DE1065135B - Herstellung und Gewinnung des Antibiotikums Raromycin - Google Patents

Description

DEUTSCHES

Die Erfindung betrifft die Herstellung des Antibiotikums Raromycin durch Fermentation eines Stammes der bisher unbekannten Gattung Streptomyces albochromogenus während mindestens 24 Stunden in einem wäßrigen, einen Stickstoffgeber enthaltenden Kohlehydrat-Nährmedium submers unter Belüftung und die Gewinnung gegebenenfalls aus dem Fermentationsmedium. Es hat sich gezeigt, daß das Raromycin tumorhemmende Eigenschaften besitzt und als chemotherapeutisch wirksames Krebsbekämpfungsmittel verwendet werden kann. Verfahrensendstoff im Sinne der Erfindung ist diese tumorhemmende Verbindung sowohl in Form von Lösungen, von Rohkonzentraten, von gereinigten Feststoffen wie als reine kristalline Verbindung. Dieser Stoff ist wirksam gegen Ehrlich-Carcinome bei Mäusen sowie gegen Maus-Sarkome 180 nach Crocker und besitzt eine sehr geringe Toxizität. Raromycin hemmt das Wachstum bestimmter Mikroorganismen, z. B. 1 °/oige Lösungen oder Suspensionen von Shigella dysenteriae.

Es wurden systematische Studien mit aus Aktinomycetes entstehenden, tumorhemmenden Verbindungen betrieben und gefunden, daß ein tumorhemmender, aus einem Schlamm isolierter Streptomyces eine neue tumorhemmende Verbindung darstellt und daß dieser Streptomycesstamm zu einer neuen Sorte, nämlich Streptomyces albochromogenus, gehört. Diese tumorhemmende Verbindung wurde Raromycin genannt. Raromycin erweist sich als wachstumhemmend bei vielen tierexperimentalen Geschwüren, besonders beim Ehrlich-Carcinom an der Maus und beim Maus-Sarkom 180' von Crocker. Es besitzt eine geringe Toxizität. Es kann entweder zur Heilung oder zur Linderung von bösartigen Geschwüren bei Menschen oder bei Tieren verwendet werden.

Tumorhemmende Verbindungen, die von Streptomyces gebildet werden, sind beschrieben. Es sind dies Actinomycin, Puromycin, Sarkomycin, Azaserin, Carcinohilin, Actinoleukin, Mitomycin, Ganacidin, 6-Diazo-5-oxo-norleucin, Toyokamycin, Hygroscopin und Melanomycin. Von diesen Verbindungen unterscheidet sich Raromycin durch seine physikalischen, chemischen und biologischen Eigenschaften. Entsprechend der vorliegenden Erfindung wird der Raromycin bildende Stamm auf geeignete Nährmedien inokuliert und unter aeroben Bedingungen gezüchtet, bis sich auf dem Nährmedium eine beträchtliche Menge Raromycin angesammelt hat. Aus der Nährbrühe wird das Raromycin durch Anwendung einer oder mehrerer der folgenden Operationen gewonnen: Extraktion, Verdampfen, Herauslösen, Fällen usw.

Raromycin wird von Actinomycetes gebildet. Der erfmdungsgemäß entdeckte und unten beschriebene Streptomyces albochromogenus ist ein Beispiel eines

Herstellung und Gewinnung
des Antibiotikums Raromycin

Anmelder:

Dr. Yusuke Sumiki
und Dr. Hamao Umezawa, Tokio

Vertreter:

Dipl.-Ing. Dipl.-Chem. Dr. phil. Dr. techn. J. Reitstötter,
Patentanwälte, München 15, Haydnstr. 5

Beaitsprudite Priorität:
Japan vom 4. April 1957

Dr. Yusuke Sumiki und Dr. Hamao Umezawa, Tokio,
sind als Erfinder genannt worden

Raromycin bildenden Actinomycetes. Der erfindungsgemäß entdeckte, mit Nr. 314 Cl bezeichnete Stamm bildet Raromycin und stellt eine typische Kultur von Streptomyces albochromogenus dar. Dieser Stamm wurde bei der American Type Cultur Collection unter Nr. 13 157 hinterlegt und hat folgende Eigenschaften:

