DE1643818C3 - Antifungales Antibiotikum der Summenformel C H|g O3 und Verfahren zu seiner fermentativen Herstellung - Google Patents

Description

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Gegenstand der Erfindung ist ein antifungales Antibiotikum, welches die folgenden chemischen und physikalisch-chemischen Merkmale aufweist: farbloser thermostabiler kristalliner Stoff neutralen Charakters mit der Elementarzusammensetzung 73,92% Kohlen- (>o stoff, 7,26% Wasserstoff, 18,82% Sauerstoff, Summenformel CIbHi₈O₃, Molekulargewicht 258, optische Drehung («'->] 3,3° (c=10, im Benzol bei 546 ΐημ), Schmelzpunkt 51 bis 53°C, löslich in der Mehrzahl der organischen Lösungsmittel, schwach löslich in Wasser, fts UV-Absorptionsspektrum: max.:

209; 223; 228; 235,5; 292; 299 und 310,5 mn (in Methanol)

IR-AbsorDtionsspektrum: max.:

697-695· 739· 752; 768; 841; 885; 892; 925; 971; 997;

1000· loio; 1033; 1075; 1117; 1146; 1192; 1242; 1265;

1283Ϊ 1294; 1397; 1437; 1495; 1576; 1623; 1646; 1704 und 1713 cm '(K-Br);

wobei den spektrographischen Daten zu entnehmen .st, daß das Antibiotikummolekül eine Methylgruppe, zwei Methoxygruppen.eine Ketogruppe (1713 cm '), jedoch keine freie Hydroxylgruppe enthält

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung dieses antifungalen Antibiotikums durch Kultivierung einer Reinkultur von Basidiomycete Oudemans.ella mucida (Schrad. ex Fr/Höhn) welche durch übliche Kultivierung des Naturkörpers mit Agar-Nährböden gewonnen wird bei einer Temperatur von 15 bis 30⁰C und einem pH-Wert von 3 bis / in einem flüssigen Nährboden, der übliche assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und Mineralsalze enthält, das dadurch gekennze.chnet ,st, daß man die myceliumhaltige fermentierte Kulturbrche bei einer Temperatur bis 6O⁰C mit Butylacetat, Chloroform Trichloräthylen, Diäthyläther oder das von der Kukurbrühe abgetrennte Mycel mit Methanol extrahiert den rohen antibiotikumhaltigen Extrakt unter vermindertem Druck einengt und durch Adsorption an Aluminiumoxid oder Silikagel von Ballaststoffen reinigt und aus der gereinigten Lösung das Antibiotikum nach nochmaligem Einengen in reiner Form durch präparative Chromatographie auf Aluminiumoxid oder Silikagel mit Petroläther, Benzol, Diäthyläther oder Chloroform oder deren Gemischen als Lösungsmittel oder durch Hochvakuum-Destillation und anschließende Kristallisation gewinnt.

In der Veröffentlichung von T. K orzy bsk 1 und W Kurylowicz, Antibiotika 1961, Seite 933 (Hirsulinsäure), Seite 934 (Thermophyllin) und Seiten 947 und 948 (Ramealin) wird die Extraktion von aus Basidiomyceten gewonnenen Antibiotika mittels Extraktion (Amylacetat, Chloroform, Benzol). Abdampfen des Lösungsmittels und nachfolgende chromatographische Trennung an Aluminiumoxid bzw. Magnesiumsilikat beschrieben.

In »Chemical Abstracts«, 1946 bis 1966, sind etwa 340 Verbindungen der Summenformel CIbHi₈O₃ beschrieben worden. Die Strukturmerkmale des erfindungsgemäßen Antibiotikums gestatten jedoch eine Abgrenzung gegenüber diesen bekannten Verbindungen. Unter diesen Verbindungen besitzt zwar eine Verbindung, nämlich 2-Acetyl-l,8-dimethoxy-3,6-dimethylnaphthalin, (vgl. z.B. J. Chem. Soc, 1962, Seite 3756) zwei Methoxygruppen, Methylgruppen und eine Ketogruppe, jedoch keine Hydroxylgruppe.

