DEG0014460MA

DEG0014460MA -

Info

Publication number: DEG0014460MA
Authority: DE

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

Tag der Anmeldung: 18. Mai 1954 Bekanntgemacht am 3. November 1955

DEUTSCHES PATENTAMT

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibioticums, das im folgenden beschrieben und charakterisiert wird.

Dieses neue Antibioticum wurde vorläufig bis zur Wahl eines anderen Namens als »A228« bezeichnet und diese Bezeichnung wird im folgenden beibehalten. A 228 wird durch aerobe Züchtung eines neuerdings entdeckten Pilzes der Art Streptomyces gebildet. Dieser Pilz wurde aus einer Erde von der Sierra Leone isoliert und der Stamm mit »Ds4ie; bezeichnet. Eine Kultur des lebenden Organismus Ds 41 wird demnächst in der National Culture Type Collection (NCTC) bei den Central Public Health Laboratories, Colindale Avenue, London N.W. 9, hinterlegt werden.

Die Erfindung wird im weiteren unter den folgenden Gesichtspunkten beschrieben: 1. Die Charakteristika und Eigenschaften von A 228. 2. Die Charakteristika des Organismus Ds 41. 3. Die Züchtung von DS41. 4. Die Isolierung und Reinigung von A228.

i. Die Charakteristika und Eigenschaften von A 228

Es wird angenommen, wie im einzelnen weiter unten beschrieben werden soll, daß A 228, wie es von Ds 41 erzeugt wird, eine Mischung aus zwei ganz ähnlichen Verbindungen darstellt, die als A 228 a und A 228 b bezeichnet wurden. Beide Substanzen haben nahezu identische chemische, physikalische und mikrobio-

509578/159

G 14460 IVa/30h

logische Eigenschaften. Bis jetzt war es möglich, zwischen diesen beiden Verbindungen dadurch zu unterscheiden, daß A 228a bei gegenläufigen Phasentrennungschromatogrammen, wie weiter unten beschrieben wird, etwas schneller läuft als A228b.

A 228a und A 228b sind im wesentlichen neutrale Substanzen. Die Eleinentaranalyse hat für beide A^erbindungen Werte von etwa 6O⁰Z₀KoIUCnStOfI, 8"/„ Wasserstoff, 2% Stickstoff und 4% Schwefel und Abwesenheit von Halogenen ergeben. Beide Verbindungen sind in alkoholischen Lösungsmitteln leicht löslich, z. B. in Äthanol, Methanol, Butanol, aber weniger leicht löslich in Wasser. Sie lösen sich in Chloroform, doch wird die antibiotische Wirksamkeit in diesem Lösungsmittel rasch zerstört.

In wasserfreiem Aceton, Diäthyläther, Äthylacetat und Pelroläther sind sie unlöslich. Sowohl gereinigte als auch rohe antibiotische Fraktionen sind in fester Form beständig. Wäßrige Lösungen sind unter der Voraussetzung, daß sie kalt aufbewahrt werden, ebenfalfs beständig. Im Dunkeln nimmt die antibiotische Wirksamkeit wäßriger Lösungen bei Zimmertemperatur nur sehr langsam ab, doch wird die Geschwindigkeit dieser Abnahme in hellem Licht bedeutend erhöht. So trat in sieben Tagen bei i8° in hellem Tageslicht Too"/„iger Aktivitätsverlust ein, wohingegen eine identische Probe im Dunkeln nach dieser Zeit bei derselben Temperatur noch 72% ihrer Aktivität besaß. Alkoholische Lösungen sind anscheinend beständiger als wäßrige Lösungen.