1. Mikroskopische Eigenschaften: Das Mycel auf dem Substrat bleicht, und es bildet sich das Aeromycel. Auf Bennet-Agar- und Stärke-Agar-Nährboden beobachtet man Spiralen und Spindeln. Am Ende des Aeromycels wurden gelegentlich Sporenketten beobachtet. Die Spore ist im allgemeinen rund, oval oder ellipsoid und hat eine Größe von 0,7 bis 1,0 μ auf 1,0 bis 1,5 μ.

2. Auf Glycerin-Czapek-Agar (27° C): Wachstum reichlich, vorerst farblos, dann braun. Aeromycel reichlich, vorerst weiß wie Watte, später grau. Spärliches, bräunliches und lösliches Pigment.

3. Rohrzucker-Czapekt-Agar (27° C): Gleich wie auf Glycerin-Czapek-Agar.

4. Asparagin-Glukose-Agar (27° C): Wachstum reichlich, vorerst farblos, dann gelb. Aeromycel reichlich, weiß wie Watte. Kein lösliches Pigment.

5. Glycerin-Asparagin-Agar (27° C): Wachstum reichlich, vorerst farblos, dann gelblichbraun. Aeromycel weiß wie Watte. Im allgemeinen kein lösliches Pigment.

6. Malonsaures Calcium-Agar (27° C): Im Vergleich zu den obigen Nährmedien ist das Wachstum

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langsam, zuerst farblos, dann hellgelb. Aeromycel spärlich, watteweiß. Wenig gelbliches, lösliches Pigment.

7. Zitronensaures Calcium-Agar (27° C): Wachstum reichlich, vorerst farblos, später braun. Reichlich weißes Aeromycel. Im allgemeinen kein lösliches Pigment.

8. Stärke-Agar: Wachstum reichlich, vorerst farblos, dann grünlichgrau, Aeromycel reichlich, watteweiß zu Beginn, dann hellgrau. Im allgemeinen kein lösliches Pigment. Positive Stärkehydrolyse.

9. Hefeextrakt-Agar (27° C): Wachstum in Falten, vorerst farblos, dann braun mit gleichzeitiger Bildung von tiefbraunem löslichem Pigment. Aeromycel reichlich, vorerst weiß, später grau. Es bildet sich tiefbraunes lösliches Pigment.

10. Fleischextrakt-Pepton-Agar (27° C): Wachstum reichlich, farblos. Aeromycel reichlich, watteweiß. Dunkelbraunes lösliches Pigment.

11. Hefeextrakt-Fleischextrakt-Agar (27° C): Wie auf Fleischextrakt-Pepton-Agar.

12. Kartoffelbrei (27° C): Wachstum hellgrau, in Falten. Aeromycel reichlich, weiß, watteähnlich. Kein lösliches Pigment.

13. Karottenbrei (27° C): Wachstum reichlich, gelblichbraun, in Falten. Aeromycel reichlich, weiß, watteähnlich. Kein lösliches Pigment. Keine Verfärbung des Breies.

14. Gelatine: Farbloses Wachsen auf der Oberfläche. Aeromycel grau. Spärliches, braunes lösliches Pigment. Keine Verflüssigung.

15. Glykose-Nährbrühe (27° C): Membranähnliche Oberfläche, farbloses Wachstum. Dunkelbraunes, lösliches Pigment. Kein Aeromycel.

16. Milch-Nährmedium (27° C): Membranähnliches Wachstum auf der Oberfläche, vorerst weiß, dann cremefarben. Braunes, lösliches Pigment. Keine Koagulation. Später geringe Peptonisation.