Demgegenüber enthält die erfindungsgemäße Substanz nur eine einzige Methylgruppe, während die bekannte Verbindung insgesamt drei Methylgruppen enthält, nämlich zwei in 3- und 6-Stellung des Kerns und eine dritte in der Acetylgruppe. Eine weitere Unterscheidung ergibt sich daraus, daß das erfindungsgemäße Antibiotikum kein aromatisches System darstellt, wa< sich daraus ergibt, daß eine aromatisch-gebundene Acetylgruppe sich im IR-Spektrum durch ein Absorp tionsmaximum zwischen 1680 und 1690 cm' anzeiger müßte. Die !R-Spektren der erfindungsgemäßen Sub stanz zei,gen jedoch einen solchen Peak nicht. Auch lieg der Schmelzpunkt der bekannten Verbindung nahezi doppelt üo hoch wie derjenige der erfindungsgemäßer Verbindung, was keinesfalls bloß auf eine höher« Reinheit zurückzuführen sein kann.

Die Chromatographie-Stufe des Verfahrens kann in • fächer Weise durch Beobachtung einer Flüssigkeits^elle eventuell der Eluate, in ultraviolettem Licht ^Sa rf öl pt werden. Der wirksame Stoff weist im I Unterschied zu den unwirksamen Begleitstoffen eine ifische, junkie Fluoreszenz (Verlöschen) auf. Eine Kontrolle der Chromatographie kann sehr leicht durch Dünnschichtchromatographie mit Detektion in ultravio-I nem Licht mit ammoniakalischem Silbe: nitrat durchgeführt werden, was eine dunkle Reduktionszone ergibt. Die chromatographische Reinigung kann gegebenenfalls wiederholt werden. Falls die Chromatographie gut durchgeführt und der wirksame Stoff von den Ballaststoffen getrennt wurde, kann die entsprechende Fraktion bei vorsichtiger Verdampfung des Lösungsmittels zu kristallinem Antibiotikum verarbeitet werden.

Bei genügend gutem Vakuum kann das Rohkonzentrat ohne Verlust der biologischen Wirksamkeit destilliert werden. Bei einem Druck von 0,01 bis 0005 mm Hg kann man ca. 75% des Rohkonzentrates destillieren. Nach allfälliger Redestillation kann das gewonnene Destillat unmittelbar durch Einimpfen mit reinem Antibiotikum kristallisiert werden.

Inder

Fig. 1 ist ein Ultravioleu-Spektrum des reinen Antibiotikums in Methylalkohol dargestellt.

Fig 2 zeigt ein Spektrum des reinen Antibiotikums bei infraroter Bestrahlung in KBr.

Fig.3 zeigt ein Chromatogramm eines eingedickten Rohextraktes des abgefilterten Myzeliums auf einer dünnen Schicht Aluminiumoxid im System Petroläther-Äther-Essigsäure 90:10:1. In Fig. 3a bedeutet 1 = Start, 2 = Lösungsmittelfront, 3 = wirksamer Stoff. In Fig.3b: 1 = Start, 2 = Lösungsmittelfront, 3 = Dämpfungszone bei Autobiographie von Sacharomycescerevisiae.

Das Antibiotikum ist wirksam gegen zahlreiche Pilzarten, einschließlich Dermatophyten, von Phytomycetes über Fungi imperfecti bis Ascomycetes, ist aber völlig unwirksam gegen Bakterien. Die antifungale Wirkung des erfindungsgemäßen Antibiotikums ist in der umstehenden Tabelle anhand von Testergebnissen dargestellt.

Die Tests wurden wie folgt durchgeführt: Filterpapierscheiben vom Durchmesser 6 mm wurden mit verschieden verdünnten Lösungen des Antibiotikums in einem Gemisch von Äthylalkohol - Äther (1 :1) getränkt und nach Verdampfung des Lösungsmittels auf die Oberfläche eines Agar-Nährbodens gelegt, dem entsprechende Test-Mikroorganismen eingeimpft worden waren. Nach der Inkubation bei entsprechender Temperatur wurde das Vorkommen von Inhibitionszonen festgestellt. .

