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Herstellung und Gewinnung eines Antibioticums Die Erfindung betrifft
ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibioticums, das im folgenden beschrieben
und charakterisiert wird.
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Dieses neue Antibioticum wurde vorläufig bis zur Wahl eines anderen
Namens als »A228« bezeichnet und diese Bezeichnung wird im folgenden beibehalten.
A228 wird durch aerobe Züchtung eines neuerdings entdeckten Pilzes der Art Streptomyces
gebildet. Dieser Pilz wurde aus einer Erde von der Sierra Leone isoliert und der
Stamm mit »Ds4ic, bezeichnet. Eine Kultur des lebenden Organismus Dsq1 wird demnächst
in der National Culture Type Collection (NCTC) bei den Central Public Health Laboratories,
Colindale Avenue, London N. W. g, hinterlegt werden. Die Erfindung wird im weiteren
unter den folgenden Gesichtspunkten beschrieben: r. Die Charakteristika und Eigenschaften
von A228. 2. Die Charakteristika des Organismus Ds q1. 3. Die Züchtung von Ds¢i.
q.. Die Isolierung und Reinigung von A228.
a. Die Charakteristika und Eigenschaften
von A228 Es wird angenommen, wie im einzelnen weiter unten beschrieben werden soll,
daB A228, wie es von Ds4z erzeugt wird, eine Mischung aus zwei ganz ähnlichen Verbindungen
darstellt, die als A228a und A228b bezeichnet wurden. Beide Substanzen haben nahezu
identische chemische, physikalische und mikrobiologische
Eigenschaften.
Bis jetzt war es möglich, zwischen diesen beiden Verbindungen dadurch zu unterscheiden,
daß A228a bei gegenläufigen Phasentrennungschromatogrammen, wie weiter unten beschrieben
wird, etwas schneller läuft als A228b.
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A228 a und A 228b sind im wesentlichen neutrale Substanzen.
Die Elementaranalyse hat für beide Verbindungen Werte von etwa 6o °/oKohlenstoff,
801, Wasserstoff, 2,0/, Stickstoff und 404 Schwefel und Abwesenheit von Halogenen
ergeben. Beide Verbindungen sind in alkoholischen Lösungsmitteln leicht löslich,
z. B. in Äthanol, Methanol; Butanol, aber weniger leicht löslich -in Wasser. Sie
lösen sich in Chloroform, doch wird die antibiotische Wirksamkeit in diesem Lösungsmittel
rasch zerstört.
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In wasserfreiem Aceton, Diäthyläther, Äthylacetat und Petroläther
sind sie unlöslich. Sowohl gereinigte als auch rohe antibiotische Fraktionen sind
in fester Form beständig. Wäßrige .Lösungen sind unter der Voraussetzung, daß sie
kalt aufbewahrt werden, ebenfalls beständig. Im Dunkeln nimmt die antibiotische
Wirksamkeit wäßrigerLösungenbeiZimmertemperatur nur sehr langsam ab, doch wird die
Geschwindigkeit dieser Abnahme in hellem Licht bedeutend erhöht. So trat in sieben
Tagen bei a8° in hellem Tageslicht Ioo°/oiger Aktivitätsverlust ein, wohingegen
eine identische Probe im Dunkeln nach dieser Zeit bei derselben Temperatur noch
72 % ihrer Aktivität besaß. Alkoholische Lösungen sind anscheinend beständiger als
wäßrige Lösungen. -Wäßrige Lösungen der Antibiotica A 228a und A228b zeigen identische
antibiotische Spektren und sehr ähnliche Eigenschaften bezüglich ihrer Absorptionsspektren.
So wurden im ultravioletten Gebiet folgende Daten bei Absorptionsspektren erhalten:
| A228a bei 80o Einheiten/mg |
| Amax 291mu 304mß 318111,u 332m@u 35omY |
| E 150 265 475 700 695, |
| A228b bei iioo Einheiten/mg |
| Amax 291mu 304mu 318m,u 332m/u 35omß |
| E IL 16o 290 520 805 785- |
Die Ultraviolett-Absorptionsspektren von A228a und A--28b sind in der Zeichnung
wiedergegeben, in der Fig. x das Ultraviolettspektrum von A228a in wäßrigem Alkohol
zeigt, wobei die Reinheit des verwendeten festen Antibioticums 80o Einheiten/mg
betrug, -Fig.2 das Ultraviolettspektrum von A228b in wäBrigem Alkohol zeigt, wobei
die Reinheit des verwendeten festen Antibioticums iioo Einheiten/mg betrug.