17. Nitritreduktion: In Pepton schwach positive Reaktion mit Nitrit.

18. Verbrauch von Kohlenstoffquellen: Die folgenden Kohlenstoffquellen wurden zur Grundlösung nach Gottlieb und Pridham in einer Menge von 1,0% gegeben, mit Ausnahme der Natriumsalze der organischen Säuren, welche in einer Menge von 0,15°/o zugesetzt wurden. Xylose, Arabinose, Thamnose, Fruktose, Laktose, Galaktose, Rohrzucker, Altrose, Raffinose, Glucose, Inulin, Mannitol, Inositol und Stärke förderten das Wachstum, dagegen fand sozusagen kein Wachstum statt in Gegenwart von Salicin, Acetat, Citrat, Succinat, Sorbitol und Dulcitol.

19. Beste Wachstumstemperatur: 27 bis 37° C

20. Die Züchtung führt zu Raromycin. Wie oben beschrieben, ist der Stamm Nr. 314 Cl im Wachstum farblos, weiß, gelb bis gelblichbraun oder grau. Gelegentlich hat er einen Stich ins Olivgrün. Im allgemeinen bildet sich das Aeromycel in reichlicher Menge und ist weiß wie Watte, später mit einem Einschlag nach Grau. Es bildet in Fleischextrakt, Pepton oder Hefeextrakt enthaltenden Nährböden ein dunkelbraunes, lösliches Pigment. Gelegentlich bildet es in synthetischen Medien ein schwach bräunliches Pigment. Im allgemeinen entwickelt es eine schwache proteolytische Wirkung.

Wenn man die obigen Eigenschaften mit denen bekannter Actinomyceten vergleicht, dann gleich der Stamm Nr. 314 Cl am ehesten dem Streptomyces venezuelae oder dem Streptomyces griseochromogenus. Streptomyces venezuelae unterscheidet sich jedoch in folgenden Eigenschaften vom Stamm

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Nr. 314 Cl. Der erste bildet keine Spiralen, verflüssigt Gelatine, peptonisiert Milch und verbraucht weder Rohrzucker, Raffinose, Inulin, Mannitol noch Inositol. Der Streptomyces griseochromogenus peptonisiert Milch, wächst nicht mit Rhamnose und Inulin und bildet das pilzhemmende Antibiotikum Blasticidin. Nr. 314 Cl wächst gut bei 27 bis 37° C, wogegen die beste Temperatur für das Wachstum von Streptomyces griseochromogenus bei 26 bis 30 ⁰ C liegt. Da

ίο die Gattung, zu welcher der Stamm Nr. 314 Cl gehören sollte, nicht gefunden werden konnte, wurde die neue Gattung Streptomyces albochromogenus aufgestellt und der Stamm Nr. 314 Cl dieser Gattung zugeordnet. Streptomyces albochromogenus ist die Gattung, zu welcher der Stamm Nr. 314 Cl als typischer Vertreter neben künstlichen Mutanten und natürlichen Varianten gehört.

Die Eigenschaften von Raromycin werden weiter unten beschrieben; nachdem sind die unten angegebenen Eigenschaften von Raromycin bildenden Streptomyces zu finden und zu bestimmen.

Erfindungsgemäß können diejenigen Stämme zur Herstellung von Raromycin verwendet werden, welche in die oben angegebene Gattung, zu welcher der Stamm Nr. 314 Cl gehört, eingereiht werden können. Zur Herstellung von Raromycin wird ein Raromycin bildender Stamm auf ein geeignetes Nährmedium inokuliert und unter aeroben Bedingungen wachsen gelassen. Als Nährlösungen können solche Lösungen verwendet werden, von denen bekannt ist, daß sie für Actinomycetes verwendbar sind. Zum Beispiel kommt als Kohlenstoff quelle in Frage: Glycerin, Stärke, Dextrin, Glukose, Maltose, Fructose, Rohrzucker, Laktose oder Zuckermelassen. Mehl aus Sojabohnen, Erdnüssen oder Baumwollkeimen sowie Fleischextrakt, Peptone, Maisextrakt, Hefe, Harnstoff, Natriumnitrat, Ammoniumnitrat und Ammoniumsulfat sind Beispiele zweckmäßiger Nährmedien und Stickstoffquellen.