Wäßrige Lösungen der Antibiotica A228a und A 228b zeigen identische antibiotische Spektren und sehr ähnliche Eigenschaften bezüglich ihrer Absorptionsspektren. So wurden im ultravioletten Gebiet folgende Daten bei Absorptionsspektren erhalten:

A 228a bei 800 Einheiten/mg
A max 291111// 304111// 318m// 332m// 350m« K!*,, 150 265 475 700 695

A228I) bei 1100 Einheiten/mg
A max 2f)jin/i 304111// 318 m// 332 m// 350 m// El*,,, 160 290 520 805 785

Die Ultraviolett-Absorptionsspektren von A 228 a und A 228b sind in der Zeichnung wiedergegeben, in der

Fig. ι das Ultraviolettspektrum von A 228 a in wäßrigem Alkohol zeigt, wobei die Reinheit des verwendeten festen Antibioticums 800 Einheiten/mg betrug,

Fig. 2 das Ultraviolettspektrum von A 228 b in wäßrigem Alkohol zeigt, wobei die Reinheit des ver- ■ wendeten festen Antibioticums iioo Einheitcn/mg betrug.

Im Infrarotgebiet weisen beide antibiotischen Substanzen dieselbe Absorption auf, nämlich eine allgemeine Absorption zwischen 1600 und 1700 cm"¹, die charakteristische Absorption einer konjugierten ungesättigten Bindung (1724 und 1710 cm-¹) und eine —OH-Absorption (3400 bis 3500 cm-¹).

Wäßrige Lösungen der Antibiotica zeigen in ultraviolettem Licht ausgeprägte gelblichblaue Fluoreszenz. Beim Vermischen der Antibiotica mit Bromwasser wird die Bromlösung entfärbt und ein schwach gelber oder weißer Niederschlag gebildet. Zugabe von konzentrierter Schwefelsäure zu den antibiotischen Substanzen oder zu ihren konzentrierten Lösungen bewirkt eine charakteristische dunkelviolette Färbung.

Mikrobiologische Untersuchung und Eigenschaften

A228a und A228b werden zweckmäßig mittels der Agarplattenmethode untersucht, wobei Saccharomyccs cerevisiae NCTC 4614 als Testorganismus verwendet wird. Bei der verwendeten Methode wurden Untersuchungsplatten durch Beimpfen von 2%igem Glucosenähragar mit 1 % einer 48stündigen Kulturflüssigkeit des Testorganismus hergestellt.

Ein Präparat der gemischten Antibiotica A 228 a und A 228b, wurde mit 500 Einheiten/mg als Standard herangezogen. Über einen Bereich von 25 bis 250 Einheiten/ml wird eine lineare Dosis-Wirkung-Kurvc erhalten. Alle im folgenden angegebenen Titer sind auf diesen Standard bezogen.

Die folgende Tabelle zeigt das mikrobiologische Spektrum von A228a und A228b (einzeln oder im Gemisch), soweit es untersucht wurde.

Mikrobiologisches Spektrum der gemischten A228-Antibiotica

Organismus Inhibierende Konzentration in Einheiten/ml

48 Stunden

72 Stunjdcn

Saccharomyces cerevisiae NCTC 4614

Saccliaroinyces pastorianus C185

Torulopsis iitilis maj C41

Khodotorula gracilis C309

Rhodotorula glutinis C307

Hierhefe . . .

Ungarische Weinhefe C53

Kalifornische Weinhefe C54

Candida albicans C287

Trichopliyton mcntagrophytes D27S

Tricliopliyton mentagrophytes D279

Trichophyton interdigitalis D232

3,o 3,0 3,o

3,o

o,75
3,o
6,0
6,0
6,0
12,0

3,o 3,0 3,o

3,o

3,o 12,0 12,0 24,0 12,0

57H/159

G 14460 IVa/30 h

Mikrobiologisches Spektrum der gemischten A228-Antibiotica

Organismus

Inliibirende	Konzentration	48 Stunden	72 Stunden
in Einheiten/ml	3,0	24,0
—	12,0
3,0	3.0
3,0	12,0
6,0	12,0
i,5	3.0
i,5	3,0
i,5	6,0
i,5	6,0
3,o	3.0
	3,o
—	> 190,0
—-	> 190,0
—	> 190,0
—	> 190,0
>igo,o	> 190,0
> 190,0	> 190,0