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Im Infrarotgebiet weisen* beide antibiotischen Substanzen dieselbe
Absorption. auf; nämlich eine allgemeine Absorption zwischen 160o und
1700 cm-, die charakteristische Absorption einer konjugierten ungesättigten
Bindung (I724 und 171o cm-1) und eine - OH-Absorption (340o bis 3500 cm-1).
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Wäßrige Lösungen der Antibiotica zeigen in ultraviolettem Licht ausgeprägte
gelblichblaue Fluoreszenz. Beim Vermischen der Antibiotica mit Bromwasser wird die
Bromlösung entfärbt und ein schwach gelber oder weißer Niederschlag gebildet. Zugabe
von konzentrierter Schwefelsäure zu den antibiotischen Substanzen oder zu ihren
.konzentrierten Lösungen bewirkt eine charakteristische dunkelviolette Färbung.
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Mikrobiologische Untersuchung und Eigenschaften A 228a und-
A 228b -werden zweckmäßig mittels der Agarplattenmethode untersucht, wobei
Saccharomyces cerevisiae NCTC 4614 als Testorganismus verwendet wird. Bei der verwendeten
Methode wurden Untersuchungsplatten durch Beimpfen von 2°/oigem Glucosenähragar
mit i % einer 48stündigen Kulturflüssigkeit des Testorganismus hergestellt.
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Ein Präparat der gemischten Antibiotica A228a und A 228b, wurde mit
500 Einheiten/mg als Standard herangezogen. Über einen Bereich von
25 bis 250 Ein= heiten/ml wird eine lineare Dosis-Wirkung-Kurve erhalten.
Alle im folgenden angegebenen Titer sind auf diesen Standard bezogen.
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Die folgende Tabelle zeigt das mikrobiologische Spektrum von A228a
und A?,--8b (einzeln oder im Gemisch), soweit es untersucht wurde.
| Mikrobiologisches Spektrum der gemischten A228-Antibiotica |
| Inhibierende Konzentration |
| Organismus in Einheiten/ml |
| 48 Stunden 72 Stunde |
| Saccharomyces cerevisiae NCTC 46I4. . . . . . . . . . . . .
. . . 3,0 3,0 |
| Saccharomyces pastorianus .................. , ... C185 3,0
3,0 |
| Torulopsis utilis maj. ............................. C41 3,0
3,0 |
| Rhodotorula gracilis .............................. C309 1,5
1,5 |
| Rhodotorula glutinis ..................... ...... C307 3,0
3,0 |
| Bierhefe ....................... ............... 1,5 1,5 |
| Ungarische Weinhefe ...... ..................... C53
0,75 1,5 |
| Kalifornische Weinhefe .. . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . C54 3,0 3,0 |
| Candida albicans ................................. C287 6,o
12,0 |
| Trichophyton mentagrophytes ..................... D278 6,o
12,0 |
| Trichophyton mentagrophytes ......... ............ D279
6,0 24,0 |
| Trichophyton interdigitalis . .................... D232
12,0 I2,0 |
| Mikrobiologisches Spektrum. der gemischten A228-Antibiotica |
| Inhibirende Konzentration |
| Organismus in Einheiten/ml |
| 48 Stunden 72 Stunden |
| Trichophyton interdigitalis ........................ D234 3,0
24,0 |
| Epidermophyton floccosum . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . D513 - 12,0 |
| Altemaria solani ................................. C332 3,0
3,0 |
| Aspergillus niger . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . C 116 3,0 12,0 |
| Aspergillus terreus ................................ C412 6,o
12,0 |
| Eremothecium ashbyü ........................... C337 1,5 3,0 |
| Fusarium culmorum ............ . ............... C331 1,5 3,0 |
| Fusarium vasinfectum ............................ C320 1,5
6,o |
| Mucor racemosus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . C 142 1,5 6,o |
| Penicillium chrysogenum........................... PM2
3,0 3,0 |
| Penicillium patulum ... ........................ C311 1,5 3,0 |
| Streptomyces aureofaciens ... ..... . .... . ... . .......