Wenn nötig, werden dem Medium auch Natriumchlorid, Phosphat, Carbonat oder eine winzige Menge Schwermetallionen zugesetzt. Zum Beispiel gedeiht Raromycin sehr gut in einem Sojabohnenmehl oder Erdnußmehl, Glukose, Stärke oder Dextrin, Natriumchlorid, Phosphat und Calciumcarbonat enthaltenden Medium. Für die Herstellung von Raromycin kann die Züchtung auf festem Nährboden angewandt werden, aber die Züchtung in flüssigen Medien ist zweckmäßiger. Die Vergärung unter kräftiger Lüftung ist am zweckmäßigsten. Unter aeroben Bedingungen heißt die Züchtung z. B. bei Durchlüftung mit keimfreier Luft. Die Züchtungstemperatur liegt bei 25 bis 40° C; die beste Temperatur ist 28 bis 38° C Auf diese Weise wird die Züchtung fortgesetzt, bis sich in der Brühe eine beträchtliche Menge Raromycin angesammelt hat. Im allgemeinen dauert es 3 bis 7 Tage beim Schüttelversuch und 2 bis 4 Tage bei der belüfteten Gärung, bis die Konzentration an Raromycin in der Brühe den Gipfelwert erreicht.

In der Züchtungsbrühe findet sich das Raromycin sowohl in der flüssigen wie in der festen mycelhaltigen Phase. Besonders wenn viel Raromycin entsteht, dann ist der Anteil in der festen Phase ebenfalls beträchtlich. Infolgedessen gibt es zwei Verfahren, das eine, nach welchem zuerst die flüssige und die feste Phase voneinander getrennt werden und das Raromycin aus jeder derselben einzeln gewonnen wird, und das andere, wonach das Raromycin ohne Trennung aus der das Mycelium enthaltenden Züchtungsbrühe gewon-

7υ nen wird.

Raromycin ist bei p_H-Werten zwischen 2,0 und 8,0, insbesondere zwischen 2,0 und 7,0, beständig, und die Verbindung ist vorteilhaft bei diesen p_H zu behandeln. Man kann auch bei p_H unter 2,0 oder bei p_H über 8,0 arbeiten, aber Raromycin ist bei alkalischem p_H weniger beständig als bei saurem. Raromycin in der flüssigen Phase kann mittels mit Wasser mischbarer Lösungsmittel, in welchen Raromycin löslich ist, wie Butanol, Amylalkohol, Methyl-isobutylketon und Äthylacetat, extrahiert werden. Die Verteilung in Benzol, Petroläther, Äther, Ligroin und Butylacetat erfolgt sehr langsam. Das in der festen Phase der Züchtungsbrühe befindliche Raromycin kann mit den obigen Lösungsmitteln, in welchen Raromycin löslich ist, direkt aus der die feste mycelhaltige Phase enthaltenden Zuchtbrühe extrahiert werden, oder man extrahiert mit Lösungsmitteln, in welchen Raromycin löslich ist, wie Methanol oder Äthanol, nachdem die Raromycin enthaltende feste Phase nach den üblichen Methoden zur Trennung von flüssiger und fester Phase, wie Filtrieren, Zentrifugieren u. dgl., abgetrennt wurde.