Die Toxizität bei intraperitonealer Applikation von io/o wässeriger Suspension ist bei Mäusen 250 mg/kg Gewicht, bei Verabreichung von 500 mg/kg per os.

Nach intramuskulärer und oberflächlicher Applikation bei Kaninchen wurde keine Aufnahme des Antibiotikums in den Blutkreislauf festgestellt. Eine Blutentnahme in der 2. und 5. Stunde nach Applikation des Antibiotikums durch Kardialpunktion wies nicht einmal Spuren antibiotischer Wirkung im Serum auf. Das Testen wurde mittels Agar-Diffusionstechnik mit Test-Mikroben Saccharomyces serrvisias So-2/V durchgeführt.

Bei Applikation auf der Haut und in das Bindegewebe von Kaninchen zeigte das Antibiotikum keinerlei Reizwirkung.

Das Antibiotikum ist aufgrund seiner Eigenschaften für Oberflächenapplikation am besten in Form von Salben, in zerstäubter Form oder in alkoholischer Lösung verwendbar.

Tabelle

Antifungale Wirkung des reinen Antibiotikumpräparates

Mikroorganismen

Minimale lnhibiüonskonzeniration des Antibiotikums bei Testen mittels Agar-Diffusionstechnik

Candida albicans

Candida tropicalis

Candida pseudotropicalis

Candida parapsilopsia
^o Candida zeilano

Candida guillermondi

Candida crusei

Aspergillus niger

Aspergillus oryzae
Aspergillus fumigatus

Penicillium sp.

Mucor sp.

Saccharomyces cerevisiae Geotrichum sp.
Trichophyton rubrum

Trichophyton mentagrophytes Trichophyton astero

Trichophyton rosaceum Microsporum canis
Sporotrichum schenkii Coccidioides immitis
Blastomyces dermatitis Torula utilis

10

10

10

10

10

10

10

10

10

10

100

100

300 100 10 100 300 200 100 100 100

Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Beispielen näher erläutert.

Hierbei betreffen die Beispiele 1 — 5 die Zubereitung des Konzentrats, die Beispiele 6—8 die Gewinnung des reinen Stoffes.

Beispiel 1

2400 1 filtrierte Kulturbrühe wurden ohne pH-Aufbereitung mit Butylacetat auf einem Gegenstromcxtraktor im Verhältnis 1 :5 extrahiert und der gewonnene reine Extrakt auf einem Filmverdampfer bei einer maximalen Temperatur von 60° C auf ein Volumen von ca. 40 Litern eingedickt. Die weitere Verarbeitung wurde durch Verdampfen des Lösungsmittelrestes auf einem Rota-55 tions-Vakuumverdampfer durchgeführt. Insgesamt wurden 670 g rohen öligen Antibiotikum-Konzentrats gewonnen.

Beispiel 2

60 Durch Filtrieren von 2400 Litern fermentierten Nährmediums auf einem Rotationsfilter wurden insgesamt 121 kg feuchten Myzeliums gewonnen, das in einem Vakuumtrockner bei einer maximalen Temperatur von 55°C getrocknet wurde. Erhalten wurden ''S 23,5 kg trockenes Myzelium. Dieses wurde fein zermahlen und 5mal durch Verrühren mit 35 Litern Chloroform 1 Stunde lang extrahiert und anschließend filtriert. Die vereinigen Chloroformextrakte wurden auf einem

gläsernen Umlaufverdampfer bei einer maximalen Temperatur von 30⁰C verdampft und der Rest des Lösungsmittels auf einem gläsernen Rotationsverdampfer verdampft. Die Ausbeute waren 2136 g rohes öliges Konzentrat des antibiotisch wirksamen Stoffes. Wirkungsgrad 448 000 Einh./g.

Beispiel 3

10 kg feuchten Myzeliums wurden mit Trichlorethylen übergössen, und das Wasser unter ständigem Rühren, bei Rückleitung des organischen Anteils des Destillats, azeotropisch abdestilliert. Nach dem Trocknen wurde die Extraktion des entwässerten Myzeliums mit Trichloräthylen wiederholt durchgeführt, ähnlich wie im vorhergehenden Beispiel. Durch Eindicken in Vakuum auf einem Umlaufrotationsverdampfer wurden 107,2 g rohen, öligen Konzentrats gewonnen.