C241 - > 190,0 |
| Streptomyces fradiae . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . C 278 - > 190,0 |
| Streptomyces griseus(K)........................... -
> igo,o |
| Mycobacterium phlei .......... ........ ... ....... C285 -
> igo,o |
| Staphylococcus aureus ............................ C186 >tgo,o
> igo,o |
| Escherichia coli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . _ . . C125 > igo,o > I90,0 . |
Serienweise zweifache Verdünnungen in 2°/oiger Glucosebrühe. Bebrütet wurde bei
28°.
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Die mit »C« versehenen Zahlen beziehen sich auf die Kulturensammlung
der Glaxo Laboratories Limited. Die mit »D« versehenen Zahlen beziehen sich auf
die Kulturensammlung der London School of Hygiene and Tropical Medicine. .
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Die A228-Antibiotica wirken in vitro auch bei gewissen Protozoen inhibierend.
| Organismus |
| Versuchsmedium Male inhibierende |
| Konzentration |
| Endamoeba histolytica Feste Phase: Leberinfusions-
30 bis 6o Einheiten/ml*) |
| Trypton-Agar. |
| Flüssige Phase: Verdünntes |
| Pferdeserum -j- reine Kul- |
| tur. ' |
| Escherichia coli. |
| Trichomonas Vaginalis Bakterienfreie Kultur in 7,5 bis 15 Einheiten/ml |
| Pferdeserum/Glucosebrühe. |
| Zur flüssigen Phase zugefügte Konzentration |
Es wird ersichtlich, daß die gemischten A228-Antibiotica bei einem großen Bereich
von Fungi inhibierend wirken. Prüfungen mit Saccharomyces cerevisae NCTC 4614, Aspergillus
riiger C 116 und Trichophyton mentaprophytes D 279 zeigen hinsichtlich der Wirksamkeit
der Antibiotica A228a und A228b keine Unterschiede.
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Toxitätsuntersuchungen Die Toxitätsuntersuchungen wurden durchgeführt,
indem Mäusen wäßrige Lösungen mit einer antibiotischen Fraktion A 228/A,
die 38o Einheiten/mg aufwies, intraperitoneal injiziert wurden. Eine von drei Mäusen
blieb nach einer Injektion in Höhe von 83 mg/kg Körpergewicht am Leben. Bei Injektion
mit 41,5 mglkg Körpergewicht blieben alle Mäuse am. Leben. Bei einer antibiotischen
Fraktion A228b mit 88o Einheiten/mg blieben alle Mäuse nach Injektionen von Höhe
in ioo mg/kg Körpergewicht am Leben.
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A228a und A228b haben offensichtlich eine Bedeutung als fungicide
Antibiotica.
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2. Die Charakteristika von Ds41 Der Organismus Ds41 ist ein typischer
Streptomyces, da er aerob ist und sowohl ein vegetatives als auch ein Luftmycel
bildet. Auf Malzagar ist das vegetative Mycel bräunlichgelb gefärbt, das Luftmycel
ist weiß, wird aber oft nur spärlich gebildet. Es wird kein lösliches Pigment erzeugt.
Bei einem anorganischen Grundmedium mit Ammoniumsulfat als Stickstoffquelle konnten
Dextrose, Galactose, Maltose,Raffinose und Saligenin als Kohlenstoffquellen gut
verwendet
werden; Natriumsuccinat oder Fructose unterstützten ein
begrenztes Wachstum, Xylose, Rhamnose, Lactose, Mannit, Dulcit und Nätriumcitrat
konnten nicht als Kohlenstoffquellen'verwendet werden.
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3. Züchtung von Ds41 A228 wird durch aerobe Gärung des obengenannten
Organismus Ds 41 in einem Medium 'eines Typs, der für die Züchtung von Pilzen der
Art Streptomyces geeignet ist, erzeugt. Es wurde gefunden, daß zur. Förderung des
Wachstums das p$ des Mediums vorzugsweise im Bereich von 6 bis 8 liegen soll.