Trichophyton interdigitalis D 234

Epidermophyton floccosum D 513

Alternaria solani C332

Aspergillus niger C116

Aspergillus terreus C412

Eremothecium ashbyii , C 337

Fusarium culmorum C331

Fusarium vasinfectum C320

Mucor racemosus C142

PeniciUium chrysogenum PM2

Penicillium patulum C311

Streptomyces aureofaciens C241

Streptomyces fradiae C278

Streptomyces griseus (K)

Mycobacterium phlei C285

Staphylococcus aureus C186

Escherichia coli C125

Serienweise zweifache Verdünnungen in 2%iger Glucosebrühe. Bebrütet wurde bei 28⁰.

Die mit »C« versehenen Zahlen beziehen sich auf die Kulturensammlung der Glaxo Laboratories Limited.

Die mit »Ό« versehenen Zahlen beziehen sich auf die Kulturensammlung der London School of Hygiene and Tropical Medicine.

Die A228-Antibiotica wirken in vitro auch bei gewissen Protozoen inhibierend.

Organismus

Endamoeba histolytica

Trichomonas Vaginalis

Versuchsmedium

Feste Phase: Leberinfusions-Trypton-Agar.

Flüssige Phase: Verdünntes Pferdeserum + reine Kultur.

Escherichia coli.

Bakterienfreie Kultur in Pferdeserum/Glucosebrühe.

Minimale inhibierende Konzentration

30 bis 60 Einheiten/ml*)

7,5 bis 15 Einheiten/ml

* Zur flüssigen Phase zugefügte Konzentration

Es wird ersichtlich, daß die gemischten A228-Antibiotica bei einem großen Bereich von Fungi inhibierend wirken. Prüfungen mit Saccharomyces cerevisae NCTC 4614, Aspergillus niger C 116 und Trichophyton mentaprophytes D 279 zeigen hinsichtlich der Wirksamkeit der Antibiotica A 228 a und A 228 b keine Unterschiede.

Toxitätsuntersuchungen

Die Toxitätsuntersuchungen wurden durchgeführt, indem Mäusen wäßrige Lösungen mit einer antibiotischen Fraktion A228/A, die 380 Einheiten/mg aufwies, intraperitoneal injiziert wurden. Eine von drei Mäusen blieb nach einer Injektion in Höhe von 83 mg/kg Körpergewicht am Leben. Bei Injektion mit 41,5 mg/kg Körpergewicht blieben alle Mäuse am

Leben. Bei einer antibiotischen Fraktion A 228 b mit 880 Einheiten/mg blieben alle Mäuse nach Injektionen von Höhe in 100 mg/kg Körpergewicht am Leben. A228a und A228b haben offensichtlich eine Bedeutung als fungicide Antibiotica.

2. Die Charakteristika von Ds 41

Der Organismus Ds 41 ist ein typischer Streptomyces, da er aerob ist und sowohl ein vegetatives als auch ein Luftmycel bildet. Auf Malzagar ist das vegetative Mycel bräunlichgelb gefärbt, das Luftmycel ist weiß, wird aber oft nur spärlich gebildet. Es wird kein lösliches Pigment erzeugt. Bei einem anorganischen - ■' Grundmedium mit Ammoniumsulfat als Stickstoffquelle konnten Dextrose, Galactose, Maltose,Raffinose und Saligenin als Kohlenstoffquellen gut verwendet

509 578/159

G 14460 IVa/30h

werden; Natiiumsuccinat oder Fructose unterstützten ein begrenztes Wachstum, Xylose, Rhamnose, Lactose, Mannit, Duleit und Natriumeitrat konnten nicht als Kohlenstoffquellen verwendet werden.

3. Züchtung von Ds.41

Λ 228 wird durch aerobe Gärung des obengenannten Organismus Ds.41 in einem Medium eines Typs, der für die Züchtung von Pilzen der Art Streptomyces geeignet ist, erzeugt. Es wurde gefunden, daß zur Förderung des Wachstums das J)₁₁ des Mediums vorzugsweise im Hereich von 6 bis 8 liegen soll.