Beispiel 4

8,5 kg durch Lyophilisation getrocknetes Myzelium wurden im Soxhlet-Apparat mit Äther extrahiert (ungefähr 6- bis 7facher Wechsel des Lösungsmittels im Extraktionsteil des Apparates). Nach Abdeslillieren des Äthers wurden 1050 g öligen Rohkonzentrats gewonnen.

Beispiel 5

11,2 kg feuchten, durch Filtration fermentierten Nährmediums gewonnenes Myzelium wurden in 25 1 Methanol suspendiert, unter Rühren auf 40⁰C erwärmt und abgesaugt. Das abgesaugte Myzelium wurde in weiteren 25 1 Methanol neuerlich suspendiert, erwärmt, gefiltert und der Vorgang noch zweimal wiederholt. Die vereinigten Methanolfiltrate wurden auf einem Vakuum-Umlaufverdampfer eingedickt, und der Rest, der sich in zwei Schichten teilte, wurde mit 2 χ 20 Liter Petroläther extrahiert. Durch Separation der Pctrolätherschich* und Abdestillieren des Lösungsmittels wurden 113,5 g öligen Antibiotikum-Konzentrats gewonnen.

Beispiel 6

Auf eine Säule von 1,7 kg in Petroläther aufgetragenem Aluminiumoxyd (akt-Il), 64 χ 6 cm, wurde 160 g öliges Konzentrat in 500 ml Petroläther eingebracht. Nach Einsickern in die Säule wurde mit 3000 ml Petroläther entwickelt. Dadurch wurde eine genügende Abscheidung des antibiotisch wirksamen Stoffes von den begleitenden Metabol'iten erreicht, von denen ein Teil bereits in das Eluat (blau und violett fluoreszierende Stoffe) übergegangen war. Der Nachweis der einzelnen Zonen wurde in ultraviolettem Licht durchgeführt. Der wirksame Stoff bildete in der Mitte der Säule eine 30 cm hohe Schicht. Nach Verdrängung des Absorbcntcn aus der Säule wurde diese Schicht mechanisch separiert und nach dem Trocknen mit 3 Liter Chloroform eluicrt. Durch Eindicken des Extraktes wurden 32,5 g eines bei niedrigen Temperaturen sehr viskosen hellgelben Öles mit einer Wirksamkeit von 4 325 000 E/g gewonnen.

Durch Kontroll-Chromatographie auf einer dünnen Schicht in Silikagel wurde in einem System Petroläther-Äther-Essigsäure 90 : 10 : 1 im gewonnenen Antibiotikum noch das Vorhandensein geringfügiger Mengen von Begleitstoffen festgestellt. Durch Einimpfen mit Kristallen reinen Antibiotikums wurde nach ca. 3 Tagen das so erhaltene öl auskristallisiert. Nach Übergießen mit abgekühltem Petroläther, Absaugen und Auswaschen, gleichfalls mit abgekühltem Petroläther, und Trocknen in Vakuum wurde farbloses, kristallines Antibiotikum mit einem Schmelzpunkt von 49—51°C gewonnen.

Beispiel 7

Zu dem gleichen Ergebnis wie in Beispiel 6 kann man

durch Verwendung von Silikagel als Adsorbenten und Entwicklung mittels eines Gemisches Petroläther-Äther 9:1 bei einem Verhältnis des Adsorbenten zum Antibiotikum 20 :1 gelangen.