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Das Medium enthält zweckmäßig sowohl eine oder mehrere Stickstoffquellen,
beispielsweise Stickstoff enthaltende Salze oder Eiweißkörper, z. B. Ochsenfleischextrakt,
Hafermehlextrakt oder Sojabohnenmehl, als auch ein oder mehrere geeignete Kohlehydrate
sowie ein oder mehrere Nährsalze. Die optimale Temperatur für die Fermentatign beträgt
etwa 27°.
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Beispiele für einige Medien, die das Wachstum des Organismus Ds41
zur Erzeugung des Antibioticums A228 fördern, werden weiter unten lediglich als
Erläuterungen gegeben, und es ist für den Fachmann verhältnismäßig einfach, durch
Vorversuche zu bestimmen, ob irgendwelche besonderen Zusätze zu diesen Medien oder
Abweichungen von den angegebenen Medien wünschenswert sind oder nicht.
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Lediglich zur Erläuterung werden die folgenden Einzelheiten der Züchtung,
wie sie durchgeführt wurde, in Form eines Beispiels angegeben A228 wurde durch submerse
aerobe Gärung von Ds41 in den folgenden drei Medien gebildet:
| I. Sojamehl......................... 3,000/0 |
| Distillers solubles . . . . . . . . . . . . . . . 0,75% |
| Natriumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0,2504 |
| 0 |
| Dextrose .... . ................ . . 2,000/0 |
| p$ ............................ 6,8 |
| II. Hafermehl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2,5004 |
| Calciumcarbonat .......:........ 2,0o0/0 |
| Dextrose ....................... 0,50% |
| pH ....:........................ 6,8 |
| III. Kartoffelextrakt . . . . . . . . . . . . . . . . . 2o,oo
0/0 |
| Pepton .......................... 0,5o0/0 |
| Dikaliumhydrogenphosphat ....... 0,2o 0/0 |
| Natriumchlorid . . . . . . . . ***'*'***« 0,9,00/, |
| Eisen(II)-sulfat . . . . . . . . : . . . . . . . . . o,öoi
0/0 |
| p$ ....... ,.................... 6,4 |
Konische Kolben von
250 rnl Inhalt, die 40 ml Nährflüssigkeit enthielten,
wurden mit einem 48stündigen vegetativen Impfstoff, der aus einem siebentägigen
Schrägagar bereitet war, beimpft. Die Kolben wurden 48 Stunden lang bei 27° auf
einer Schüttelmaschine mit kreisender Bewegung bebrütet. Die folgenden Beispiele
mögen als typische Titer für die drei obengenannten Medien gelten.
| Nährflüssigkeit Titer Einheiten/ml |
| I 26o |
| II 325 |
| III 218- |
Herstellung in Tanks Ein Schrägagar von Ds41 wurde zur Beimpfung von
350
ml eines Glycerin-Fleisch-Mediums in einem Kolben von 21 Inhalt verwendet. Dieser
wurde 48 Stunden bei 27° auf einer Schüttelmaschine mit kreisender Bewegung bebrütet
und dann dazu verwendet, 1401 eines Entwicklungsmediums in einem Gärtank aus rostfreiem
Stahl zu beimpfen.
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Das Entwicklungsmedium wurde folgendermaßen zubereitet:'
| Fleischextrakt .................. i,o% |
| Kasein-Extrakt |
| (Handelsbezeichnung Pronutrin) i,o 0/0 |
| Natriumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . o,5(1/" |
| Glycerin ................ ....... 5,0°/o |
| Pa - - ............................ 7.,0 |
Der Tank wurde bei 27° belassen und mit
350 Umdrehungen/Minute gerührt. Durch
die Gärung wurde sterile Luft -nit 0,1133 m3/Minute geleitet. Nach 36 Stunden, als
der Mycelgehalt io mg/ml überstieg, wurden 501 in einen 'rostfreien Stahltank, der
5001 des Produktionsmediums enthielt, übergeführt
| Hafermehl (grob) . . . . . . . . . . . . . . . . .