Das Medium enthält zweckmäßig sowohl eine oder mehrere Stickstoffquellen, beispielsweise Stickstoff enthaltende Sal/.e oder Eiweißkörper, z. B. Ochsenileisehextrakt, Ilafermehlextrakt oder Sojabohnenmehl, als auch ein oder mehrere geeignete Kohlehydrate sowie ein oder mehrere Nährsalze. Die optimale Temperatur für die Fermentation beträgt etwa 27⁰.

ao Beispiele für einige Medien, die das Wachstum des Organismus Ds₁)I zur Erzeugung des Antibioticums A228 fördern, werden weiter unten lediglich als Erläuterungen gegeben, und es ist für den Fachmann verhältnismäßig einfach, durch Vorversuche zu bestimmen, ob irgendwelche besonderen Zusätze zu diesen Medien oder Abweichungen von den angegebenen Medien wünschenswert sind oder nicht.

Lediglich zur Erläuterung werden die folgenden Einzelheiten der Züchtung, wie sie durchgeführt wurde, in Form eines Heispiels angegeben:

A 228 wurde durch submerse aerobe Gärung von Ds.41 in den folgenden drei Medien gebildet:

J. Sojamehl 3,00 %

Distillers solubles 0,75%

Natriumchlorid 0,25 %

Dextrose 2,00%

pn 6,8

II. Hafermehl 2,50%

*° C.aleiiuncarbonat 2,00%

Dextrose 0,50%

Pn 6,8

II I. Kartoffelextrakt 20,00%

Peptoii 0,50%

Dikaliunihydrogenphosphat 0,20%

Natriumchlorid 0,20%

ICiSCn(I l)-sulfat 0,001%

Pn 6,4

Konische Kolben von 250 ml Inhalt, die 40 ml Nährllüssigkeit enthielten, wurden mit einem 48stündigen vegetativen Impfstoff, der aus einem siebentägigen Sehrägagar bereitet war, beimpft. Die Kolben wurden .48 Stunden lang bei 27⁰ auf einer Schüttelmaschine mit kreisender Bewegung bebrütet. Die folgenden Beispiele mögen als typische Titer für die drei obengenannten Medien gelten.

Nährflüssigkeit

II
111

Titer Einheiten/ml

260

325

218 Herstellung in Tanks

Ein Sehrägagar von Ds 41 wurde zur Beimpfung ^von 350 ml eines Glycerin-Fleisch-Mediums in einem Kolben von 21 Inhalt verwendet. Dieser wurde 48 Stunden bei 27⁰ auf einer Schüttclmaschine mit kreisender Bewegung bebrütet und dann dazu vcrwendet, 1401 eines Entwicklungsmediums in einem Gärtank aus rostfreiem Stahl zu beimpfen.

Das Entwicklungsmedium wurde folgendermaßen zubereitet:

Fleischextrakt ¹P⁰In *''**

Kasein-Extrakt

(Handelsbezeichnung Pronutrin) 1,0%

Natriumchlorid 0,5 %

Glycerin 5,0%

Pn 7,o

Der Tank wurde bei 27⁰ belassen und mit 350 Umdrehungen/Minute gerührt. Durch die Gärung wurde sterile Luft mit 0,1133 m³/Minutc geleitet. Nach 36 Stunden, als der Mycelgehalt 10 mg/ml überstieg, wurden 50 1 in einen rostfreien Stahltank, der 500 1 des Produktionsmediums enthielt, übergeführt:

Hafermehl (grob) 2,5 %

Calciumcarbonat ¹P⁰In

Dextrose 0,5 %

Ph ⁶>⁸

Die Gärtemperatur wurde unter Rühren mit 375 Umdrehungen/Minute und einem Luftstrom von 0,2832 m³/Minute bei 27⁰ gehalten.

Die Brühe wurde nach 56 Stunden, als der Titer 312 Einheiten/ml betrug, geerntet.

