedoch Vinblastin in einer Menge von 50 mg pro 150 ml PNZ-Medium zusetzt, und die Fermentation anstelle von 5 Tagen über eine Zeitspanne von 6 Tagen laufen läßt. Am Ende der Fermentation säuert man 3 Liter Fer-

mentalionsbrühc mit 10-prozentiger wäßriger Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von 4,6 an. Die saure Brühe wird filtriert und dann zweimal mitje einem Liter Methylendichlorid extrahiert. Die Methylendichloridextrakte werden vereinigt und getrocknet, und nach Entfernen des Methylendichlorids durch Eindampfen im Vakuum erhält man einen Rückstand von etwa 537 mg. Der Rückstand wird einem pH-Gradientenextraktionsverfahren unterworfen, indem man ihn in 50 ml einer 0,1 m Zitronensäure bei pH 2,3 löst. Die so erhaltene Lösung extrahiert man zweimal mitje 25 ml Methylendichlorid, und die Methylendichloridextrakte werden vereinigt. Der pH-Wert der Lösung wird hierauf auf pH 3,0 angehoben, worauf man die Extraktion wiederholt und in gleicher Weise bis zu pH 5,0 hinauf verfährt. Die Ergebnisse dieses pH-Gradienten-Extraktionsverfahrens sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt:

Tabelle

pH Rückstand in mg

230 87 60

A.	2,3
B.	3.0
C.	3,5
D.	4,0
E.	4,5
F.	5,0

25 12 9

Die Fraktionen »D« und »E« enthalten Des-N-methylvinblastin, was sowohl durch zweidimensionale Dünnschichtchromatographie als auch durch HochdruckflüssigchromatG^i'aphie über Aluminiumoxid festgestellt wurde. Das dabei erhaltene Des-N-methylvinblastin verhält sich identisch wie authentisches Des-N-meihylvinblastin, das nach dem in US-PS 33 54 163 beschriebenen Verfahren hergestellt wurde. Des-N-methylvinblastin läßt sich aus dem gemischten Alkaloidfermentationsprodukt ferner durch Chromatographie herstellen, insbesondere durcn Hochdruckflüssigchromatographie.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur N-Demethylierung von Indolalkaloiden mit Streptomyces albogriseolus in einer submersen Fermentation und Abtrennen derN-demethylierten Verbindung aus dem Fermentationsmedium, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung mit der Formel

^--CH₂-CH₃
O —C-CH₃

Il

OH O C-O-CH₃

Il ο

worin R für Methyl steht und R' Wasserstoff oder

OH 1--CH₂-CH₃

C-O-CH₃