2,50/, |
| Calciumcarbonat ....... : . . . . . . . . i,o 0/0 |
| Dextrose .......... .......... 0,5% |
| Pa ............................. 6,8 |
Die Gärtemperatur wurde unter Rühren mit 375 Umdrehungen/Minute und einem Luftstrom
von
0,2832 m3/Minute bei 27° gehalten.
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Die Brühe wurde nach 56 Stunden, als der Titer 312 Einheiten/ml betrug,
geerntet. 4. Die Isolierung und Reinigung von A228 Es wird, wie bereits erwähnt,
angenommen, daß A228 zwei unterschiedliche; aber ganz ähnliche Verbindungen mit
antibiotischer Wirksamkeit umfaßt. Die Isolierung von Gemischen dieser zwei Verbindungen
mit hoher Wirksamkeit soll zuerst beschrieben werden, und dann soll eine Beschreibung
der Trennung der zwei Verbindungen folgen. Es sei hervorgehoben, daß ein Gemisch
der zwei Verbindungen für therapeutische Zwecke völlig ausreichend ist. Die Bezeichnung
»A2z8u wird für die Mischung der zwei Verbindungen verwendet, während die Buchstaben
»au und »b« zugefügt werden, um zwischen den zwei einzelnen Verbindungen zu unterscheiden.
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Die Aktivität ist sowohl in dem Mycel als auch in der vergorenen Nährlösung
vorhanden. A228 wird zweckmäßig aus der Gärflüssigkeit durch Lösungsmittelextraktion
unter Verwendung eines Lösungsmittels (im folgenden als »Extraktionslösungsn@ttela
bezeichnet), das wenigstens teilweise nicht mit Wasser mischbaristundinwelchemA2281öslichist,
extrahiert. Geeignete Extraktionslösungsmittel sind n-Butanol und Chloroform, wobei
n-Butanol besser geeignet ist. Die Extraktion kann in einem weiten pH-Bereich durchgeführt
werden. Die besten Ausbeuten werden jedoch beim Neutralwert erzielt.
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Wenn die gesamte Gärlösung filtriert wird (durch Kieselgur), kann
der wirksame Anteil, der im Rückstand
zurückgehalten wird, durch
Waschen mit n-Butanol extrahiert werden. 'Bei der Verwendung von filtrierter Gärlösung
kann im wesentlichen die gesamte A228-Aktivität mit I Volumen n-Butanol extrahiert
werden, doch haben sich aufeinanderfolgende Extraktionen mit 1/b und '/"Volumen
n-Butanol als zweckmäßiger erwiesen.
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Ein wirksames und zweckmäßiges Extraktionsverfahren besteht darin,
daß die gesamte Gärlösung mit n-Butanol gerührt, durch Kieselgur filtriert und dann
die organische Phase von dem wäßrigen Rückstand im Filtrat getrennt wird.
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A228 kann aus dem Extrakt in dem Extraktionslösungsmittel durch Zugabe
eines Lösungsmittels (das weiterhin als Fällungslösungsmittel bezeichnet wird),
in dem A228 unlöslich ist, das jedoch mit dem Extraktionslösungsmittel mischbar
ist, gefällt werden. Geeignete Fällnngslösungsmittel sind Äther, z. B. Diäthyläther,
Petroläther, Ester, z. B. Äthylacetat und Ketone, z. B. Aceton. Es ist zweckmäßig,
den in dem Extraktionslösungsmittel enthaltenen Extrakt durch Destillation unter
vermindertem Druck einzuengen, ehe die Fällung durchgeführt wird. Der erhaltene
Niederschlag ist gewöhnlich ein feinpulvriger fester Stoff; doch wurden in manchen
Fällen gummiartige Stoffe erhalten, die durch Waschen mit einem inerten Lösungsmittel,
z. B. wasserfreiem Äther, und anschließendes Trocknen im Vakuum in pulvrige Feststoffe
umgewandelt werden können. In einigen Fällen erwies es sich als notwendig, den gumnniartigen
Stoff nochmals in dem Extraktionslösungsmittel zu .lösen und mit einem Fällungslösungsmittel
erneut zu fällen. Die auf diese Weise hergestellten hell gelbbraun gefärbten Feststoffe
enthielten 15o bis 650 Einheiten/mg.