Das Lösungsmittel enthaltende Raromycin wird unter vermindertem Druck behandelt, wonach das im Restwasser befindliche Raromycin in Butanol aufgenommen werden kann oder der feste bzw. syrupöse Rückstand in Methanol oder Äthanol aufgelöst werden kann. Nach einem anderen Verfahren wird das Raromycin bei einem p_H von 2,5 bis 3,5 aus der wässerigen Lösung gefällt. Dabei wird das in der flüssigen Phase enthaltene Raromycin mitgefällt, wonach die Fällung in Methanol oder anderen Lösungsmitteln, in welchen Raromycin löslich ist, aufgelöst werden kann. Raromycin ist, wie weiter unten ausgeführt wird, eine neutrale oder schwach saure Verbindung; deshalb ist es zweckmäßig, einen p_H-Wert von etwa 2,5 einzuhalten, wenn das Raromycin aus der Züchtungsbrühe in ein Lösungsmittel, wie Butanol u. ä., übergeführt wird. Das in Methanol oder Butanol gelöste Raromycin wird durch Zusatz von Lösungsmitteln, wie Äthylacetat, in welchem es besser löslich ist wie die Verunreinigungen, von diesen befreit. Zum Beispiel kann man Äthylacetat zusetzen, die unlöslichen Bestandteile abtrennen, die Raromycin enthaltende Lösung eindampfen, den Raromycin enthaltenden Rückstand in Methanol oder Butanol lösen und das Raromycin durch Zusatz von Lösungsmitteln, wie Äther, Petroläther oder Benzol, in welchen Raromycin unlöslich ist, ausfällen. Zwecks Reinigung kann die fraktionierte Fällung je nach Löslichkeiten des Raromycins wiederholt werden. Man erhält das Raromycin als schwach gelbliches, weißes, kristallines Pulver.

Raromycin ist nicht hitzebeständig; deshalb ist es wünschenswert, das Verfahren bei einer möglichst tiefen Temperatur durchzuführen. Zum Beispiel dampft man das Lösungsmittel bei einer Temperatur unterhalb 35 bis 45° C ab. Zu diesem Zweck kann man einen Flash-Verdampfer verwenden.

Raromycin kann an Aktivkohle oder an ein freies Ionenaustauscherharz, wie der H-Typus oder der O H-Typus, adsorbiert und mit Lösungsmitteln, wie Methanol, wässerigem Methanol, Äthanol, wässerigem Äthanol, Butanol, wässerigem Butanol oder wässerigem angesäuertem Aceton, eluiert werden. Doch ist die Ausbeute beim Adsorptionsverfahren geringer als beim obigen Lösungsmittelextraktionsverfahren. Diese Adsorber können auch eingesetzt werden, um die Verunreinigungen zu entfernen oder um deren Zahl zu verringern. Nach dem obigen Verfahren gereinigtes

Raromycin ist ein schwach gelbliches, weißes kristallines Pulver. Es ist löslich in Methanol und Äthanol, verhältnismäßig löslich in Wasser, Butanol und Äthylacetat, schwach löslich in Aceton und Benzol, unlöslieh in Äther und Petroläther.

Im Ultraviolettspektrum weist Raromycin in methanolischer Lösung (50 mcg/ml) eine Schulter bei 250 bis 270 μ und kein Maximum auf. Es ist optisch aktiv; die spezifische Drehung [a]_fl wurde mit +11,0° ίο gemessen (1% in Methanol). Die qualitative Bestimmung ergab, daß Raromycin weder Halogen noch Phosphor enthält, wies aber auf das Vorhandensein von Schwefel und Stickstoff (3,6%) hin.

Raromycin zeigte negative Reaktionen mit Anthron-, Molish-, Tollens-, Nitroprussid-, Ninhydrin-, Biuret-, Sakaguchi-, Fehling- und Ferrichlorid-Reagens. Die Diazoreaktion war positiv.

Bei der Papierelektrophorese mit 600 V, 0,5 mA und p_H 7 bewegte sich das in der Mitte aufgebrachte Raromycin nur 1,5 mm in Anodenrichtung, welches Resultat auf den neutralen oder sehr schwach sauren Charakter von Raromycin schließen läßt.