4. Die Isolierung und Reinigung von A 228

Es wird, wie bereits erwähnt, angenommen, daß A228 zwei unterschiedliche, aber ganz ähnliche Verbindungen mit antibiotischcr Wirksamkeit umfaßt. Die Isolierung von Gemischen dieser zwei Verbindungen mit hoher Wirksamkeit soll zuerst beschrieben werden, und dann soll eine Beschreibung der Trennung der zwei Verbindungen folgen. Es sei hervorgehoben, daß ein Gemisch der zwei Verbindungen für therapeutische Zwecke völlig ausreichend ist. Die Bezeichnung »A22S« wird für die Mischung der zwei Verbindungen verwendet, während die Buchstaben »a« und »h« zugefügt werden, um zwischen den zwei einzelnen Verbindungen zu unterscheiden.

Die Aktivität ist sowohl in dem Mycel als auch in der vergorenen Nährlösung vorhanden. A 228 wird zweckmäßig aus der Gärflüssigkeit durch Lösungsmittelextraktion unter Verwendung eines Lösungsmittels (im folgenden als »Extraktionslösungsmittel <? bezeichnet), das wenigstens teilweise nicht mit Wasser mischbar ist und in welchem A 228 löslich ist, extrahiert. Geeignete Extraktionslösungsmittel sind n-Butanol und Chloroform, wobei n-Butanol besser geeignet ist. Die Extraktion kann in einem weiten p_n-Bereich durchgeführt werden. Die besten Ausbeuten werden jedoch beim Neutralwert erzielt.

Wenn die gesamte Gärlösung filtriert wird (durch Kieselgur), kann der wirksame Anteil, der im Rück-

578/159

G 14460 IVa/30 h

stand zurückgehalten wird, durch Waschen mit n-Butanol extrahiert werden. Bei der Verwendung von nitrierter Gärlösung kann im wesentlichen die gesamte A 228-Aktivität mit ι Volumen n-Butanol extrahiert werden, doch haben sich aufeinanderfolgende Extraktionen mit ¹I₆ und ^x/₁₀ Volumen n-Butanol als zweckmäßiger erwiesen.

Ein wirksames und zweckmäßiges Extraktionsverfahren besteht darin, daß die gesamte Gärlösung mit n-Butanol gerührt, durch Kieselgur filtriert und dann die organische Phase von dem wäßrigen Rückstand im Filtrat getrennt wird.

A 228 kann aus dem Extrakt in dem Extraktionslösungsmittel durch Zugabe eines Lösungsmittels (das weiterhin als Fällungslösungsmittel bezeichnet wird), in dem A228 unlöslich ist, das jedoch mit dem Extraktionslösungsmittel mischbar ist, gefällt werden. Geeignete Fällungslösungsmittel sind Äther, z. B. Diäthyläther, Petroläther, Ester, z. B. Äthylacetat und Ketone, z. B. Aceton. Es ist zweckmäßig, den in dem Extraktionslösungsmittel enthaltenen Extrakt durch Destillation unter vermindertem Druck einzuengen, ehe die Fällung durchgeführt wird. Der erhaltene Niederschlag ist gewöhnlich ein feinpulvriger fester Stoff; doch wurden in manchen Fällen gummiartige Stoffe erhalten, die durch Waschen mit einem inerten Lösungsmittel, z. B. wasserfreiem Äther, und anschließendes Trocknen im Vakuum in pulvrige Feststoffe umgewandelt werden können. In einigen Fällen erwies es sich als notwendig, den gummiartigen Stoff nochmals in dem Extraktionslösungsmittel zu lösen und mit einem Fällungslösungsmittel erneut zu fällen. Die auf diese Weise hergestellten hell gelbbraun gefärbten Feststoffe enthielten 150 bis 650 Einheiten/mg.