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Ein alternatives Verfahren, das ebenso zweckmäßig .und wirksam ist,
besteht darin, daß die gesamte Gärlösung mit 10/0 (Gewicht/Volumen) Magnesiumtrisilikat
und 2 0/0 (Gewicht/Volumen) Kieselgur etwa =5 Minuten lang gerührt wird. Dann wird
die Mischung filtriert und das Filtrat, das nun keine A 228-Aktivität enthält, verworfen.
Das A228 wird aus der fest"n Masse durch Rühren und Filtrieren zuerst mit Aceton,
wobei 1/5 des ursprünglichen Völumens angewendet wird, und dänn zweimal mit 8o0/0igem
wäßrigem Aceton (Volumen/Volumen) eluiert.
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Die vereinigten wäßrigen Acetoneluate werden unter vermindertem Druck
eingedampft, um alles Aceton zu entfernen, wobei die Temperatur unter 35° gehalten
wird. Dann wird der wäßrige Rückstand zweimal mit 1/3 Volumen n-Butanol extrahiert.
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Die Butanolextrakte werden vereinigt und zur Entfernung des gesamten
Wassers unter vermindertem Druck eingeengt, bis das Volumen nur noch etwas mehr
als 1/25o des ursprünglichen Volumens der Gärlösung beträgt. Dieses Konzentrat wird
mit 6 Volumen trockenen Äthers versetzt, wobei sich A228 als ein gelbbraungefärbter
fester Stoff abscheidet.
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Reinigung Eine weitgehende Reinigung kann mit Gegenstromverteilungsverfahren
erzielt werden, z. B.'mittels einer 'Gegenstromverteilung zwischen Wasser und n-Butanoldiäthyläther
(1: 1,75 Volumen/Volumen) nach Craig [vgl. Gregory & Craig, Ann. N. X. Acad.
of. Sci., 53, 111$ (195I)]. Wenn feste Stoffe mit einer Reinheit von etwa 400 Einheiten
der antibiotischen A228-Aktivität je mg als Ausgangsmaterialien verwendet werden,
können in der organischen Phase Fraktionen erhalten werden, .die Wirksamkeiten von
7oo bis 8oo Einheiten/mg aufweisen. Die erhaltenen Verteilungskurven zeigen das
Vorhandensein von mehr als einem aktiven Bestandteil bei einigen der rohen erfindungsgemäßen
Präparate an.
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Es wurde festgestellt, daß das zufriedenstellendste Verfahren zur
Trennung von A228 in A228a und A228b in einer gegenläufigen Phasentrennungschromatographie
besteht. Es wurde nach den Angaben von S. M. Partridge und T. Swain [l\Tature, 16.6,
272 (195o)] gearbeitet. Die Trennung findet an einer Säule von »Allopren« (chlorierter
Kautschuk) statt, das etwa qo 0/0 Volumen/Gewicht an n-Butanol -enthält und wobei
das durchfließende Lösungsmittelsystem mit n-Butanol gesättigtes Wasser ist. Auf
diese Weise wurden =o g der rohen antibiotischen A 228-Mischung, die in mit n-13utanol
gesättigtem Wasser gelöst waren, durch eine Alloprensäule hindurchgeleitet, die
50 g Allopren und 2o g n-Butanol enthielt und wie in der genannten Literaturstelle
bereitet war. Die Entwicklung wurde mittels mit n-Butanol gesättigtem Wasser fortgesetzt
und die Filtratanteile in regelmäßigen Intervallen aufgefangen. Die ersten Fraktionen
enthielten einigeunwirksame Vereunreinigungen, dann wurden zwei verschiedene aktive
Fraktionen aufgefangen. Die erste antibiotische Fraktion, die aus der. Säule austrat,
ist das Antibioticum A228a und die zweite A228b. Die Wirksamkeiten dieser Fraktionen
variieren zwischen 6oo bis 2ooo Einheiten/mg Gewicht.