Bei einer Konzentration von 500 mcg/ml hemmte Raromycin das Wachstum von E. coli, Aspergillus niger, Penicillium notatum, Penicillium chrysogenum, Torula utilis, Saccharomyces celevisiae oder Candida albicans nicht. Es ist deshalb in verdünnter wässeriger Lösung zur Ausschaltung von bakterieller Ansteckung gewisser Penicillingärlösungen verwendbar. Es hemmte Sh. dysenteriae bei 100 mcg/ml, B. cereus (ATCC 9634) und B. xerosis bei 50 mcg/ml, S. aureus (209-p) bei mcg/ml und S. lutea bei 15 mcg/ml (gemessen nach der Verdünnungsmethode).

Die intraperiotoneale Injektion von 1 g/kg Raromycin an der Maus zeitigte keinerlei Toxizitätserscheinigungen, und die Mäuse vertrugen intravenöse Injektionen von 200 mg/kg ohne Anzeichen. Die geringe Toxizität an der Maus ist eine charakteristische Eigenschaft von Raromycin.
Raromycin hat eine stark tumorhemmende Wirkung beim Ehrlich-Carcinom an der Maus und beim Maus-Sarkom 180 nach Crocker. 20 Stunden nach der intraperitonealen Injektion von einer Million Krebszellen wurde Raromycin täglich intraperitoneal gespritzt. Dabei hemmte eine tägliche Injektion von 0,3 mg/kg das Anschwellen des Bauchwassers und verlängerte die Überlebensdauer. Setzte die Behandlung 5 Tage nach der Injektion der Krebszellen ein, so wurde bei einer täglichen Injektion von 5 mg/kg ebenfalls ein Anschwellen des Bauchwassers verhindert und die Überlebensdauer verlängert. Beim subkutanen Einimpfen einer Million Krebszellen und Einsetzen der täglichen Injektion von 5 mg/kg wurde ebenfalls ein Anschwellen des Bauchwassers verhindert und die Überlebensdauer verlängert. Beim subkutanen Einimpfen einer Million Krebszellen und Einsetzen der täglichen intraperiotonealen Injektion mit Raromycin am fünften Tag wurde bei täglicher Injektion von 10 mg/kg das Wachstum der subkutanen Geschwulst zu 50% gehemmt.

Raromycin unterscheidet sich darin von Sarkomycin und von Carcinophilin, daß Raromycin bei neutralem p_H nicht vom Lösungsmittel in das Wasser übergeht. Ferner unterscheiden sich die beiden Ultraviolettspektren. Von Carcionophilin unterscheidet es auch die geringe Toxizität. Carcinophilin ist sehr toxisch.

Raromycin reagiert beim Ninhydrintest negativ und unterscheidet sich dadurch von Azaserin und 6-Diazo-5-oxo-norleucin. Vom Puromycin unterschei-

det es die Tatsache, daß Puromycin basisch reagiert und nach Hydrolyse auf Ninhydrin positiv reagiert. Actinomycin, Mitomycin, Pluramycin und Ganzidin wirken stark bakteriostatisch und werden als rote kristalline Pulver erhalten, wodurch sie sich von Raromycin unterscheiden.

Carcinomycin, Ganmycin und Melanomycin sind nicht dialysierbare hochmolekulare Verbindungen und unterscheiden sich von Raromycin. Toyokamycin und Hydroscopin sind stark pilztötend wirksam und unterscheiden sich von Raromycin auch in ihren Ultraviolettspektren. Aktinoleukin ist für Mäuse toxisch, entfaltet eine starke bakteriostatische Wirkung auf und unterscheidet sich von Raromycin auch im Ultraviolettspektrum.

Der neue Stoff Raromycin ist von bekannten krebstötenden Verbindungen deutlich verschieden.

Die unten gegebenen Beispiele können im Rahmen der Züchtungsbedingungen für Aktinomyceten oder der oben beschriebenen Eigenschaften von Raromycin beliebig abgewandelt werden.