Ein alternatives Verfahren, das ebenso zweckmäßig und wirksam ist, besteht darin, daß die gesamte Gärlösung mit 1 °/₀ (Gewicht/Volumen) Magnesiumtrisilikat und 2% (Gewicht/Volumen) Kieselgur etwa 15 Minuten lang gerührt wird. Dann wird die Mischung filtriert und das Filtrat, das nun keine A228-Aktivität enthält, verworfen. Das A228 wird aus der festen Masse durch Rühren und Filtrieren zuerst mit Aceton, wobei ¹Z₅ des ursprünglichen Volumens angewendet wird, und dann zweimal mit 8o°/₀igem wäßrigem Aceton (Volumen/Volumen) eluiert.

Die vereinigten wäßrigen Acetoneluate werden unter vermindertem Druck eingedampft, um alles Aceton zu entfernen, wobei die Temperatur unter 35⁰ gehalten wird. Dann wird der wäßrige Rückstand zweimal mit ¹J₃ Volumen n-Butanol extrahiert.

Die Butanolextrakte werden vereinigt und zur Entfernung des gesamten Wassers unter vermindertem Druck eingeengt, bis das Volumen nur noch etwas mehr als ^X/_25U des ursprünglichen Volumens der Gärlösung beträgt. Dieses Konzentrat wird mit 6 Volumen trockenen Äthers versetzt, wobei sich A 228 als ein gelbbraungefärbter fester Stoff abscheidet.

Reinigung

Eine weitgehende Reinigung kann mit Gegenstromverteilungsverfahren erzielt werden, z. B. mittels einer Gegenstromverteilung zwischen Wasser und n-Butanoldiäthyläther (1: 1,75 Volumen/Volumen) nach Craig [vgl. Gregory & Craig, Ann. N. Y. Acad. of. Sei., 53, 1115 (1951)]. Wenn feste Stoffe mit einer Reinheit von etwa 400 Einheiten der antibiotischen A 228-Aktivität je mg als Ausgangsmaterialien verwendet werden, können in der organischen Phase Fraktionen erhalten werden, die Wirksamkeiten von 700 bis 800 Einheiten/mg aufweisen. Die erhaltenen Verteilungskurven zeigen das Vorhandensein von mehr als einem aktiven Bestandteil bei einigen der rohen erfindungsgemäßen Präparate an.

Es wurde festgestellt, daß das zufriedenstellendste Verfahren zur Trennung von A 228 in A 228 a und A 228 b in einer gegenläufigen Phasentrennungschromatographie besteht. Es wurde nach den Angaben von S. M. Partridge und T. Swain [Nature, 166, 272 (1950)] gearbeitet. Die Trennung findet an einer Säule von »Allopren« (chlorierter Kautschuk) statt, das etwa 40% Volumen/Gewicht an n-Butanol enthält und wobei das durchfließende Lösungsmittelsystem mit n-Butanol gesättigtes Wasser ist. Auf diese Weise wurden 10 g der rohen antibiotischen A 228-Mischung, die in mit n-Butanol gesättigtem Wasser gelöst waren, durch eine Alloprensäule hindurchgeleitet, die 50 g Allopren und 20 g n-Butanol enthielt und wie in der genannten Literaturstelle bereitet war. Die Entwicklung wurde mittels mit n-Butanol gesättigtem Wasser fortgesetzt und die Filtratanteile in regelmäßigen Intervallen aufgefangen. Die ersten Fraktionen enthielten einigeunwirksame Vereunreinigungen, dann wurden zwei verschiedene aktive Fraktionen aufgefangen. Die erste antibiotische Fraktion, die aus der Säule austrat, ist das Antibioticum A 228 a und die zweite A228b. Die Wirksamkeiten dieser Fraktionen variieren zwischen 600 bis 2000 Einheiten/mg Gewicht.

Claims

PATENTANSPRUCH:

Die Verwendung der Streptomyces-Art Ds 41 zur Herstellung des Antibioticums A228 durch aerobe, submerse Züchtung in üblichen Nährflüssigkeiten unter Zusatz von wachstumsfördernden Stoffen und Gewinnung des Antibioticums durch Extraktion und Reinigung in bekannter Weise.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

© 509 578/159 10.55