Beispiel 8

500 g öliges, durch Extraktion gewonnenes Konzentrat wurde bei einem Druck von 0,01 mm Hg im Kragenkolben (Hickmannskoben) destilliert bei Erwärmung in einem Wood-Metall-Bad. In einem Temperaturbereich von 70 bis 187°C destillierte insgesamt 231 g

-¹⁰ reinen, gelben Öles. Der antibiotisch wirksame Stoff häufte sich in einer Fraktion von 120 bis 140⁰C. Die weitere Destillation mußte wegen fortschreitender Zersetzung des Restes im Destillationskolben unterbrochen werden. Die gewonnene Fraktion wirksamen

Stoffes enthielt gemäß der in gleicher Weise wie in Beispiel 6 durchgeführten chromatographischen Kontrolle noch eine geringe Menge verschiedener Stoffe. Durch wiederholte Hochvakuum-Destillation und Auffangen der Fraktion von 128 bis 132°C wurde ein klares

hellgelbes Destillat praktisch reinen Antibiotikums gewonnen, das nur Spuren blau fluoreszierender Stoffe enthält. Ausbeute 54 g.

Beispiel 9

Herstellung der Produktionskultur

Aus dem Naturkörper der Basidiomycetc Oudemansiella mucida (Schrad. ex Fr.) Höhn wird mit sterilem Skalpell ein Stück vom Mycclgewebe explanticrt, in das Probierglas mit schräger Agar-Würze übertragen und bei 20 bis 25°C inkubiert. Die aufgewachsene Mycelkultür wird weiter in Probiergläser mit schräger Agar-Würze geimpft. Nach 10 Tagen Wachstum werden die Kulturen im Kühlschrank bei +4⁰C aufbewahrt und im Bedarfsfalle für die Impfung des Inokulationskolbcns oder für weitere Nachimpfung auf festen Agar-Nährbodcn benutzt.

I lici/u .1 HIaII

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Antifungales Antibiotikum, welches folgende chemische und physikalisch-chemische Merkmale aufweist: farbloser thermostabiler k .!liner Stoff neutralen Charakters mit der Elernen.^zusammensetzung 73,92% Kohlenstoff, 7,26% Wasserstoff, !8,82% Sauerstoff, Summenformel CbHi₈Oi, Molekulargewicht 258, optische Drehung [tx^[i] 3,3° (c= 10, im Benzol bei 546 ΐημ), Schmelzpunkt 51 bis 53^UC, löslich in der Mehrzahl der organischen Lösungsmittel, schwach löslich in Wasser,
UV-Absorptionsspektrum: max.:

209; 223; 228; 235,5; 292; 299 und 310,5 mn (in

Methanol)
IR-Absorptionsspektrum: max.:

691; 695; 739; 752; 768; 841; 885; 892; 925; 971; 997; 1000; JOJO; 1033; 1075; 1117; 1146; 1192; 1242; 1265; 1283; 1294; 1397; 1437; 1495; 1576;

1623; 1646; 1704 und 1713 cm '(KBr); wobei den spektrographischen Daten zu entnehmen ist, daß das Antibiotikummolekül eine Methylgruppe, zwei Methoxygrupper., eine Ketogruppe (1713 cm" '), jedoch keine freie Hydroxylgruppe enthält.

2. Verfahren zur fermentativen Herstellung eines antifungalen Antibiotikums gemäß Anspruch 1 durch Kultivierung einer Reinkultur von Basidiomycete Oudemansiella mucida (Schrad. ex Fr./Höhn.), welche durch übliche Kultivierung des Naturkörpers mit Agar-Nährböden gewonnen wird, bei einer Temperatur von 15 bis 30⁰C und einem ph-Wert von 3 bis 7 in einem flüssigen Nährboden, der übliche assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und Mineralsalze enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man die myceliumhaltige fermentierte Kulturbrühe bei einer Temperatur bis 60° C mit Butylacetat, Chloroform, Trichlorethylen, Diäthyläther oder das von der Kulturbrühe abgetrennte Mycel mit Methanol extrahiert, den rohen, antibiotikumhaltigen Extrakt unter vermindertem Druck einengt und durch Adsorption an Aluminiumoxid oder Silikagel von Ballaststoffen reinigt und aus der gereinigten Lösung das Antibiotikum nach nochmaligem Einengen in reiner Form durch präparative Chromatographie auf Aluminiumoxid oder Silikagel mit Petroläther, Benzol, Diäthyläther oder Chloroform oder deren Gemischen als Lösungsmittel oder durch Hochvakuum-Destillation und anschließende Kristallisation gewinnt.