Beispiel 1

Der dem Streptomyces albochromogenus zugeordnete Stamm Nr. 314 CI wurde auf ein Medium folgender Zusammensetzung inokuliert: 2,0% Maisextrakt, 1,0% Sojabohnenmehl, 1,5% Glukose, 1,5% Natriumchlorid, 0,2% Kaliumphosphat und 0,2% Calciumcarbonat. Das P _h wurde auf 7,0 eingestellt und die Kultur unter Schütteln bei 27 bis 29° C gezüchtet. Die Bildung von Raromycin wurde durch Prüfung der Wirkung des Kulturfiltrates auf die Bauchwassersucht beim Ehrlich-Carcinom verfolgt. Gleichzeitig wurde auch wie folgt die bakteriostatische Wirksamkeit der Züchtungsflüssigkeit gegen S. lutea geprüft: Eine geringe Menge der Kulturflüssigkeit wurde entnommen und mit ButanoI nach der Verdünnungsmethode extrahiert; das Butanol wurde mit Äther versetzt und das Raromycin ausgefällt, wonach seine Wirkung gegen S. lutea (PCI 1001) untersucht wurde. Es wurde festgestellt, daß die Bildung von Raromycin ihren Höhepunkt 4 bis 7 Tage nach Beginn der Schüttelkultur erreicht. Die größte gebildete Raromycinmenge wurde auf 60 mcg/ml Raromycin geschätzt. In einem Medium, welches an Stelle von Glukose 1,5% Stärke oder Dextrin enthielt, wurden 50 bis 80 mcg/ml Raromycin gebildet.

Beispiel 2

Der Stamm Nr. 314C1 wurde im Schüttelversuch in folgendem Medium gezüchtet: 1,5 % Glukose, 0,5 % Natriumchlorid, 0,2 % Kaliumphosphat, 0,2 % Calciumcarbonat, 0,5 % Fleischextrakt und 0,5 % Papton (pjj = 7.0). Die Bildung von Raronrycin wurde nach der Methode des Beispiels 1 verfolgt. Man stellte fest, daß die Bildung 4 bis 7 Tage nach Beginn des Schüttelversuchs ihr Maximum erreichte und 40 bis 80 mcg/ml Raromycin gebildet worden waren.

Beispiel 3

Der Stamm Nr. 314Cl wurde im Schüttelversuch in einem Medium gezüchtet, welches dem Medium im Beispiel 1 entspricht, wobei jedoch das Sojabohnenmehl und der Maisextrakt durch 1,5% Erdnußmehl ersetzt waren. Es wurden ungefähr 60 mcg/ml gebildet.

Beispiel 4

201 eines 1,0% Sojabohnenmehl, 1,5 % Glukose, 0,5 % Natriumchlorid, 0,2 % Kaliumphosphat und

0,2 % Calciumcarbonat enthaltenden Mediums vom p_H-Wert 7,0 wurde in einen kleinen Gärbottich gebracht, sterilisiert und mit dem Stamm Nr. 314 Cl inokuliert. Als Lüftung wurden 20 1 pro Minute Luft zugeführt und der Rührer mit 600 Umdrehungen pro Minute bewegt. Die Gärung wurde bei 29° C durchgeführt. Raromycin konnte nach 60 Stunden festgestellt werden; nach 120 Stunden Gärdauer war es in einer Menge von 60 mcg/ml vorhanden. Die Gärung wurde unterbrochen und die Gärbrühe unter Gewinnung von 16 1 Filtrat filtriert. Es wurden 5 1 Butanol zugesetzt, der p_H-Wert mit Chlorwasserstoffsäure auf 2,0 eingestellt, das Ganze gerührt und die butanolhaltige Schicht abgetrennt. Die wässerige Schicht wurde noch zweimal hintereinander mit 4 1 Butanol ausgezogen. Die Butanolextrakte wurden vereinigt und mit Wasser (500 ml) gewaschen, wobei der p_H-Wert mit 10%iger NaOH auf 7,0 eingestellt wurde. Auf diese Art wurden 7,5 1 Butanolextrakt erhalten. Dieser Extrakt wurde mit 500 ml Wasser gewaschen und bei 35° C unter vermindertem Druck zu 20 ml eines Syrups eingedampft. Der Syrup wurde in 200 ml Methanol gelöst und mit 400 ml Äthylacetat versetzt. Der unlösliche Teil wurde abgetrennt und die Raromycin enthaltende Lösung unter vermindertem Druck bei 35° C eingedampft. Der Rückstand wurde in 20 ml Methanol gelöst und mit 200 ml Äther versetzt. Die Fällung wurde mit Äther gewaschen und getrocknet. So wurden 0,5 g Raromycin als leicht bräunliches Pulver erhalten. Die Ausbeute betrug 40 % des Gärfiltrates. Das erhaltene Pulver wurde in Äthanol gelöst, mit Äther versetzt bis zur beginnenden Trübung der Lösung und dann 25 Stunden lang bei 0° C aufbewahrt. Auf diese Weise wurde das ausgefallene Raromycin als leicht gelbliches, kristallines Pulver gewonnen.

Beispiel 5

Eine nach dem Verfahren von Beispiel 1 erhaltene Gärlösung von 800 ml, welche 50 mcg/ml Raromycin enthielt, wurde auf O⁰ C abgekühlt und mit Chlorwasserstoffsäure auf ein p_H von 2,5 eingestellt. Nach einer Stunde wurde die bräunliche Fällung durch Filtration gewonnen. Im Filtrat waren 25 mcg/ml Raromycin enthalten. Die feuchte Fällung wog 500 mg. Die Fällung wurde mit 20 ml Methanol versetzt und die unlöslichen Verunreinigungen abgetrennt. Die methanolische Lösung wurde unter vermindertem Druck auf 2 ml eingeengt und das Raromycin durch Zugabe von Äther gefällt. Es wurden so 80 mg eines braunen, 15 mg Raromycin enthaltenden Pulvers erhalten.

Beispiel 6

Der Stamm Nr. 314 Cl wurde unter Belüftung und Rühren in 1501 des im Beispiel 1 beschriebenen Mediums gezüchtet. Nach 60 Stunden betrug der p_H-Wert 7,5; in der Flüssigkeit hatte der Gehalt an Ammoniumstickstoff seinen tiefsten Wert erreicht und begann zuzunehmen. Zu diesem Zeitpunkt wurde die Gärung unterbrochen, die Gärflüssigkeit auf einen P₁₁-Wert 2,5 eingestellt und filtriert. So erhielt man 18 kg einer nassen Mycelmasse. Diese Mycelmasse wurde in 501 Aceton eingetragen und das Raromycin bei Raumtemperatur extrahiert. Die Acetonlösung wurde abgetrennt und mit 10 1 Butanol versetzt.

Die Butanolschicht wurde abgetrennt und im Volumenverhältnis 1:10 mit Wasser gewaschen, welches während des Waschvorganges mit Chlorwasserstoffsäure auf einen p_H-Wert 2,5 eingestellt wurde, und dann wieder im Verhältnis 1:10 mit Wasser ge-

Claims (1)

1. waschen, dessen p_H-Wert mit 10°/oigem Natriumhydroxyd auf 7,0 gebracht wurde. Der Butanolextrakt wurde unter vermindertem Druck bei 35° C auf ein Volumen von 300 ml Äther eingedampft. Zu dieser konzentrierten Lösung wurden 1500 ml Äther gegeben, wobei ein bräunlichweißes Pulver ausfällt. Dieses wurde getrocknet. Das getrocknete Pulver wog 13 g. Mittels 1000 ml Äthylacetat wurde dieses Pulver gewaschen und rötliche Verunreinigungen entfernt.

   So wurden 12 g eines weißlichen Raromycin enthaltenden Pulvers gewonnen.

   Patentanspruch:

   Die Verwendung eines Stammes von Streptomyces albochromogenus zur Herstellung des Antibiotikums Raromycin auf üblichem biologischen Wege und Gewinnung durch Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel.